इम्युनोमोड्युलेटरी मेटाबोलाइटहरू ट्युमर माइक्रोइनभाइरन्मेन्ट (TME) को एक प्रमुख विशेषता हुन्, तर केही अपवादहरू बाहेक, तिनीहरूको पहिचान धेरै हदसम्म अज्ञात रहन्छ। यहाँ, हामीले यी विभिन्न TME कम्पार्टमेन्टहरूको मेटाबोलोम प्रकट गर्न उच्च-ग्रेड सेरस कार्सिनोमा (HGSC) भएका बिरामीहरूको ट्युमर र जलोदरबाट ट्युमर र T कोशिकाहरूको विश्लेषण गर्यौं। जलोदर र ट्युमर कोशिकाहरूमा व्यापक मेटाबोलाइट भिन्नताहरू हुन्छन्। जलोदरको तुलनामा, ट्युमर-घुसपैठ गर्ने T कोशिकाहरू 1-मिथाइलनिकोटिनामाइड (MNA) मा उल्लेखनीय रूपमा समृद्ध हुन्छन्। T कोशिकाहरूमा MNA को स्तर बढेको भए तापनि, निकोटिनामाइड N-मिथाइलट्रान्सफेरेज (S-एडेनोसिलमेथियोनिनबाट निकोटिनामाइडमा मिथाइल समूहहरूको स्थानान्तरणलाई उत्प्रेरित गर्ने इन्जाइम) को अभिव्यक्ति फाइब्रोब्लास्ट र ट्युमर कोशिकाहरूमा सीमित छ। कार्यात्मक रूपमा, MNA ले ट्युमर-प्रवर्द्धन गर्ने साइटोकाइन ट्युमर नेक्रोसिस कारक अल्फा स्राव गर्न T कोशिकाहरूलाई प्रेरित गर्दछ। त्यसकारण, TME-व्युत्पन्न MNA ले T कोशिकाहरूको प्रतिरक्षा नियमनमा योगदान पुर्‍याउँछ र मानव क्यान्सरको उपचारको लागि सम्भावित इम्युनोथेरापी लक्ष्यलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ।
ट्यूमरबाट व्युत्पन्न मेटाबोलाइटहरूले ट्यूमर-विरोधी प्रतिरक्षामा गहिरो निरोधात्मक प्रभाव पार्न सक्छन्, र अधिक र अधिक प्रमाणहरूले देखाउँछन् कि तिनीहरूले रोग प्रगतिको लागि प्रमुख चालक शक्तिको रूपमा पनि काम गर्न सक्छन् (१)। वारबर्ग प्रभावको अतिरिक्त, हालैको कामले ट्यूमर कोशिकाहरूको मेटाबोलिक अवस्था र ट्यूमर माइक्रोइनभाइरमेन्ट (TME) को प्रतिरक्षा अवस्थासँगको यसको सम्बन्धलाई चित्रण गर्न थालेको छ। माउस मोडेलहरू र मानव T कोशिकाहरूमा गरिएको अध्ययनले देखाएको छ कि ग्लुटामाइन मेटाबोलिज्म (२), अक्सिडेटिभ मेटाबोलिज्म (३) र ग्लुकोज मेटाबोलिज्म (४) ले विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिका उपसमूहहरूमा स्वतन्त्र रूपमा कार्य गर्न सक्छ। यी मार्गहरूमा धेरै मेटाबोलाइटहरूले T कोशिकाहरूको एन्टी-ट्यूमर कार्यलाई रोक्छ। यो प्रमाणित भएको छ कि कोएन्जाइम टेट्राहाइड्रोबायोप्टेरिन (BH4) को अवरोधले T कोशिकाहरूको प्रसारलाई क्षति पुर्‍याउन सक्छ, र शरीरमा BH4 को वृद्धिले CD4 र CD8 द्वारा मध्यस्थता गरिएको एन्टी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियालाई बढाउन सक्छ। थप रूपमा, BH4 (5) को प्रशासनद्वारा काइनुरेनिनको इम्युनोसप्रेसिव प्रभावलाई बचाउन सकिन्छ। आइसोसाइट्रेट डिहाइड्रोजनेज (IDH) उत्परिवर्ती ग्लियोब्लास्टोमामा, एन्टियोमेटाबोलिक (R)-2-हाइड्रोक्सीग्लुटारेट (R-2-HG) को स्रावले T कोष सक्रियता, प्रसार र साइटोलिसिस गतिविधिलाई रोक्छ (6)। हालै, यो देखाइएको छ कि ग्लाइकोलिसिसको उप-उत्पादन, मिथाइलग्लाइक्सल, माइलोइड उत्पत्तिको दमनकारी कोषहरू द्वारा उत्पादन गरिन्छ, र मिथाइलग्लाइक्सलको T कोष स्थानान्तरणले प्रभावकारी T कोष कार्यलाई रोक्न सक्छ। उपचारमा, मिथाइलग्लाइक्सलको तटस्थीकरणले माइलोइड-व्युत्पन्न दमनकारी कोषहरू (MDSC) को गतिविधिलाई जित्न सक्छ र माउस मोडेलहरूमा चेकपॉइन्ट ब्लकडेड थेरापीलाई synergistically बढाउन सक्छ (7)। यी अध्ययनहरूले सामूहिक रूपमा T कोष कार्य र गतिविधिलाई नियमन गर्न TME-व्युत्पन्न मेटाबोलाइटहरूको प्रमुख भूमिकालाई जोड दिन्छ।
डिम्बग्रंथि क्यान्सरमा टी सेल डिसफंक्शन व्यापक रूपमा रिपोर्ट गरिएको छ (8)। ​​यो आंशिक रूपमा हाइपोक्सिया र असामान्य ट्यूमर भास्कुलचर (9) मा निहित मेटाबोलिक विशेषताहरूको कारणले हो, जसले ग्लुकोज र ट्रिप्टोफानलाई ल्याक्टिक एसिड र काइनुरेनिन जस्ता उप-उत्पादनहरूमा रूपान्तरण गर्दछ। अत्यधिक बाह्य कोशिकीय ल्याक्टेटले इन्टरफेरोन-γ (IFN-γ) को उत्पादन घटाउँछ र माइलोसप्रेसिभ उपसमूहहरूको भिन्नतालाई बढाउँछ (10, 11)। ट्रिप्टोफानको खपतले प्रत्यक्ष रूपमा टी सेल प्रसारलाई रोक्छ र टी सेल रिसेप्टर सिग्नलिङलाई रोक्छ (12-14)। यी अवलोकनहरूको बावजुद, प्रतिरक्षा चयापचय वरिपरि धेरै काम इन भिट्रो टी सेल संस्कृतिमा अनुकूलित मिडिया प्रयोग गरेर गरिएको थियो, वा भिभोमा होमोलोगस माउस मोडेलहरूमा सीमित थियो, जसमध्ये कुनै पनि पूर्ण रूपमा मानव क्यान्सर र शारीरिक म्याक्रो र माइक्रो वातावरणको विषमता प्रतिबिम्बित गर्दैन।
डिम्बग्रंथि क्यान्सरको एक सामान्य विशेषता पेरिटोनियल फैलावट र जलोदरको उपस्थिति हो। जलोदरमा कोशिका तरल पदार्थको संचय उन्नत रोग र खराब रोगनिदानसँग सम्बन्धित छ (१५)। रिपोर्टहरू अनुसार, यो अद्वितीय डिब्बा हाइपोक्सिक छ, यसमा भास्कुलर एन्डोथेलियल ग्रोथ फ्याक्टर (VEGF) र इन्डोलेमाइन २,३-डाइअक्सिजेनेज (IDO) को उच्च स्तर छ, र T नियामक कोशिकाहरू र माइलॉइड इनहिबिटर कोशिकाहरू (१५-१८) द्वारा घुसपैठ गरिएको छ। जलोदरको मेटाबोलिक वातावरण ट्यूमरको भन्दा फरक हुन सक्छ, त्यसैले पेरिटोनियल स्पेसमा T कोशिकाहरूको पुन: प्रोग्रामिंग अस्पष्ट छ। थप रूपमा, ट्यूमर वातावरणमा उपस्थित जलोदर र मेटाबोलाइटहरू बीचको मुख्य भिन्नता र विषमताले प्रतिरक्षा कोशिकाहरूको घुसपैठ र ट्यूमरहरूमा तिनीहरूको कार्यलाई बाधा पुर्‍याउन सक्छ, र थप अनुसन्धान आवश्यक छ।
यी समस्याहरू समाधान गर्न, हामीले विभिन्न कोशिका प्रकारहरू (CD4 + र CD8 + T कोशिकाहरू सहित) साथै ट्यूमर भित्र र बीचमा अध्ययन गर्न संवेदनशील कोशिका विभाजन र तरल क्रोमेटोग्राफी ट्यान्डम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS/MS) विधि डिजाइन गर्यौं। यसको मेटाबोलाइटहरू बिरामीको समान जलोदर र ट्यूमर वातावरणमा कोशिकाहरू फैलाउँछन्। हामी यी प्रमुख जनसंख्याहरूको मेटाबोलिक स्थितिको उच्च समाधान गरिएको चित्र प्रदान गर्न उच्च-आयामी प्रवाह साइटोमेट्री र एकल-कोशिका RNA अनुक्रमण (scRNA-seq) सँग संयोजनमा यो विधि प्रयोग गर्छौं। यो विधिले ट्यूमर T कोशिकाहरूमा 1-मिथाइलनिकोटिनामाइड (MNA) को स्तरमा उल्लेखनीय वृद्धि प्रकट गर्‍यो, र इन भिट्रो प्रयोगहरूले देखाए कि T कोशिका प्रकार्यमा MNA को इम्युनोमोड्युलेटरी प्रभाव पहिले अज्ञात थियो। सामान्यतया, यो विधिले ट्यूमर र प्रतिरक्षा कोशिकाहरू बीचको पारस्परिक चयापचय अन्तरक्रियाहरू प्रकट गर्दछ, र प्रतिरक्षा नियमन मेटाबोलाइटहरूमा अद्वितीय अन्तर्दृष्टि प्रदान गर्दछ, जुन T कोशिका-आधारित डिम्बग्रंथि क्यान्सर इम्युनोथेरापी उपचार अवसरहरूको उपचारको लागि उपयोगी हुन सक्छ।
हामीले ग्लुकोज अपटेक [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) र माइटोकोन्ड्रियल गतिविधि [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) एकैसाथ मापन गर्न उच्च-आयामी प्रवाह साइटोमेट्री प्रयोग गर्यौं जसले प्रतिरक्षा कोषहरू र ट्यूमर कोष जनसंख्यालाई छुट्याउने विशिष्ट मार्करहरू हुन् (तालिका S2 र चित्र S1A)। यो विश्लेषणले देखाएको छ कि T कोषहरूको तुलनामा, जलोदर र ट्यूमर कोषहरूमा उच्च ग्लुकोज अपटेक स्तर हुन्छ, तर माइटोकोन्ड्रियल गतिविधिमा कम भिन्नता हुन्छ। ट्यूमर कोषहरूको औसत ग्लुकोज अपटेक [CD45-EpCAM (EpCAM)+] T कोषहरूको भन्दा तीन देखि चार गुणा हुन्छ, र CD4 + T कोषहरूको औसत ग्लुकोज अपटेक CD8 + T कोषहरूको भन्दा १.२ गुणा हुन्छ, जसले संकेत गर्दछ कि ट्यूमर घुसपैठ गर्ने लिम्फोसाइट्स (TIL) को एउटै TME (चित्र 1A) मा पनि फरक मेटाबोलिक आवश्यकताहरू हुन्छन्। यसको विपरीत, ट्यूमर कोषहरूमा माइटोकोन्ड्रियल गतिविधि CD4 + T कोषहरू जस्तै छ, र दुवै कोष प्रकारहरूको माइटोकोन्ड्रियल गतिविधि CD8 + T कोषहरू भन्दा बढी छ (चित्र 1B)। सामान्यतया, यी परिणामहरूले मेटाबोलिक स्तर प्रकट गर्दछ। ट्यूमर कोषहरूको मेटाबोलिक गतिविधि CD4 + T कोषहरूको भन्दा बढी छ, र CD4 + T कोषहरूको मेटाबोलिक गतिविधि CD8 + T कोषहरूको भन्दा बढी छ। कोष प्रकारहरूमा यी प्रभावहरूको बावजुद, ट्यूमरको तुलनामा CD4 + र CD8 + T कोषहरूको मेटाबोलिक स्थिति वा जलोदरमा तिनीहरूको सापेक्षिक अनुपातमा कुनै सुसंगत भिन्नता छैन (चित्र 1C)। यसको विपरीत, CD45-कोष अंशमा, जलोदरको तुलनामा ट्यूमरमा EpCAM+ कोषहरूको अनुपात बढ्यो (चित्र 1D)। हामीले EpCAM+ र EpCAM- कोष घटकहरू बीच स्पष्ट मेटाबोलिक भिन्नता पनि देख्यौं। EpCAM+ (ट्यूमर) कोषहरूमा EpCAM- कोषहरू भन्दा उच्च ग्लुकोज अपटेक र माइटोकोन्ड्रियल गतिविधि हुन्छ, जुन TME मा ट्यूमर कोषहरूमा फाइब्रोब्लास्टहरूको मेटाबोलिक गतिविधि भन्दा धेरै उच्च हुन्छ (चित्र १, E र F)।
(A र B) ग्लुकोज अपटेकको मध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) (2-NBDG) (A) र CD4 + T कोषहरूको माइटोकोन्ड्रियल गतिविधि (MitoTracker गाढा रातो) (B) प्रतिनिधि ग्राफ (बायाँ) र तालिकाबद्ध डेटा (दायाँ), जलोदर र ट्यूमरबाट CD8 + T कोषहरू र EpCAM + CD45-ट्यूमर कोषहरू। (C) जलोदर र ट्यूमरमा CD4 + र CD8 + कोषहरू (CD3 + T कोषहरूको) अनुपात। (D) जलोदर र ट्यूमरमा EpCAM + ट्यूमर कोषहरूको अनुपात (CD45−)। (E र F) EpCAM + CD45-ट्यूमर र EpCAM-CD45-म्याट्रिक्स ग्लुकोज अपटेक (2-NBDG) (E) र माइटोकोन्ड्रियल गतिविधि (MitoTracker गाढा रातो) (F) प्रतिनिधि ग्राफ (बायाँ) र तालिकाबद्ध डेटा (दायाँ) जलोदर र ट्यूमर कोषहरू। (G) प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा CD25, CD137 र PD1 अभिव्यक्तिको प्रतिनिधि ग्राफहरू। (H र I) CD4 + T कोषहरू (H) र CD8 + T कोषहरू (I) मा CD25, CD137 र PD1 अभिव्यक्ति। (J र K) CCR7 र CD45RO को अभिव्यक्तिमा आधारित भोली, केन्द्रीय मेमोरी (Tcm), प्रभावक (Teff) र प्रभावक मेमोरी (Tem) फेनोटाइपहरू। जलोदर र ट्यूमरहरूमा CD4 + T कोषहरू (J) र CD8 + T कोषहरू (K) को प्रतिनिधि छविहरू (बायाँ) र तालिका डेटा (दायाँ)। जोडी t-परीक्षण (*P<0.05, **P<0.01 र ***P<0.001) द्वारा निर्धारण गरिएको P मानहरू। रेखाले मिल्दो बिरामीहरूलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ (n = 6)। FMO, प्रतिदीप्ति शून्य एक; MFI, मध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता।
थप विश्लेषणले अत्यधिक समाधान गरिएको T सेल फेनोटाइपिक स्थिति बीच अन्य महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू प्रकट गर्‍यो। ट्युमरहरूमा सक्रिय (चित्र १, G देखि I) र प्रभावक मेमोरी (चित्र १, J र K) जलोदर (CD3 + T कोषहरूको अनुपात) भन्दा धेरै बारम्बार हुन्छन्। त्यस्तै गरी, सक्रियता मार्करहरू (CD25 र CD137) र डिप्लेशन मार्करहरू [प्रोग्राम गरिएको सेल डेथ प्रोटीन १ (PD1)] को अभिव्यक्तिद्वारा फेनोटाइपको विश्लेषण गर्दा देखा पर्‍यो कि यद्यपि यी जनसंख्याहरूको मेटाबोलिक विशेषताहरू फरक छन् (चित्र S1, B देखि E), तर भोला, प्रभावक वा मेमोरी सबसेटहरू (चित्र S1, F देखि I) बीच कुनै महत्त्वपूर्ण मेटाबोलिक भिन्नताहरू निरन्तर रूपमा अवलोकन गरिएको थिएन। यी परिणामहरू स्वचालित रूपमा सेल फेनोटाइपहरू (21) तोक्न मेसिन लर्निङ विधिहरू प्रयोग गरेर पुष्टि गरियो, जसले बिरामीको जलोदर (चित्र S2A) मा ठूलो संख्यामा हड्डी मज्जा कोषहरू (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) को उपस्थिति प्रकट गर्‍यो। सबै पहिचान गरिएका कोष प्रकारहरू मध्ये, यो माइलॉइड कोष जनसंख्याले उच्चतम ग्लुकोज अपटेक र माइटोकोन्ड्रियल गतिविधि देखायो (चित्र S2, B देखि G)। यी परिणामहरूले HGSC बिरामीहरूमा जलोदर र ट्यूमरहरूमा पाइने बहु कोष प्रकारहरू बीचको बलियो मेटाबोलिक भिन्नताहरूलाई हाइलाइट गर्दछ।
TIL को मेटाबोनोमिक विशेषताहरू बुझ्ने मुख्य चुनौती भनेको ट्युमरबाट पर्याप्त शुद्धता, गुणस्तर र मात्राको T कोष नमूनाहरू अलग गर्नु हो। हालैका अध्ययनहरूले देखाएका छन् कि फ्लो साइटोमेट्रीमा आधारित क्रमबद्ध र मनका संवर्धन विधिहरूले सेलुलर मेटाबोलाइट प्रोफाइलहरूमा परिवर्तन ल्याउन सक्छ (२२-२४)। यो समस्यालाई पार गर्न, हामीले LC-MS/MS द्वारा विश्लेषण गर्नु अघि शल्यक्रियाद्वारा रिसेक्ट गरिएको मानव डिम्बग्रंथि क्यान्सरबाट TIL लाई अलग गर्न र अलग गर्न मनका संवर्धन विधिलाई अनुकूलित गर्यौं (सामग्री र विधिहरू हेर्नुहोस्; चित्र २A)। मेटाबोलाइट परिवर्तनहरूमा यस प्रोटोकलको समग्र प्रभावको मूल्याङ्कन गर्न, हामीले माथिको मनका विभाजन चरण पछि स्वस्थ दाताहरूद्वारा सक्रिय गरिएका T कोषहरूको मेटाबोलाइट प्रोफाइलहरूलाई ती कोषहरूसँग तुलना गर्यौं जुन मनका अलग गरिएका थिएनन् तर बरफमा रहे। यो गुणस्तर नियन्त्रण विश्लेषणले यी दुई अवस्थाहरू (r = ०.७७) बीच उच्च सम्बन्ध रहेको पत्ता लगायो, र ८६ मेटाबोलाइटहरूको समूहको प्राविधिक दोहोरिने क्षमता उच्च दोहोरिने क्षमता छ (चित्र २B)। त्यसकारण, यी विधिहरूले कोशिका प्रकारको संवर्धनबाट गुज्रिरहेका कोशिकाहरूमा सही मेटाबोलाइट विश्लेषण गर्न सक्छन्, जसले गर्दा HGSC मा विशिष्ट मेटाबोलाइटहरू पहिचान गर्नको लागि पहिलो उच्च-रिजोल्युसन प्लेटफर्म प्रदान गर्दछ, जसले गर्दा मानिसहरूलाई कोशिका विशिष्टताको गहिरो बुझाइ प्राप्त गर्न सक्षम बनाउँछ। यौन चयापचय कार्यक्रम।
(A) चुम्बकीय मनका संवर्धनको योजनाबद्ध रेखाचित्र। LC-MS/MS द्वारा विश्लेषण गर्नु अघि, कोषहरूले चुम्बकीय मनका संवर्धनको लगातार तीन राउन्डहरू पार गर्नेछन् वा बरफमा रहनेछन्। (B) मेटाबोलाइटहरूको प्रशस्ततामा संवर्धन प्रकारको प्रभाव। प्रत्येक संवर्धन प्रकार ± SE को लागि तीन मापनहरूको औसत। खैरो रेखाले 1:1 सम्बन्धलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ। अक्ष लेबलमा देखाइएको दोहोरिने मापनहरूको अन्तर-वर्ग सहसम्बन्ध (ICC)। NAD, निकोटीनामाइड एडेनाइन डाइन्यूक्लियोटाइड। (C) बिरामी मेटाबोलाइट विश्लेषणको कार्यप्रवाहको योजनाबद्ध रेखाचित्र। जलोदर वा ट्यूमरहरू बिरामीहरूबाट सङ्कलन गरिन्छ र क्रायोप्रिजर्व गरिन्छ। प्रत्येक नमूनाको सानो भाग प्रवाह साइटोमेट्रीद्वारा विश्लेषण गरिएको थियो, जबकि बाँकी नमूनाहरू CD4+, CD8+ र CD45- कोषहरूको लागि संवर्धनको तीन राउन्डहरू पार गरियो। यी कोष अंशहरू LC-MS/MS प्रयोग गरेर विश्लेषण गरिएको थियो। (D) मानकीकृत मेटाबोलाइट प्रचुरताको ताप नक्सा। डेन्ड्रोग्रामले नमूनाहरू बीचको युक्लिडियन दूरीको वार्डको क्लस्टरिङलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ। (ङ) नमूना मेटाबोलाइट नक्साको प्रमुख घटक विश्लेषण (PCA), प्रत्येक नमूनाको तीन प्रतिकृतिहरू देखाउँदै, एउटै बिरामीबाट नमूनाहरू रेखाद्वारा जोडिएका छन्। (च) बिरामीमा सर्त गरिएको नमूनाको मेटाबोलाइट प्रोफाइलको PCA (अर्थात्, आंशिक रिडन्डन्सी प्रयोग गरेर); नमूना प्रकार उत्तल हल द्वारा सीमित छ। PC1, मुख्य घटक 1; PC2, मुख्य घटक 2।
अर्को, हामीले छ HGSC बिरामीहरूको प्राथमिक जलोदर र ट्यूमरहरूमा CD4 +, CD8 + र CD45-कोशिका अंशहरूमा 99 मेटाबोलाइटहरू विश्लेषण गर्न यो संवर्धन विधि लागू गर्यौं (चित्र 2C, चित्र S3A र तालिका S3 र S4)। जीवित कोशिकाहरूको मूल ठूलो नमूनाको 2% देखि 70% सम्म ब्याजको जनसंख्या हुन्छ, र कोशिकाहरूको अनुपात बिरामीहरू बीच धेरै फरक हुन्छ। मोतीहरू अलग गरेपछि, ब्याजको समृद्ध अंश (CD4+, CD8+ वा CD45-) ले औसतमा नमूनामा रहेका सबै जीवित कोशिकाहरूको 85% भन्दा बढीको लागि खाता बनाउँछ। यो संवर्धन विधिले हामीलाई मानव ट्यूमर टिश्यू मेटाबोलिज्मबाट कोशिका जनसंख्याको विश्लेषण गर्न अनुमति दिन्छ, जुन ठूला नमूनाहरूबाट गर्न असम्भव छ। यो प्रोटोकल प्रयोग गरेर, हामीले निर्धारण गर्यौं कि l-kynurenine र adenosine, यी दुई राम्रोसँग विशेषता भएका इम्युनोसप्रेसिभ मेटाबोलाइटहरू ट्यूमर T कोशिकाहरू वा ट्यूमर कोशिकाहरूमा बढाइएको थियो (चित्र S3, B र C)। त्यसकारण, यी नतिजाहरूले बिरामीको तन्तुहरूमा जैविक रूपमा महत्त्वपूर्ण मेटाबोलाइटहरू फेला पार्न हाम्रो कोष विभाजन र मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रविधिको निष्ठा र क्षमता प्रदर्शन गर्दछ।
हाम्रो विश्लेषणले बिरामीहरू भित्र र बिरामीहरू बीच कोशिका प्रकारहरूको बलियो मेटाबोलिक पृथक्करण पनि प्रकट गर्‍यो (चित्र 2D र चित्र S4A)। विशेष गरी, अन्य बिरामीहरूको तुलनामा, बिरामी 70 ले फरक मेटाबोलिक विशेषताहरू देखाए (चित्र 2E र चित्र S4B), जसले बिरामीहरू बीच पर्याप्त मेटाबोलिक विषमता हुन सक्छ भनेर संकेत गर्दछ। यो ध्यान दिन लायक छ कि अन्य बिरामीहरूको तुलनामा (1.2 देखि 2 लिटर; तालिका S1), बिरामी 70 (80 मिलीलीटर) मा सङ्कलन गरिएको जलोदरको कुल मात्रा कम थियो। प्रमुख घटक विश्लेषणको क्रममा अन्तर-बिरामी विषमताको नियन्त्रण (उदाहरणका लागि, आंशिक रिडन्डन्सी विश्लेषण प्रयोग गरेर) कोशिका प्रकारहरू बीच लगातार परिवर्तनहरू देखाउँछ, र कोशिका प्रकारहरू र/वा सूक्ष्म वातावरण मेटाबोलाइट प्रोफाइल (चित्र 2F) अनुसार स्पष्ट रूपमा एकत्रित गरिन्छ। एकल मेटाबोलाइटहरूको विश्लेषणले यी प्रभावहरूलाई जोड दियो र कोशिका प्रकारहरू र सूक्ष्म वातावरण बीचको महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू प्रकट गर्‍यो। यो ध्यान दिन लायक छ कि अवलोकन गरिएको सबैभन्दा चरम भिन्नता MNA हो, जुन सामान्यतया CD45- कोशिकाहरूमा र ट्यूमरमा घुसपैठ गर्ने CD4+ र CD8+ कोशिकाहरूमा समृद्ध हुन्छ (चित्र 3A)। CD4 + कोषहरूको लागि, यो प्रभाव सबैभन्दा स्पष्ट छ, र CD8 + कोषहरूमा MNA पनि वातावरणबाट कडा रूपमा प्रभावित भएको देखिन्छ। यद्यपि, यो महत्त्वपूर्ण छैन, किनभने छ जना बिरामीहरू मध्ये केवल तीन जनालाई ट्युमर CD8+ स्कोरको लागि मूल्याङ्कन गर्न सकिन्छ। MNA को अतिरिक्त, जलोदर र ट्युमरहरूमा विभिन्न प्रकारका कोषहरूमा, TIL मा कमजोर रूपमा चित्रण गरिएका अन्य मेटाबोलाइटहरू पनि भिन्न रूपमा धनी हुन्छन् (चित्र S3 र S4)। त्यसकारण, यी डेटाले थप अनुसन्धानको लागि इम्युनोमोड्युलेटरी मेटाबोलाइटहरूको एक आशाजनक सेट प्रकट गर्दछ।
(A) जलोदर र ट्यूमरबाट CD4+, CD8+ र CD45- कोषहरूमा MNA को सामान्यीकृत सामग्री। बक्स प्लटले मध्य (रेखा), अन्तरचतुर्थक दायरा (फ्रेम हिन्ज) र डेटा दायरा देखाउँछ, अन्तरचतुर्थक दायरा (फ्रेम व्हिस्कर) को १.५ गुणा सम्म। बिरामी सामग्री र विधिहरूमा वर्णन गरिए अनुसार, P मान (*P<0.05 र **P<0.01) निर्धारण गर्न बिरामीको लिम्मा मान प्रयोग गर्नुहोस्। (B) MNA मेटाबोलिज्मको योजनाबद्ध रेखाचित्र (60)। मेटाबोलाइटहरू: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, निकोटिनामाइड; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl- 2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, निकोटिनामाइड राइबोज; NMN, निकोटिनामाइड मोनोन्यूक्लियोटाइड। इन्जाइमहरू (हरियो): NNMT, निकोटिनमाइड N-मिथाइलट्रान्सफरेज; SIRT, sirtuins; NAMPT, निकोटिनमाइड फस्फोरिबोसिल ट्रान्सफरेज; AOX1, एल्डिहाइड अक्सिडेज १; NRK, निकोटिनमाइड राइबोसाइड काइनेज; NMNAT, निकोटिनमाइड मोनो न्यूक्लियोटाइड एडेनाइलेट ट्रान्सफरेज; Pnp1, प्यूरिन न्यूक्लियोसाइड फस्फोरिलेज। (C) जलोदर (खैरो) र ट्यूमर (रातो; n = 3 बिरामीहरू) को scRNA-seq को t-SNE। (D) scRNA-seq प्रयोग गरेर पहिचान गरिएको विभिन्न कोशिका जनसंख्यामा NNMT अभिव्यक्ति। (E) SK-OV-3, मानव भ्रूण मिर्गौला (HEK) 293T, T कोशिकाहरू र MNA-उपचार गरिएका T कोशिकाहरूमा NNMT र AOX1 को अभिव्यक्ति। SK-OV-3 को सापेक्षमा फोल्ड गरिएको अभिव्यक्ति देखाइएको छ। SEM सँगको अभिव्यक्ति ढाँचा देखाइएको छ (n = 6 स्वस्थ दाताहरू)। ३५ भन्दा बढी Ct मानहरू पत्ता लगाउन नसकिने (UD) मानिन्छ। (F) SK-OV-3, HEK293T, T कोषहरू र ८mM MNA सँग उपचार गरिएका T कोषहरूमा SLC22A1 र SLC22A2 को अभिव्यक्ति। SK-OV-3 को सापेक्षमा फोल्ड गरिएको अभिव्यक्ति देखाइएको छ। SEM भएको अभिव्यक्ति ढाँचा देखाइएको छ (n = ६ स्वस्थ दाताहरू)। ३५ भन्दा बढी Ct मानहरू पत्ता लगाउन नसकिने (UD) मानिएको छ। (G) MNA भएको ७२ घण्टाको इन्क्युबेशन पछि सक्रिय स्वस्थ दाता T कोषहरूमा सेल MNA सामग्री। SEM भएको अभिव्यक्ति ढाँचा देखाइएको छ (n = ४ स्वस्थ दाताहरू)।
निकोटिनमाइड एन-मिथाइलट्रान्सफेरेज (NNMT; चित्र ३B) द्वारा S-adenosyl-1-methionine (SAM) बाट निकोटिनमाइड (NA) मा मिथाइल समूह स्थानान्तरण गरेर MNA उत्पादन गरिन्छ। NNMT विभिन्न प्रकारका मानव क्यान्सरहरूमा अत्यधिक अभिव्यक्त हुन्छ र प्रसार, आक्रमण र मेटास्टेसिससँग सम्बन्धित छ (२५-२७)। TME मा T कोषहरूमा MNA को स्रोतलाई राम्रोसँग बुझ्नको लागि, हामीले तीन HGSC बिरामीहरूको जलोदर र ट्यूमरहरूमा कोष प्रकारहरूमा NNMT को अभिव्यक्तिलाई चित्रण गर्न scRNA-seq प्रयोग गर्यौं (तालिका S5)। लगभग ६,५०० कोषहरूको विश्लेषणले देखायो कि जलोदर र ट्यूमर वातावरणमा, NNMT अभिव्यक्ति अनुमानित फाइब्रोब्लास्ट र ट्यूमर कोष जनसंख्यामा सीमित थियो (चित्र ३, C र D)। यो कुरा ध्यान दिन लायक छ कि PTPRC (CD45 +) (चित्र 3D र चित्र S5A) व्यक्त गर्ने कुनै पनि जनसंख्यामा कुनै स्पष्ट NNMT अभिव्यक्ति छैन, जसले मेटाबोलाइट स्पेक्ट्रममा पत्ता लागेको MNA T कोषहरूमा परिचय गराइएको संकेत गर्दछ। एल्डिहाइड अक्सिडेज 1 (AOX1) को अभिव्यक्तिले MNA लाई 1-मिथाइल-2-पाइरिडोन-5-कार्बोक्सामाइड (2-PYR) वा 1-मिथाइल-4-पाइरिडोन-5-कार्बोक्सामाइड (4- PYR) मा रूपान्तरण गर्दछ; चित्र 3B) COL1A1 (चित्र S5A) व्यक्त गर्ने फाइब्रोब्लास्टहरूको जनसंख्यामा पनि सीमित छ, जसले सँगै संकेत गर्दछ कि T कोषहरूमा परम्परागत MNA चयापचयको क्षमताको कमी छ। यी MNA-सम्बन्धित जीनहरूको अभिव्यक्ति ढाँचा HGSC बिरामीहरूबाट जलोदरबाट दोस्रो स्वतन्त्र सेल डेटा सेट प्रयोग गरेर प्रमाणित गरिएको थियो (चित्र S5B; n = 6) (16)। यसको अतिरिक्त, MNA सँग उपचार गरिएका स्वस्थ दाता T कोषहरूको मात्रात्मक पोलिमरेज चेन रियाक्सन (qPCR) विश्लेषणले देखायो कि नियन्त्रण SK-OV-3 डिम्बग्रंथि ट्यूमर कोषहरूको तुलनामा, NNMT वा AOX1 लगभग व्यक्त गरिएको थिएन (चित्र 3E)। यी अप्रत्याशित परिणामहरूले संकेत गर्दछ कि MNA फाइब्रोब्लास्ट वा ट्यूमरबाट TME मा छेउछाउका T कोषहरूमा स्रावित हुन सक्छ।
यद्यपि उम्मेदवारहरूमा घुलनशील वाहक २२ (SLC22) परिवार (SLC22A1, SLC22A2 र SLC22A3) द्वारा एन्कोड गरिएको जैविक क्याशन ट्रान्सपोर्टरहरू १ देखि ३ (OCT1, OCT2 र OCT3) को परिवार समावेश छ, MNA का सम्भावित ट्रान्सपोर्टरहरू अझै पनि अपरिभाषित छन् (28)। स्वस्थ दाता T कोषहरूबाट mRNA को QPCR ले SLC22A1 को कम अभिव्यक्ति स्तर तर SLC22A2 को पत्ता लगाउन नसकिने स्तरहरू देखायो, जसले पुष्टि गर्‍यो कि यो पहिले साहित्यमा रिपोर्ट गरिएको थियो (चित्र 3F) (29)। यसको विपरीत, SK-OV-3 डिम्बग्रंथि ट्युमर सेल लाइनले दुवै ट्रान्सपोर्टरहरूको उच्च स्तर व्यक्त गर्‍यो (चित्र 3F)।
T कोषहरूमा विदेशी MNA अवशोषित गर्ने क्षमता छ कि छैन भनेर परीक्षण गर्न, स्वस्थ दाता T कोषहरूलाई MNA को विभिन्न सांद्रताको उपस्थितिमा ७२ घण्टासम्म कल्चर गरिएको थियो। बाह्य MNA को अनुपस्थितिमा, MNA को सेलुलर सामग्री पत्ता लगाउन सकिँदैन (चित्र ३G)। यद्यपि, बाह्य MNA सँग उपचार गरिएका सक्रिय T कोषहरूले कोषहरूमा MNA सामग्रीमा खुराक-निर्भर वृद्धि देखाए, ६ mM MNA सम्म (चित्र ३G)। यो नतिजाले ट्रान्सपोर्टर अभिव्यक्तिको कम स्तर र इन्ट्रासेल्युलर MNA मेटाबोलिज्मको लागि जिम्मेवार मुख्य इन्जाइमको अभावको बावजुद, TIL ले अझै पनि MNA लिन सक्छ भन्ने संकेत गर्छ।
बिरामीहरूको T कोषहरू र इन भिट्रो MNA अवशोषण प्रयोगहरूमा मेटाबोलाइट्सको स्पेक्ट्रमले क्यान्सर-सम्बन्धित फाइब्रोब्लास्टहरू (CAF) ले MNA स्राव गर्ने सम्भावना बढाउँछ र ट्यूमर कोषहरूले TIL को फेनोटाइप र कार्यलाई नियमन गर्न सक्छन्। T कोषहरूमा MNA को प्रभाव निर्धारण गर्न, MNA को उपस्थिति वा अनुपस्थितिमा स्वस्थ दाता T कोषहरूलाई इन भिट्रोमा सक्रिय गरिएको थियो, र तिनीहरूको प्रसार र साइटोकाइन उत्पादनको मूल्याङ्कन गरिएको थियो। उच्चतम खुराकमा MNA थपेको ७ दिन पछि, जनसंख्या दोब्बर संख्या मध्यम रूपमा घटाइएको थियो, जबकि सबै खुराकहरूमा जोश कायम राखिएको थियो (चित्र ४A)। थप रूपमा, बाह्य MNA को उपचारले ट्यूमर नेक्रोसिस कारक-α (TNFα; चित्र ४B) व्यक्त गर्ने CD4 + र CD8 + T कोषहरूको अनुपातमा वृद्धि भएको थियो। यसको विपरीत, CD4 + T कोषहरूमा IFN-γ को इन्ट्रासेलुलर उत्पादन उल्लेखनीय रूपमा घटाइएको थियो, तर CD8 + T कोषहरूमा होइन, र इन्टरल्युकिन २ (IL-2; चित्र ४, C र D) मा कुनै महत्त्वपूर्ण परिवर्तन भएको थिएन। त्यसकारण, यी MNA-उपचार गरिएका T सेल कल्चरहरूबाट सुपरनेटेन्टहरूको इन्जाइम-लिङ्क गरिएको इम्युनोसोर्बेन्ट परख (ELISA) ले TNFα मा उल्लेखनीय वृद्धि, IFN-γ मा कमी, र IL-2 मा कुनै परिवर्तन देखाएको छैन (चित्र ४, E देखि G)। IFN-γ को कमीले संकेत गर्दछ कि MNA ले T कोषहरूको एन्टी-ट्यूमर गतिविधिलाई रोक्न भूमिका खेल्न सक्छ। T सेल-मध्यस्थ साइटोटोक्सिसिटीमा MNA को प्रभाव अनुकरण गर्न, हरियो फ्लोरोसेन्ट प्रोटीन (GFP) -CAR-T) कोषहरू द्वारा विनियमित फोलेट रिसेप्टर α र CAR-T (GFP) लाई लक्षित गर्ने काइमेरिक एन्टिजेन रिसेप्टर T (FRα-CAR-T) कोषहरू स्वस्थ दाता परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोषहरू (PBMC) द्वारा उत्पादन गरिन्छ। CAR-T कोषहरूलाई MNA को उपस्थितिमा २४ घण्टाको लागि कल्चर गरिएको थियो, र त्यसपछि १०:१ को प्रभावकारी देखि लक्ष्य अनुपातमा फोलेट रिसेप्टर α व्यक्त गर्ने मानव SK-OV-3 डिम्बग्रंथि ट्यूमर कोषहरूसँग सह-कल्चर गरिएको थियो। MNA उपचारको परिणामस्वरूप FRα-CAR-T कोषहरूको मार्ने गतिविधिमा उल्लेखनीय कमी आयो, जुन एडेनोसिनले उपचार गरिएका FRα-CAR-T कोषहरू जस्तै थियो (चित्र 4H)।
(A) दिन ७ मा कल्चरबाट सिधै कुल व्यवहार्य कोष गणना र जनसंख्या दोब्बर (PD)। बार ग्राफले छ स्वस्थ दाताहरूको औसत + SEM प्रतिनिधित्व गर्दछ। कम्तिमा n = ३ स्वतन्त्र प्रयोगहरूबाट डेटा प्रतिनिधित्व गर्दछ। (B देखि D) CD3/CD28 र IL-2 लाई ७ दिनसम्म तिनीहरूको सम्बन्धित MNA सांद्रतामा T कोषहरू सक्रिय गर्न प्रयोग गरिएको थियो। विश्लेषण गर्नु अघि, कोषहरूलाई PMA/ionomycin ले GolgiStop सँग ४ घण्टाको लागि उत्तेजित गरिएको थियो। T कोषहरूमा TNFα (B) अभिव्यक्ति। उदाहरण छवि (बायाँ) र जीवित कोषहरूमा TNFα अभिव्यक्तिको तालिका डेटा (दायाँ)। T कोषहरूमा IFN-γ (C) र IL-2 (D) अभिव्यक्ति। साइटोकाइनहरूको अभिव्यक्ति प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मापन गरिएको थियो। बार ग्राफले औसत (n = ६ स्वस्थ दाताहरू) + SEM प्रतिनिधित्व गर्दछ। P मान निर्धारण गर्न भिन्नता र दोहोरिने मापनहरू (*P<0.05 र **P<0.01) को एक-तर्फी विश्लेषण प्रयोग गर्नुहोस्। कम्तिमा n = ३ स्वतन्त्र प्रयोगहरूबाट डेटा प्रतिनिधित्व गर्दछ। (E देखि G) CD3/CD28 र IL-2 लाई ७ दिनसम्म तिनीहरूको सम्बन्धित MNA सांद्रतामा T कोषहरू सक्रिय गर्न प्रयोग गरिएको थियो। PMA/ionomycin उत्तेजनाको ४ घण्टा अघि र पछि माध्यम सङ्कलन गरिएको थियो। TNFα (E), IFN-γ (F) र IL-2 (G) को सांद्रता ELISA द्वारा मापन गरिएको थियो। बार ग्राफले औसत (n = ५ स्वस्थ दाताहरू) + SEM प्रतिनिधित्व गर्दछ। भिन्नता र दोहोर्याइएको मापनको एक-तर्फी विश्लेषण प्रयोग गरेर P मान निर्धारण गरिन्छ (*P<0.05)। डटेड लाइनले पत्ता लगाउने सीमालाई संकेत गर्दछ। (H) सेल लिसिस परख। FRα-CAR-T वा GFP-CAR-T कोषहरूलाई २४ घण्टाको लागि एडेनोसिन (२५०μM) वा MNA (१० mM) सँग समायोजन गरिएको थियो, वा उपचार नगरी छोडिएको थियो (Ctrl)। SK-OV-3 कोषहरूको प्रतिशत हत्या मापन गरिएको थियो। P मान वेल्च t परीक्षण (*P<0.5 र **P<0.01) द्वारा निर्धारण गरिएको थियो।
MNA-निर्भर TNFα अभिव्यक्ति नियमनको यान्त्रिक बुझाइ प्राप्त गर्न, MNA-उपचार गरिएका T कोषहरूको TNFα mRNA मा भएका परिवर्तनहरूको मूल्याङ्कन गरिएको थियो (चित्र 5A)। MNA सँग उपचार गरिएका स्वस्थ दाता T कोषहरूले TNFα ट्रान्सक्रिप्शन स्तरमा दुई गुणा वृद्धि देखाए, जसले MNA TNFα ट्रान्सक्रिप्शनल नियमनमा निर्भर रहेको संकेत गर्दछ। यो सम्भावित नियामक संयन्त्रको अनुसन्धान गर्न, TNFα लाई नियमन गर्ने दुई ज्ञात ट्रान्सक्रिप्शन कारकहरू, अर्थात् सक्रिय T सेल न्यूक्लियर फ्याक्टर (NFAT) र विशिष्ट प्रोटीन 1 (Sp1), लाई प्रोक्सिमल TNFα प्रमोटर (30) मा MNA बाइन्डिङको प्रतिक्रियामा मूल्याङ्कन गरिएको थियो। TNFα प्रमोटरमा 6 पहिचान गरिएका NFAT बाइन्डिङ साइटहरू र 2 Sp1 बाइन्डिङ साइटहरू छन्, एक साइटमा ओभरल्याप गर्दै [-55 आधार जोडीहरू (bp) from 5'cap] (30)। क्रोमेटिन इम्युनोप्रिसिपिटेशन (ChIP) ले देखायो कि MNA सँग उपचार गर्दा, TNFα प्रमोटरमा Sp1 को बाइन्डिङ तीन गुणा बढ्यो। NFAT को समावेशीकरण पनि बढ्यो र महत्त्व नजिक पुग्यो (चित्र 5B)। यी तथ्याङ्कहरूले संकेत गर्छन् कि MNA ले Sp1 ट्रान्सक्रिप्शन मार्फत TNFα को अभिव्यक्तिलाई नियमन गर्दछ, र केही हदसम्म NFAT को अभिव्यक्तिलाई।
(A) MNA बिना संवर्धित T कोषहरूको तुलनामा, MNA सँग उपचार गरिएका T कोषहरूमा TNFα अभिव्यक्तिको तह परिवर्तन। SEM सँग अभिव्यक्ति ढाँचा देखाइएको छ (n = 5 स्वस्थ दाताहरू)। कम्तिमा n = 3 स्वतन्त्र प्रयोगहरूबाट डेटा प्रतिनिधित्व गर्दछ। (B) NFAT र Sp1 पछि 8 mM MNA सँग वा बिना उपचार गरिएका T कोषहरूको TNFα प्रमोटरलाई (Ctrl) र PMA/ionomycin उत्तेजनाको साथ 4 घण्टाको लागि संयुक्त गरिएको थियो। इम्युनोग्लोबुलिन G (IgG) र H3 लाई इम्युनोप्रिसिपिटेशनको लागि नकारात्मक र सकारात्मक नियन्त्रणको रूपमा क्रमशः प्रयोग गरिएको थियो। ChIP को परिमाणीकरणले MNA-उपचार गरिएका कोषहरूमा TNFα प्रमोटरमा Sp1 र NFAT को बन्धन नियन्त्रणको तुलनामा धेरै गुणा बढेको देखाएको छ। कम्तिमा n = 3 स्वतन्त्र प्रयोगहरूबाट डेटा प्रतिनिधित्व गर्दछ। धेरै t-परीक्षणहरू (*** P <0.01) द्वारा निर्धारण गरिएको P मान। (C) HGSC को जलोदरको तुलनामा, T कोषहरू (गैर-साइटोटोक्सिक) ले ट्युमरमा TNF को अभिव्यक्ति बढेको देखाएको छ। रंगहरूले फरक बिरामीहरूलाई प्रतिनिधित्व गर्छन्। प्रदर्शित कोषहरूलाई अनियमित रूपमा ३०० मा नमूना गरिएको छ र ओभरड्राइङलाई सीमित गर्न जिटर गरिएको छ (** Padj = ०.००७६)। (D) डिम्बग्रंथि क्यान्सरको लागि MNA को प्रस्तावित मोडेल। MNA TME मा ट्यूमर कोषहरू र फाइब्रोब्लास्टहरूमा उत्पादन गरिन्छ र T कोषहरूद्वारा लिइन्छ। MNA ले TNFα प्रमोटरमा Sp1 को बन्धन बढाउँछ, जसले गर्दा TNFα ट्रान्सक्रिप्शन र TNFα साइटोकाइन उत्पादन बढ्छ। MNA ले IFN-γ मा पनि कमी ल्याउँछ। T कोष प्रकार्यको अवरोधले मार्ने क्षमता कम गर्छ र ट्यूमरको वृद्धिलाई तीव्र बनाउँछ।
रिपोर्टहरूका अनुसार, TNFα को अगाडि र पछाडि निर्भर एन्टी-ट्यूमर र एन्टी-ट्यूमर प्रभावहरू छन्, तर यसले डिम्बग्रंथि क्यान्सरको वृद्धि र मेटास्टेसिसलाई बढावा दिनमा एक प्रसिद्ध भूमिका खेल्छ (31-33)। रिपोर्टहरूका अनुसार, डिम्बग्रंथि क्यान्सर भएका बिरामीहरूमा जलोदर र ट्यूमर तन्तुहरूमा TNFα को सांद्रता सौम्य तन्तुहरूको भन्दा बढी हुन्छ (34-36)। संयन्त्रको हिसाबले, TNFα ले सेतो रक्त कोशिकाहरूको सक्रियता, कार्य र प्रसारलाई नियमन गर्न सक्छ, र क्यान्सर कोशिकाहरूको फेनोटाइप परिवर्तन गर्न सक्छ (37, 38)। यी निष्कर्षहरूसँग मिल्दोजुल्दो, विभेदक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषणले देखायो कि जलोदरको तुलनामा ट्यूमर तन्तुहरूमा T कोशिकाहरूमा TNF उल्लेखनीय रूपमा माथि-नियमित गरिएको थियो (चित्र 5C)। TNF अभिव्यक्तिमा वृद्धि गैर-साइटोटोक्सिक फेनोटाइप (चित्र S5A) भएको T कोशिका जनसंख्यामा मात्र स्पष्ट थियो। संक्षेपमा, यी तथ्याङ्कहरूले HGSC मा MNA को दोहोरो इम्युनोसप्रेसिव र ट्यूमर प्रवर्द्धन प्रभावहरू छन् भन्ने दृष्टिकोणलाई समर्थन गर्दछ।
फ्लो साइटोमेट्रीमा आधारित फ्लोरोसेन्ट लेबलिङ TIL मेटाबोलिज्म अध्ययन गर्ने मुख्य विधि बनेको छ। यी अध्ययनहरूले देखाएका छन् कि माध्यमिक लिम्फोइड अंगहरूबाट परिधीय रक्त लिम्फोसाइट्स वा T कोषहरूको तुलनामा, मुरिन र मानव TIL मा ग्लुकोज (4, 39) अपनाउने उच्च प्रवृत्ति र माइटोकोन्ड्रियल प्रकार्यको क्रमिक क्षति (19, 40) हुन्छ। यद्यपि हामीले यस अध्ययनमा समान परिणामहरू अवलोकन गरेका छौं, मुख्य विकास भनेको ट्यूमर कोषहरूको चयापचय र एउटै रिसेक्ट गरिएको ट्यूमर तन्तुबाट TIL तुलना गर्नु हो। यी केही अघिल्ला रिपोर्टहरूसँग मिल्दोजुल्दो, जलोदर र ट्यूमरबाट ट्यूमर (CD45-EpCAM +) कोषहरूमा CD8 + र CD4 + T कोषहरू भन्दा उच्च ग्लुकोज अपटेक हुन्छ, जसले ट्यूमर कोषहरूको उच्च ग्लुकोज अपटेकलाई T कोषहरूसँग तुलना गर्न सकिन्छ भनेर समर्थन गर्दछ। T सेल प्रतिस्पर्धाको अवधारणा। TME। यद्यपि, ट्यूमर कोषहरूको माइटोकोन्ड्रियल गतिविधि CD8 + T कोषहरूको भन्दा उच्च छ, तर माइटोकोन्ड्रियल गतिविधि CD4 + T कोषहरूको जस्तै छ। यी परिणामहरूले उदीयमान विषयवस्तुलाई बलियो बनाउँछ कि अक्सिडेटिभ मेटाबोलिज्म ट्यूमर कोषहरूको लागि महत्त्वपूर्ण छ (41, 42)। तिनीहरूले यो पनि सुझाव दिन्छन् कि CD8 + T कोषहरू CD4 + T कोषहरू भन्दा अक्सिडेटिभ डिसफंक्शनको लागि बढी संवेदनशील हुन सक्छन्, वा CD4 + T कोषहरूले माइटोकोन्ड्रियल गतिविधि कायम राख्न ग्लुकोज बाहेक अन्य कार्बन स्रोतहरू प्रयोग गर्न सक्छन् (43, 44)। यो ध्यान दिनुपर्छ कि हामीले जलोदरमा CD4 + T प्रभावकहरू, T प्रभावक मेमोरी र T केन्द्रीय मेमोरी कोषहरू बीच ग्लुकोज अपटेक वा माइटोकोन्ड्रियल गतिविधिमा कुनै भिन्नता देखेनौं। त्यस्तै गरी, ट्यूमरहरूमा CD8 + T कोषहरूको भिन्नता अवस्थाको ग्लुकोज अपटेकमा परिवर्तनहरूसँग कुनै सम्बन्ध छैन, जसले इन भिट्रोमा कल्चर गरिएका T कोषहरू र भिभोमा मानव TIL बीचको महत्त्वपूर्ण भिन्नतालाई हाइलाइट गर्दछ (22)। यी अवलोकनहरू निष्पक्ष स्वचालित कोष जनसंख्या विनियोजनको प्रयोगद्वारा पनि पुष्टि गरिएको थियो, जसले थप खुलासा गर्‍यो कि ट्यूमर कोषहरू भन्दा उच्च ग्लुकोज अपटेक र माइटोकोन्ड्रियल गतिविधि भएका CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + कोषहरू प्रचलित छन् तर मेटाबोलिक सक्रिय कोष जनसंख्या छ। यो जनसंख्या scRNA-seq विश्लेषणमा पहिचान गरिएका माइलोइड सप्रेसर कोषहरू वा प्लाज्मासाइटोइड डेन्ड्रिटिक कोषहरूको पुटेटिभ उप-जनसंख्या प्रतिनिधित्व गर्न सक्छ। यद्यपि यी दुवै मानव डिम्बग्रंथि ट्युमरहरूमा रिपोर्ट गरिएको छ [45], तिनीहरूलाई अझै पनि आवश्यक छ। यो माइलॉइड उप-जनसंख्या वर्णन गर्न थप काम गर्नु हो।
यद्यपि फ्लो साइटोमेट्री-आधारित विधिहरूले कोशिका प्रकारहरू बीच ग्लुकोज र अक्सिडेटिभ मेटाबोलिज्ममा सामान्य भिन्नताहरू स्पष्ट गर्न सक्छ, TME मा माइटोकोन्ड्रियल मेटाबोलिज्मको लागि ग्लुकोज वा अन्य कार्बन स्रोतहरूद्वारा उत्पादित सटीक मेटाबोलाइटहरू अझै निर्धारण गरिएको छैन। दिइएको TIL सबसेटमा मेटाबोलाइटहरूको उपस्थिति वा अनुपस्थिति तोक्नका लागि एक्साइज्ड टिस्युबाट कोशिका जनसंख्याको शुद्धीकरण आवश्यक पर्दछ। त्यसकारण, मास स्पेक्ट्रोमेट्रीसँग मिल्ने हाम्रो कोशिका संवर्धन विधिले बिरामी नमूनाहरूमा T कोशिकाहरू र ट्युमर कोशिका जनसंख्यामा भिन्न रूपमा समृद्ध मेटाबोलाइटहरूमा अन्तर्दृष्टि प्रदान गर्न सक्छ। यद्यपि यस विधिमा फ्लोरोसेन्स-सक्रिय सेल क्रमबद्धता भन्दा फाइदाहरू छन्, केही मेटाबोलाइट पुस्तकालयहरू अन्तर्निहित स्थिरता र/वा द्रुत कारोबार दर (22) को कारणले प्रभावित हुन सक्छन्। तैपनि, हाम्रो विधिले दुई मान्यता प्राप्त इम्युनोसप्रेसिभ मेटाबोलाइटहरू, एडेनोसिन र काइनुरेनिन पहिचान गर्न सक्षम थियो, किनभने तिनीहरू नमूना प्रकारहरू बीच धेरै भिन्न हुन्छन्।
ट्यूमर र TIL उपप्रकारहरूको हाम्रो मेटाबोनोमिक विश्लेषणले डिम्बग्रंथि TME मा मेटाबोलाइट्सको भूमिकामा थप अन्तर्दृष्टि प्रदान गर्दछ। पहिलो, फ्लो साइटोमेट्री प्रयोग गरेर, हामीले निर्धारण गर्यौं कि ट्यूमर र CD4 + T कोषहरू बीच माइटोकोन्ड्रियल गतिविधिमा कुनै भिन्नता थिएन। यद्यपि, LC-MS/MS विश्लेषणले यी जनसंख्याहरू बीच मेटाबोलाइट्सको प्रशस्ततामा महत्त्वपूर्ण परिवर्तनहरू प्रकट गर्‍यो, जसले संकेत गर्दछ कि TIL चयापचय र यसको समग्र चयापचय गतिविधिको बारेमा निष्कर्षहरूलाई सावधानीपूर्वक व्याख्या आवश्यक छ। दोस्रो, MNA जलोदरमा CD45-कोषहरू र T कोषहरू बीच सबैभन्दा ठूलो भिन्नता भएको मेटाबोलाइट हो, ट्यूमर होइन। त्यसकारण, कम्पार्टमेन्टलाइजेसन र ट्यूमर स्थानले TIL चयापचयमा फरक प्रभाव पार्न सक्छ, जसले दिइएको सूक्ष्म वातावरणमा सम्भावित विषमतालाई हाइलाइट गर्दछ। तेस्रो, MNA-उत्पादन गर्ने इन्जाइम NNMT को अभिव्यक्ति मुख्यतया CAF मा सीमित छ, जुन कम हदसम्म ट्यूमर कोषहरू हो, तर पत्ता लगाउन सकिने MNA स्तरहरू ट्यूमर-व्युत्पन्न T कोषहरूमा अवलोकन गरिन्छ। डिम्बग्रंथि CAF मा NNMT को अत्यधिक अभिव्यक्तिमा ज्ञात क्यान्सर-प्रवर्द्धन प्रभाव छ, आंशिक रूपमा CAF चयापचय, ट्यूमर आक्रमण र मेटास्टेसिसको प्रवर्द्धनको कारणले (27)। TIL को समग्र स्तर मध्यम भएतापनि, CAF मा NNMT को अभिव्यक्ति क्यान्सर जीनोम एटलस (TCGA) मेसेन्काइमल उपप्रकारसँग नजिकबाट सम्बन्धित छ, जुन खराब रोगको निदानसँग सम्बन्धित छ (27, 46, 47)। अन्तमा, MNA क्षयको लागि जिम्मेवार इन्जाइम AOX1 को अभिव्यक्ति पनि CAF जनसंख्यामा सीमित छ, जसले T कोषहरूमा MNA मेटाबोलाइज गर्ने क्षमताको कमी रहेको संकेत गर्दछ। यी परिणामहरूले यो विचारलाई समर्थन गर्दछ कि यद्यपि यो खोज प्रमाणित गर्न थप काम आवश्यक छ, T कोषहरूमा MNA को उच्च स्तरले इम्युनोसप्रेसिभ CAF सूक्ष्म वातावरणको उपस्थितिलाई संकेत गर्न सक्छ।
MNA ट्रान्सपोर्टरहरूको कम अभिव्यक्ति स्तर र MNA मेटाबोलिज्ममा संलग्न प्रमुख प्रोटीनहरूको पत्ता लगाउन नसकिने स्तरलाई ध्यानमा राख्दै, T कोषहरूमा MNA को उपस्थिति अप्रत्याशित छ। NNMT न त AOX1 लाई scRNA-seq विश्लेषण र दुई स्वतन्त्र समूहहरूको लक्षित qPCR द्वारा पत्ता लगाउन सकियो। यी परिणामहरूले संकेत गर्दछ कि MNA T कोषहरू द्वारा संश्लेषित गरिएको छैन, तर वरपरका TME बाट अवशोषित गरिएको छ। इन भिट्रो प्रयोगहरूले देखाउँछन् कि T कोषहरू बाह्य MNA जम्मा गर्ने प्रवृत्ति हुन्छ।
हाम्रो इन भिट्रो अध्ययनहरूले देखाएको छ कि बाह्य MNA ले T कोषहरूमा TNFα को अभिव्यक्तिलाई प्रेरित गर्छ र TNFα प्रमोटरसँग Sp1 को बन्धन बढाउँछ। यद्यपि TNFα मा एन्टी-ट्यूमर र एन्टी-ट्यूमर दुवै कार्यहरू छन्, डिम्बग्रंथि क्यान्सरमा, TNFα ले डिम्बग्रंथि क्यान्सरको वृद्धिलाई बढावा दिन सक्छ (31-33)। डिम्बग्रंथि ट्यूमर सेल कल्चरमा TNFα को तटस्थीकरण वा माउस मोडेलहरूमा TNFα संकेतको उन्मूलनले TNFα-मध्यस्थता भडकाउने साइटोकाइन उत्पादनलाई सुधार गर्न सक्छ र ट्यूमरको वृद्धिलाई रोक्छ (32, 35)। त्यसकारण, यस अवस्थामा, TME-व्युत्पन्न MNA ले अटोक्राइन लूप मार्फत TNFα-निर्भर संयन्त्र मार्फत प्रो-इन्फ्लेमेटरी मेटाबोलाइटको रूपमा काम गर्न सक्छ, जसले गर्दा डिम्बग्रंथि क्यान्सरको घटना र प्रसारलाई बढावा दिन्छ (31)। यस सम्भावनाको आधारमा, TNFα नाकाबन्दीलाई डिम्बग्रंथि क्यान्सरको लागि सम्भावित उपचारात्मक एजेन्टको रूपमा अध्ययन गरिएको छ (37, 48, 49)। थप रूपमा, MNA ले CAR-T कोषहरूको साइटोटोक्सिसिटीलाई डिम्बग्रंथि ट्यूमर कोषहरूमा बिगार्छ, MNA-मध्यस्थता प्रतिरक्षा दमनको लागि थप प्रमाण प्रदान गर्दछ। सामूहिक रूपमा, यी नतिजाहरूले एउटा मोडेलको सुझाव दिन्छन् जसमा ट्युमर र CAF कोषहरूले MNA लाई बाह्य कोशिकीय TME मा स्राव गर्छन्। (i) TNF-प्रेरित डिम्बग्रंथि क्यान्सर वृद्धि उत्तेजना र (ii) MNA-प्रेरित T सेल साइटोटोक्सिक गतिविधि अवरोध मार्फत, यसको दोहोरो ट्युमर प्रभाव हुन सक्छ (चित्र 5D)।
निष्कर्षमा, द्रुत कोशिका संवर्धन, एकल-कोशिका अनुक्रमण र मेटाबोलिक प्रोफाइलिङको संयोजन लागू गरेर, यस अध्ययनले HGSC बिरामीहरूमा ट्यूमर र जलोदर कोशिकाहरू बीचको विशाल इम्युनोमेटाबोलोमिक भिन्नताहरू प्रकट गर्‍यो। यो व्यापक विश्लेषणले T कोशिकाहरू बीच ग्लुकोज अपटेक र माइटोकोन्ड्रियल गतिविधिमा भिन्नताहरू रहेको देखाएको छ, र MNA लाई गैर-कोशिका स्वायत्त प्रतिरक्षा नियामक मेटाबोलाइटको रूपमा पहिचान गरेको छ। यी डेटाले मानव क्यान्सरहरूमा TME ले T सेल मेटाबोलिज्मलाई कसरी असर गर्छ भन्ने कुरामा प्रभाव पार्छ। यद्यपि T कोशिकाहरू र क्यान्सर कोशिकाहरू बीच पोषक तत्वहरूको लागि प्रत्यक्ष प्रतिस्पर्धा रिपोर्ट गरिएको छ, मेटाबोलाइटहरूले ट्यूमर प्रगतिलाई बढावा दिन र सम्भवतः अन्तर्जात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाहरूलाई दबाउन अप्रत्यक्ष नियामकहरूको रूपमा पनि काम गर्न सक्छन्। यी नियामक मेटाबोलाइटहरूको कार्यात्मक भूमिकाको थप विवरणले ट्यूमर विरोधी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया बढाउनको लागि वैकल्पिक रणनीतिहरू खोल्न सक्छ।
बिरामीका नमूनाहरू र क्लिनिकल डेटा क्यानेडियन टिस्यु रिपोजिटरी नेटवर्कद्वारा प्रमाणित BC क्यान्सर ट्युमर टिस्यु रिपोजिटरी मार्फत प्राप्त गरिएको थियो। BC क्यान्सर रिसर्च एथिक्स कमिटी र ब्रिटिश कोलम्बिया विश्वविद्यालय (H07-00463) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकल अनुसार, सबै बिरामीका नमूनाहरू र क्लिनिकल डेटाले सूचित लिखित सहमति प्राप्त गरेको थियो वा औपचारिक रूपमा उनीहरूको सहमति त्यागेको थियो। नमूनाहरू प्रमाणित बायोबैंक (BRC-00290) मा भण्डारण गरिएका छन्। विस्तृत बिरामी विशेषताहरू तालिकाहरू S1 र S5 मा देखाइएका छन्। क्रायोप्रिजर्भेसनको लागि, बिरामीको ट्युमर नमूनालाई मेकानिकली रूपमा विघटन गर्न स्केलपेल प्रयोग गरिन्छ र त्यसपछि एकल कोशिका निलम्बन प्राप्त गर्न 100-माइक्रोन फिल्टर मार्फत धकेलिन्छ। बिरामीको जलोदरलाई 4°C मा 10 मिनेटको लागि 1500 rpm मा सेन्ट्रीफ्यूज गरिएको थियो ताकि कोशिकाहरू गोली हानियोस् र सुपरनेटेन्ट हटाइयोस्। ट्युमर र जलोदरबाट प्राप्त कोषहरूलाई ५०% ताप-निष्क्रिय मानव एबी सीरम (सिग्मा-एल्ड्रिच), ४०% RPMI-१६४० (थर्मो फिशर साइन्टिफिक) र १०% डाइमिथाइल सल्फोक्साइडमा क्रायोप्रिजर्भ गरिएको थियो। यी संरक्षित एकल कोषीय निलम्बनहरूलाई पगालिएको थियो र तल वर्णन गरिएको मेटाबोलोमिक्स र मेटाबोलाइट निर्धारणको लागि प्रयोग गरिएको थियो।
पूर्ण माध्यममा ०.२२ μm फिल्टर गरिएको ५०:५० पूरक RPMI १६४० हुन्छ: AimV। RPMI १६४० + २.०५ mM l-ग्लुटामाइन (थर्मो फिशर साइन्टिफिक) १०% ताप-निष्क्रिय मानव AB सीरम (सिग्मा-एल्ड्रिच), १२.५ mM हेप्स (थर्मो फिशर साइन्टिफिक), २ mM l-ग्लुटामाइन (थर्मो फिशर साइन्टिफिक) फिशर साइन्टिफिक), १ x पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेनस्ट्रेप) घोल (थर्मो फिशर साइन्टिफिक) र ५० μMB-मर्क्याप्टोएथेनोल। AimV (इन्भिट्रोजन) २० mM हेप्स (थर्मो फिशर साइन्टिफिक) र २ mM l-ग्लुटामाइन (थर्मो फिशर साइन्टिफिक) ले पूरक हुन्छ। फ्लो साइटोमिटर स्टेनिङ बफरमा ३% ताप-निष्क्रिय AB मानव सीरम (सिग्मा) ले पूरक ०.२२ μm फिल्टर गरिएको फस्फेट बफर गरिएको सलाइन (PBS; इन्भिट्रोजन) समावेश हुन्छ। कोष संवर्धन बफर ०.२२μm फिल्टर गरिएको PBS बाट बनेको हुन्छ र ०.५% ताप-निष्क्रिय मानव AB सीरम (सिग्मा-एल्ड्रिच) सँग पूरक हुन्छ।
३७°C पूर्ण माध्यममा, कोषहरूलाई १० nM MT DR र १०० μM २-NBDG ले ३० मिनेटको लागि दाग लगाइयो। त्यसपछि, कोषहरूलाई १५ मिनेटको लागि ४°C मा व्यवहार्यता डाई eF506 ले दाग लगाइयो। FC ब्लक (eBioscience) र Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) मा कोषहरूलाई पुन: निलम्बन गर्नुहोस्, फ्लो साइटोमिटर स्टेनिङ बफरमा पातलो गर्नुहोस् (निर्माताको निर्देशन अनुसार), र कोठाको तापक्रममा १० मिनेटको लागि इन्क्युबेट गर्नुहोस्। ४°C मा फ्लो साइटोमेट्री स्टेनिङ बफरमा २० मिनेटको लागि एन्टिबडीहरूको सेट (तालिका S2) ले दाग लगाउनुहोस्। विश्लेषण गर्नु अघि फ्लो साइटोमेट्री स्टेनिङ बफर (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R कन्फिगरेसन) मा कोषहरूलाई पुन: निलम्बन गर्नुहोस्। सेल गणना डेटा विश्लेषण गर्न SpectroFlo र FlowJo V10 प्रयोग गर्नुहोस्, र डेटा सिर्जना गर्न GraphPad Prism 8 प्रयोग गर्नुहोस्। २-NBDG र MT DR को मध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) लग-सामान्यीकृत गरिएको थियो, र त्यसपछि मिल्दो बिरामीहरूको लागि तथ्याङ्कीय विश्लेषणको लागि जोडी t परीक्षण प्रयोग गरिएको थियो। विश्लेषणबाट ४० भन्दा कम घटनाहरू भएका सबै जनसंख्याहरू हटाउनुहोस्; तथ्याङ्कीय विश्लेषण र डेटा दृश्यीकरण गर्नु अघि कुनै पनि नकारात्मक मानहरूको लागि १ को MFI मान प्रविष्ट गर्नुहोस्।
माथिको प्रक्रिया प्यानलको म्यानुअल गेटिङ रणनीतिलाई पूरक बनाउनको लागि, हामीले FlowJo मा मृत कोषहरू हटाएपछि जनसंख्यामा स्वचालित रूपमा कोषहरू तोक्न आकार प्रतिबन्ध रूख (FAUST) (21) द्वारा पूर्ण एनोटेसन प्रयोग गर्यौं। हामी गलत रूपमा आवंटित जस्तो देखिने जनसंख्याहरू (PD1+ लाई PD1-ट्यूमर कोषहरूसँग संयोजन गर्दै) र कायम राखिएको जनसंख्याहरू मर्ज गर्न म्यानुअल रूपमा आउटपुट व्यवस्थापन गर्छौं। प्रत्येक नमूनामा कुल ११ जनसंख्याको लागि औसत २% भन्दा बढी कोषहरू हुन्छन्।
PBMC लाई ल्युकोसाइट पृथकीकरण उत्पादनहरू (STEMCELL Technologies) बाट अलग गर्न Ficoll ग्रेडियन्ट घनत्व केन्द्रापसारक प्रयोग गरिएको थियो। CD8 + T कोषहरूलाई CD8 MicroBeads (Miltenyi) प्रयोग गरेर PBMC बाट अलग गरिएको थियो र निर्माताको निर्देशन अनुसार TransAct (Miltenyi) प्रयोग गरेर २ हप्ताको लागि पूर्ण माध्यममा विस्तार गरिएको थियो। कोषहरूलाई IL-7 (१० ng/ml; PeproTech) भएको पूर्ण माध्यममा ५ दिनसम्म खडा हुन अनुमति दिइएको थियो, र त्यसपछि TransAct द्वारा पुन: उत्तेजित गरिएको थियो। दिन ७ मा, निर्माताको निर्देशन अनुसार, मानव CD45 MicroBeads (Miltenyi) लगातार तीन राउन्डमा कोषहरूलाई समृद्ध बनाउन प्रयोग गरिएको थियो। कोषहरूलाई प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषणको लागि (माथि वर्णन गरिए अनुसार) एलिक्विट गरिएको थियो, र LC-MS/MS विश्लेषणको लागि दस लाख कोषहरूलाई तीन पटक एलिक्विट गरिएको थियो। नमूनाहरू तल वर्णन गरिए अनुसार LC-MS/MS द्वारा प्रशोधन गरिएको थियो। हामीले हराएको मेटाबोलाइट मान १,००० को आयन संख्याको साथ अनुमान गर्यौं। प्रत्येक नमूनालाई कुल आयन संख्या (TIC) द्वारा सामान्यीकृत गरिन्छ, लगरिदमिक रूपमा रूपान्तरण गरिन्छ र विश्लेषण गर्नु अघि MetaboAnalystR मा स्वचालित रूपमा सामान्यीकृत गरिन्छ।
प्रत्येक बिरामीको एकल कोष निलम्बनलाई पगालेर ४० μm फिल्टर मार्फत पूर्ण माध्यममा फिल्टर गरिएको थियो (माथि वर्णन गरिए अनुसार)। निर्माताको प्रोटोकल अनुसार, CD8+, CD4+ र CD45- कोषहरू (बरफमा) को लागि नमूनाहरू समृद्ध गर्न माइक्रोबिड्स (मिल्टेनी) प्रयोग गरेर चुम्बकीय मनका विभाजनद्वारा सकारात्मक चयनको लगातार तीन राउन्डहरू प्रयोग गरिएको थियो। छोटकरीमा, कोषहरूलाई सेल संवर्धन बफरमा (माथि वर्णन गरिए अनुसार) पुन: निलम्बन गरिन्छ र गणना गरिन्छ। कोषहरूलाई मानव CD8 मोती, मानव CD4 मोती वा मानव CD45 मोती (मिल्टेनी) ले ४°C मा १५ मिनेटको लागि इन्क्युबेट गरिएको थियो, र त्यसपछि सेल संवर्धन बफरले धोइन्छ। नमूना LS स्तम्भ (मिल्टेनी) मार्फत पार गरिन्छ, र सकारात्मक र नकारात्मक अंशहरू सङ्कलन गरिन्छ। अवधि घटाउन र कोष रिकभरी चरणलाई अधिकतम बनाउनको लागि, CD8-अपूर्णांक त्यसपछि CD4+ संवर्धनको दोस्रो चरणको लागि प्रयोग गरिन्छ, र CD4-अपूर्णांक पछिको CD45-संवर्धनको लागि प्रयोग गरिन्छ। विभाजन प्रक्रियाभरि समाधानलाई बरफमा राख्नुहोस्।
मेटाबोलाइट विश्लेषणको लागि नमूनाहरू तयार गर्न, कोषहरूलाई एक पटक बरफको चिसो नुन घोलले धोइयो, र प्रत्येक नमूनामा १ मिली ८०% मेथानोल थपियो, त्यसपछि भोर्टेक्स गरियो र तरल नाइट्रोजनमा स्न्याप फ्रिज गरियो। नमूनाहरूलाई तीन फ्रिज-थाउ चक्रहरूमा राखियो र १४,००० आरपीएममा ४°C मा १५ मिनेटको लागि सेन्ट्रीफ्यूज गरियो। मेटाबोलाइटहरू भएको सुपरनेटेन्ट सुख्खा नभएसम्म वाष्पीकरण गरिन्छ। मेटाबोलाइटहरू ०.०३% फर्मिक एसिडको ५० μl मा पुन: घुलनशील गरियो, मिश्रण गर्न भोर्टेक्स गरियो, र त्यसपछि फोहोर हटाउन सेन्ट्रीफ्यूज गरियो।
माथि वर्णन गरिए अनुसार मेटाबोलाइटहरू निकाल्नुहोस्। मेटाबोलोमिक्स अनुसन्धानको लागि सुपरनेटेन्टलाई उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी बोतलमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्। ब्याच प्रभावहरू रोक्नको लागि प्रत्येक नमूनालाई समान संख्यामा कोषहरूसँग उपचार गर्न अनियमित उपचार प्रोटोकल प्रयोग गर्नुहोस्। हामीले AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50) मा पहिले प्रकाशित विश्वव्यापी मेटाबोलाइटहरूको गुणात्मक मूल्याङ्कन गर्यौं। क्रोमेटोग्राफिक विश्लेषण र शिखर क्षेत्र एकीकरण MultiQuant संस्करण 2.1 सफ्टवेयर (एप्लाइड बायोसिस्टम SCIEX) प्रयोग गरेर गरिएको थियो।
हराएको मेटाबोलाइट मान अनुमान गर्न १००० को आयन गणना प्रयोग गरिएको थियो, र प्रत्येक नमूनाको TIC नमूना प्रशोधनबाट उपकरण विश्लेषणद्वारा शुरू गरिएका परिवर्तनहरूलाई सच्याउन प्रत्येक पत्ता लगाइएको मेटाबोलाइटको सामान्यीकृत शिखर क्षेत्र गणना गर्न प्रयोग गरिएको थियो। TIC सामान्यीकृत भएपछि, MetaboAnalystR(51) (पूर्वनिर्धारित प्यारामिटर) लगारिदमिक रूपान्तरण र स्वचालित मानक रेखा स्केलिंगको लागि प्रयोग गरिन्छ। हामीले नमूना प्रकारहरू बीच मेटाबोलोम भिन्नताहरूको अन्वेषण विश्लेषण गर्न vegan R प्याकेजको साथ PCA प्रयोग गर्यौं, र बिरामीहरूको विश्लेषण गर्न आंशिक रिडन्डन्सी विश्लेषण प्रयोग गर्यौं। नमूनाहरू बीचको युक्लिडियन दूरी क्लस्टर गर्न ताप नक्सा डेन्ड्रोग्राम निर्माण गर्न वार्ड विधि प्रयोग गर्नुहोस्। हामीले सम्पूर्ण कोशिका प्रकार र सूक्ष्म वातावरणमा भिन्न रूपमा प्रचुर मात्रामा मेटाबोलाइटहरू पहिचान गर्न मानकीकृत मेटाबोलाइट प्रचुरतामा लिम्मा (52) प्रयोग गर्यौं। व्याख्यालाई सरल बनाउनको लागि, हामी मोडेल निर्दिष्ट गर्न समूह औसत प्यारामिटर प्रयोग गर्छौं, र प्रत्येक समूह (n = 6 समूहहरू) को रूपमा सूक्ष्म वातावरणमा सेल प्रकारहरूलाई विचार गर्छौं; महत्व परीक्षणको लागि, हामीले प्रत्येक मेटाबोलाइटको लागि तीन पटक दोहोर्याइएको मापन गर्यौं। गलत प्रतिकृतिबाट बच्नको लागि, बिरामीलाई लिम्मा डिजाइनमा अवरोधको रूपमा समावेश गरिएको थियो। विभिन्न बिरामीहरू बीच मेटाबोलाइटहरूमा भिन्नताहरू जाँच गर्न, हामीले निश्चित तरिकाले बिरामीहरू सहित लिम्मा मोडेल समायोजन गर्यौं। हामी कोशिका प्रकार र प्याडज <0.05 (बेन्जामिनी-होचबर्ग सुधार) को सूक्ष्म वातावरण बीच पूर्व-निर्दिष्ट कन्ट्रास्टको महत्त्व रिपोर्ट गर्छौं।
मिल्टेनी डेड सेल रिमुभल किट (>८०% व्यवहार्यता) प्रयोग गरेर जोश संवर्धन पछि, १०x ५′जीन अभिव्यक्ति प्रोटोकल प्रयोग गरेर कुल जीवित जमेको जलोदर र ट्यूमर नमूनाहरूमा एकल-कोशिका ट्रान्सक्रिप्टोम अनुक्रमण गरिएको थियो। मिल्दो ट्यूमर र जलोदर भएका पाँच केसहरूको विश्लेषण गरिएको थियो, यद्यपि एउटा ट्यूमर नमूनाबाट कम व्यवहार्यताले यसको समावेशलाई रोकेको थियो। बिरामीहरूको धेरै चयनहरू प्राप्त गर्न, हामीले १०x क्रोमियम नियन्त्रकको लेनमा प्रत्येक बिरामीको नमूनाहरू संयोजन गर्यौं, र जलोदर र ट्यूमर साइटहरूको छुट्टाछुट्टै विश्लेषण गर्यौं। अनुक्रमण पछि [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp पेयर गरिएको अन्त्य (PE), क्युबेक जीनोम; ट्युमर र जलोदरको लागि प्रति कोष औसत ७३,४८८ र ४१,३७८ पढाइहरू क्रमशः]], हामीले CellSNP र Vireo (५३) प्रयोग गर्यौं (CellSNP मा आधारित GRCh38 द्वारा प्रदान गरिएको सामान्य मानव SNP (VCF) लाई दाता पहिचान तोकिएको छ। हामी बिरामीको जीनोटाइप स्थिति (IBS) को नजिकको पहिचान (IBS) अनुमान गर्न SNPRelate प्रयोग गर्छौं, डुप्लेक्सको रूपमा पहिचान नगरिएका कोषहरू र कोषहरू बाहेक र जलोदर र ट्युमर नमूनाहरू बीच मिल्दो दाताहरू (५४)। यस कार्यको आधारमा, हामीले डाउनस्ट्रीम विश्लेषणको लागि ट्युमर र जलोदरमा प्रचुर मात्रामा कोष प्रतिनिधित्व भएका तीन केसहरू राख्यौं। स्केटर (५५) र स्क्र्यान (५६) बायोकन्डक्टर प्याकेजिङमा मास फिल्ट्रेसन चरण प्रदर्शन गरेपछि, यसले विश्लेषणको लागि ६९७५ कोषहरू (क्रमशः ट्युमर र जलोदरबाट २७९२ र ४१८३ कोषहरू) प्राप्त गर्‍यौं। हामी साझा निकटतम छिमेकी नेटवर्क (SNN) को igraph's (५७) Louvain क्लस्टरिङ प्रयोग गर्छौं। अभिव्यक्तिद्वारा क्लस्टर कोषहरू सम्म ज्याकार्डको दूरी। क्लस्टरहरूलाई मार्कर जीन अभिव्यक्तिको आधारमा पुटेटिभ कोष प्रकारहरूमा म्यानुअल रूपमा एनोटेट गरिएको थियो र t-SNE सँग दृश्यीकरण गरिएको थियो। साइटोटोक्सिक T कोषहरू CD8A र GZMA को अभिव्यक्तिद्वारा परिभाषित गरिन्छ, कम राइबोसोमल प्रोटीन अभिव्यक्ति भएका उपक्लस्टरहरू बाहेक। हामीले Izar et al. (16) को प्रकाशित डेटा पहुँच गर्यौं, तिनीहरूको t-SNE इम्बेडिङ सहित, प्रतिरक्षा कोष मार्करहरू र NNMT अभिव्यक्ति बीचको अभिव्यक्ति ओभरल्याप नियन्त्रण गर्न सक्छ।
PBMC लाई Ficoll ग्रेडियन्ट डेन्सिटी सेन्ट्रीफ्यूगेशन द्वारा ल्युकोसाइट पृथकीकरण उत्पादनहरू (STEMCELL टेक्नोलोजीहरू) बाट अलग गरिएको थियो। CD3 + कोषहरूलाई CD3 मोतीहरू (मिल्टेनी) प्रयोग गरेर PBMC बाट अलग गरिएको थियो। MNA को उपस्थिति वा अनुपस्थितिमा, CD3+ कोषहरूलाई प्लेट-बाउन्ड CD3 (5μg/ml), घुलनशील CD28 (3μg/ml) र IL-2 (300 U/ml; Proleukin) द्वारा सक्रिय गरिएको थियो। विस्तारको अन्तिम दिनमा, व्यवहार्यता (फिक्सेबल भियाबिलिटी डाई eFluor450, eBioscience) र प्रसार (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) लाई प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मूल्याङ्कन गरिएको थियो। GolgiStop को साथ PMA (२० ng/ml) र ionomycin (१μg/ml) भएका कोषहरूलाई ४ घण्टासम्म उत्तेजित गरेर प्रभावकारी कार्यको मूल्याङ्कन गर्नुहोस्, र CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) र TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD) को निगरानी गर्नुहोस्। PMA (२० ng/ml) र ionomycin (१μg/ml) भएका qPCR र ChIP कोषहरूलाई ४ घण्टासम्म उत्तेजित गर्नुहोस्। ELISA सुपरनेटेन्ट PMA (२० ng/ml) र ionomycin (१ μg/ml) को साथ उत्तेजित हुनुभन्दा पहिले र पछि ४ घण्टासम्म सङ्कलन गरिएको थियो।
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) प्रयोग गरेर RNA लाई अलग गर्न निर्माताको प्रोटोकल पालना गर्नुहोस्। नमूनालाई एकरूप बनाउन QIAshredder (QIAGEN) प्रयोग गर्नुहोस्। पूरक DNA (cDNA) संश्लेषण गर्न cDNA किट (थर्मो फिशर साइन्टिफिक) मा उच्च-क्षमता RNA प्रयोग गर्नुहोस्। निम्न प्रोबहरूसँग जीन अभिव्यक्ति (निर्माताको प्रोटोकल अनुसार) मापन गर्न TaqMan Rapid Advanced Master Mix (थर्मो फिशर साइन्टिफिक) प्रयोग गर्नुहोस्: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [ग्लिसराल्डिहाइड-3-फस्फेट अफ हाइड्रोजन (GAPDH)] र Hs01010726_m1 (SLC22A2)। नमूनाहरू StepOnePlus रियल-टाइम PCR प्रणाली (एप्लाइड बायोसिस्टम) (एप्लाइड बायोसिस्टम) मा माइक्रोएम्प फास्ट अप्टिकल ९६-वेल रियाक्सन प्लेट (एप्लाइड बायोसिस्टम) मा माइक्रोएम्प अप्टिकल फिल्मको साथ चलाइएको थियो। ३५ भन्दा बढी भएको कुनै पनि Ct मान पत्ता लगाउने थ्रेसहोल्डभन्दा माथि मानिन्छ र पत्ता लगाउन नसकिने रूपमा चिन्ह लगाइन्छ।
पहिले वर्णन गरिए अनुसार ChIP गर्नुहोस् (५८)। छोटकरीमा भन्नुपर्दा, कोषहरूलाई फॉर्मल्डिहाइड (अन्तिम सांद्रता १.४२%) ले उपचार गरियो र १० मिनेटको लागि कोठाको तापक्रममा इन्क्युबेट गरियो। पूरक सूजन बफर (२५ एमएम हेप्स, १.५ एमएम एमजीसीएल२, १० एमएम केसीएल र ०.१% एनपी-४०) १० मिनेटको लागि बरफमा प्रयोग गर्नुहोस्, त्यसपछि वर्णन गरिए अनुसार इम्युनोप्रिसिपिटेशन बफरमा पुन: निलम्बन गर्नुहोस् (५८)। त्यसपछि नमूनालाई निम्न चक्रहरूसँग सोनिकेट गरिएको थियो: १० चक्र (२० १-सेकेन्ड पल्स) र ४० सेकेन्डको स्थिर समय। ४°CC मा नमूनाको साथ ChIP-ग्रेड इम्युनोग्लोबुलिन G (सेल सिग्नलिङ टेक्नोलोजी; १μl), हिस्टोन H3 (सेल सिग्नलिङ टेक्नोलोजी; ३μl), NFAT (इन्भिट्रोजन; ३μl) र SP1 (सेल सिग्नलिङ टेक्नोलोजी; ३μl) एन्टिबडीहरू रातभर शेक गर्नुहोस्। ४°C मा नमूनाको साथ प्रोटिन A बीड्स (थर्मो फिशर साइन्टिफिक) इन्क्युबेट गर्नुहोस् र १ घण्टा हल्का हल्लाएर राख्नुहोस्, त्यसपछि DNA लाई समृद्ध बनाउन चेलेक्स बीड्स (बायो-रेड) प्रयोग गर्नुहोस्, र प्रोटिन पाचनको लागि प्रोटीनेज K (थर्मो फिशर) प्रयोग गर्नुहोस्। TNFα प्रमोटर PCR द्वारा पत्ता लगाइएको थियो: अगाडि, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; यसको विपरीत, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (२०७-bp उत्पादन)। छविहरू इमेज ल्याब (बायो-रेड) द्वारा उत्पादन गरिएको थियो र इमेजजे सफ्टवेयर प्रयोग गरेर मात्रा निर्धारण गरिएको थियो।
माथि वर्णन गरिए अनुसार सेल कल्चर सुपरनाटेन्ट सङ्कलन गरिएको थियो। यो निर्धारण मानव TNFα ELISA किट (Invitrogen), मानव IL-2 ELISA किट (Invitrogen) र मानव IFN-γ ELISA किट (Abcam) को निर्माताको प्रक्रिया अनुसार गरिएको थियो। निर्माताको प्रोटोकल अनुसार, TNFα र IL-2 पत्ता लगाउन सुपरनाटेन्टलाई १:१०० र IFN-γ पत्ता लगाउन १:३ मा पातलो गरिएको थियो। ४५० nm मा अवशोषण मापन गर्न EnVision २१०४ Multilabel Reader (PerkinElmer) प्रयोग गर्नुहोस्।
PBMC लाई Ficoll ग्रेडियन्ट डेन्सिटी सेन्ट्रीफ्यूगेशनद्वारा ल्युकोसाइट सेपरेशन उत्पादनहरू (STEMCELL टेक्नोलोजीहरू) बाट अलग गरिएको थियो। CD3 + कोषहरूलाई CD3 मोतीहरू (मिल्टेनी) प्रयोग गरेर PBMC बाट अलग गरिएको थियो। MNA को उपस्थिति वा अनुपस्थितिमा, CD3+ कोषहरूलाई प्लेट-बाउन्ड CD3 (5μg/ml), घुलनशील CD28 (3μg/ml) र IL-2 (300 U/ml; Proleukin) ले 3 दिनको लागि सक्रिय गरिएको थियो। 3 दिन पछि, कोषहरूलाई सङ्कलन गरियो र 0.9% सलाइनले धोइयो, र गोलीलाई स्न्याप फ्रिज गरियो। 123count eBeads प्रयोग गरेर फ्लो साइटोमेट्री (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R कन्फिगरेसन) द्वारा कोष गणना गरिएको थियो।
माथि वर्णन गरिए अनुसार निकालिएको मेटाबोलाइटहरू। सुकेको निकालिएको ४००० सेल समतुल्य/μl को सांद्रतामा पुनर्गठन गरिएको थियो। उल्टो-चरण क्रोमेटोग्राफी (१२९० इन्फिनिटी II, एजिलेन्ट टेक्नोलोजीज, सान्ता क्लारा, CA) र CORTECS T3 स्तम्भ (२.१×१५० मिमी, कण आकार १.६-μm, छिद्र आकार १२०-Å; #१८६००८५००, वाटर्स) द्वारा नमूनाको विश्लेषण गर्नुहोस्। ध्रुवीय मास स्पेक्ट्रोमिटर (६४७०, एजिलेन्ट), जसमा इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण सकारात्मक मोडमा सञ्चालन हुन्छ। मोबाइल चरण A ०.१% फर्मिक एसिड (H2O मा), मोबाइल चरण B ९०% एसिटोनिट्राइल, ०.१% फर्मिक एसिड हो। १००% A को लागि LC ग्रेडियन्ट ० देखि २ मिनेट, ९९% B को लागि २ देखि ७.१ मिनेट, र ९९% B को लागि ७.१ देखि ८ मिनेट हुन्छ। त्यसपछि ३ मिनेटको लागि ०.६ मिली/मिनेटको प्रवाह दरमा स्तम्भलाई मोबाइल चरण A सँग पुन: सन्तुलित गर्नुहोस्। । प्रवाह दर ०.४ मिली/मिनेट छ, र स्तम्भ कक्षलाई ५०°C मा तताइएको छ। अवधारण समय (RT) र रूपान्तरण (RT = ०.८८२ मिनेट, रूपान्तरण १ = १३७→९४.१, रूपान्तरण २ = १३७→९२, रूपान्तरण ३ = १३७→७८) स्थापित गर्न MNA को शुद्ध रासायनिक मानक (M320995, टोरन्टो अनुसन्धान केमिकल कम्पनी, उत्तरी योर्क, ओन्टारियो, क्यानडा) प्रयोग गर्नुहोस्। जब सबै तीन संक्रमणहरू सही अवधारण समयमा हुन्छन्, विशिष्टता सुनिश्चित गर्न परिमाणीकरणको लागि संक्रमण १ प्रयोग गरिन्छ। MNA (टोरन्टो रिसर्च केमिकल कम्पनी) को मानक वक्र स्टक सोल्युसन (१ मिलीग्राम/मिली) को छ वटा सिरियल डिल्युसनहरू द्वारा उत्पन्न गरिएको थियो जसले क्रमशः ०.१, १.०, १० र १०० एनजी/मिली र १.० र १०μg/मिली तरल पदार्थको मापदण्ड प्राप्त गर्दछ। पत्ता लगाउने सीमा १ एनजी/मिली हो, र रेखीय प्रतिक्रिया १० एनजी/मिली र १०μg/मिली बीचको छ। नमूना र मानकको दुई माइक्रोलिटरको प्रत्येक इंजेक्शन LC/MS विश्लेषणको लागि प्रयोग गरिन्छ, र विश्लेषण प्लेटफर्मको स्थिरता सुनिश्चित गर्न प्रत्येक आठ इंजेक्शनहरूमा मिश्रित गुणस्तर नियन्त्रण नमूना चलाइन्छ। सबै MNA-उपचार गरिएका सेल नमूनाहरूको MNA प्रतिक्रियाहरू परखको रेखीय दायरा भित्र थिए। डेटा विश्लेषण मासहन्टर मात्रात्मक विश्लेषण सफ्टवेयर (v9.0, एजिलेन्ट) प्रयोग गरेर गरिएको थियो।
दोस्रो पुस्ताको αFR-CAR निर्माण Song et al. (59) बाट लिइएको हो। छोटकरीमा भन्नुपर्दा, निर्माणमा निम्न सामग्रीहरू छन्: CD8a लिडर अनुक्रम, मानव αFR-विशिष्ट एकल-श्रृंखला चर अंश, CD8a हिन्ज र ट्रान्समेम्ब्रेन क्षेत्र, CD27 इन्ट्रासेलुलर डोमेन र CD3z इन्ट्रासेलुलर डोमेन। पूर्ण CAR अनुक्रम GenScript द्वारा संश्लेषित गरिएको थियो, र त्यसपछि ट्रान्सडक्सन दक्षता मूल्याङ्कन गर्न प्रयोग गरिने GFP अभिव्यक्ति क्यासेटको दोस्रो पुस्ताको लेन्टीभाइरल अभिव्यक्ति भेक्टर अपस्ट्रीममा क्लोन गरिएको थियो।
लेन्टीभाइरस HEK293T कोषहरू [अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्सन (ATCC) को ट्रान्सफेक्सनद्वारा उत्पादन गरिन्छ; १०% भ्रूण बोवाइन सीरम (FBS) र १% पेनस्ट्रेप भएको डल्बेकोको परिमार्जित ईगल माध्यममा हुर्काइन्छ, र CAR-GFP भेक्टर प्रयोग गरिन्छ र प्याकेजिङ प्लाज्मिडहरू (psPAX2 र pMD2.G, Addgene) ले लिपोफेक्शन एमाइन (सिग्मा-एल्ड्रिच) प्रयोग गर्दछ। भाइरस युक्त सुपरनाटेन्ट ट्रान्सफेक्सनको ४८ र ७२ घण्टा पछि सङ्कलन गरिएको थियो, फिल्टर गरिएको थियो र अल्ट्रासेन्ट्रिफ्यूगेशनद्वारा केन्द्रित गरिएको थियो। ट्रान्सडक्सन नभएसम्म -८०°C मा केन्द्रित भाइरल सुपरनाटेन्ट भण्डार गर्नुहोस्।
PBMC लाई स्वस्थ दाता ल्युकोसाइट पृथकीकरण उत्पादनहरू (STEMCELL टेक्नोलोजीहरू) बाट Ficoll ग्रेडियन्ट घनत्व केन्द्रापसारक द्वारा अलग गरिएको छ। PBMC बाट CD8+ कोषहरू अलग गर्न सकारात्मक चयन CD8 माइक्रोबिड्स (मिल्टेनी) प्रयोग गर्नुहोस्। TransAct (मिल्टेनी) र TexMACS माध्यममा T कोषहरूलाई उत्तेजित गर्नुहोस् [मिल्टेनी; ३% ताप-निष्क्रिय मानव सीरम, १% पेनस्ट्रेप र IL-२ (३०० U/ml) सँग पूरक]। उत्तेजना पछि चौबीस घण्टा पछि, T कोषहरूलाई लेन्टीभाइरस (प्रति १०६ कोषहरूमा १० μl केन्द्रित भाइरस सुपरनेटेन्ट) ले ट्रान्सड्यूस गरियो। साइटेक अरोरा (FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+ मा ट्रान्सडक्शन पछि १ देखि ३ दिन पछि), कम्तिमा ३०% को ट्रान्सडक्शन दक्षता प्रदर्शन गर्न कोषहरूको GFP अभिव्यक्तिको मूल्याङ्कन गर्नुहोस्।
CAR-T कोषहरूलाई इम्युनोकल्ट (STEMCELL टेक्नोलोजीज; १% पेनस्ट्रेपको साथ पूरक) मा २४ घण्टासम्म निम्न अवस्थाहरूमा कल्चर गरिएको थियो: उपचार नगरिएको, २५० μM एडेनोसिन वा १० mM MNA ले उपचार गरिएको। पूर्व-उपचार पछि, CAR-T कोषहरूलाई PBS ले धोइयो र २०,००० SK-OV-३ कोषहरूसँग जोडियो [ATCC; McCoy 5A माध्यममा (सिग्मा-एल्ड्रिच) १०% FBS र १० मा १% पेनस्ट्रेपको साथ पूरक: १ को प्रभावकारी लक्ष्य अनुपातलाई पूरक इम्युनोकल्ट माध्यममा तीन प्रतिकृतिमा प्रवर्द्धन गरिएको थियो। डिजिटलिस स्यापोनिन (०.५mg/ml; सिग्मा-एल्ड्रिच) सँग लिज गरिएका SK-OV-३ कोषहरू र SK-OV-३ कोषहरूलाई क्रमशः नकारात्मक र सकारात्मक नियन्त्रणको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो। २४ घण्टाको सह-खेती पछि, सुपरनाटेन्ट सङ्कलन गरियो र निर्माताको निर्देशन अनुसार ल्याक्टेट डिहाइड्रोजनेज (LDH) मापन गरियो (LDH ग्लो साइटोटोक्सिसिटी एसे किट, प्रोमेगा)। LDH सुपरनाटेन्टलाई LDH बफरमा १:५० मा पातलो पारिएको थियो। मार्ने प्रतिशत निम्न सूत्र प्रयोग गरेर मापन गरिएको थियो: मार्ने प्रतिशत = सुधारको प्रतिशत / अधिकतम मार्ने दर x १००%, जहाँ सुधारको प्रतिशत = सह-संस्कृति-T कोषहरू मात्र, र अधिकतम मार्ने दर = सकारात्मक नियन्त्रण-नकारात्मक नियन्त्रण।
पाठ वा सामग्री र विधिहरूमा वर्णन गरिए अनुसार, तथ्याङ्कीय विश्लेषणको लागि ग्राफप्याड प्रिज्म ८, माइक्रोसफ्ट एक्सेल वा आर v३.६.० प्रयोग गर्नुहोस्। यदि एउटै बिरामीबाट धेरै नमूनाहरू सङ्कलन गरिन्छ (जस्तै जलोदर र ट्युमर), हामी जोडी गरिएको टी परीक्षण प्रयोग गर्छौं वा उपयुक्त भएमा रैखिक वा सामान्यीकृत मोडेलमा अनियमित प्रभावको रूपमा बिरामीलाई समावेश गर्छौं। मेटाबोलोमिक्स विश्लेषणको लागि, महत्व परीक्षण तीन प्रतिलिपिमा गरिन्छ।
यस लेखको लागि पूरक सामग्रीहरूको लागि, कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 हेर्नुहोस्।
यो क्रिएटिभ कमन्स एट्रिब्युसन-गैर-वाणिज्यिक इजाजतपत्रको सर्तहरू अन्तर्गत वितरित खुला पहुँच लेख हो, जसले कुनै पनि माध्यममा प्रयोग, वितरण र पुनरुत्पादनलाई अनुमति दिन्छ, जबसम्म अन्तिम प्रयोग व्यावसायिक लाभको लागि होइन र आधार यो हो कि मूल काम सही छ। सन्दर्भ।
नोट: हामी तपाईंलाई आफ्नो इमेल ठेगाना प्रदान गर्न अनुरोध गर्छौं ताकि तपाईंले पृष्ठमा सिफारिस गर्नुभएको व्यक्तिलाई थाहा होस् कि तपाईं उनीहरूले इमेल देखून् र यो स्प्याम होइन। हामी कुनै पनि इमेल ठेगानाहरू कैद गर्ने छैनौं।
यो प्रश्न तपाईं आगन्तुक हुनुहुन्छ कि हुनुहुन्न भनेर परीक्षण गर्न र स्वचालित स्पाम सबमिशन रोक्न प्रयोग गरिन्छ।
मारिसा के. किलगौर (मारिसा के. किलगौर), सारा म्याकफर्सन (सारा म्याकफर्सन), लरेन जी. जाकारियास (लरेन जी. जाकारियास), अबिगेल एली एरिस जी. वाटसन (एच. वाटसन), जोन स्ट्याग (जोन स्ट्याग), ब्राड एच. नेल्सन (ब्राड एच. एन. आर. बेल) डेबेरार्डिनिस), रसेल जी. जोन्स (रसेल जी. जोन्स), फिनीस टी. ह्यामिल्टन (फिनीस टी।
MNA ले T कोषहरूको प्रतिरक्षा दमनमा योगदान पुर्‍याउँछ र मानव क्यान्सरको उपचारको लागि सम्भावित इम्युनोथेरापी लक्ष्यको प्रतिनिधित्व गर्दछ।
मारिसा के. किलगौर (मारिसा के. किलगौर), सारा म्याकफर्सन (सारा म्याकफर्सन), लरेन जी. जाकारियास (लरेन जी. जाकारियास), अबिगेल एली एरिस जी. वाटसन (एच. वाटसन), जोन स्ट्याग (जोन स्ट्याग), ब्राड एच. नेल्सन (ब्राड एच. एन. आर. बेल) डेबेरार्डिनिस), रसेल जी. जोन्स (रसेल जी. जोन्स), फिनीस टी. ह्यामिल्टन (फिनीस टी।
MNA ले T कोषहरूको प्रतिरक्षा दमनमा योगदान पुर्‍याउँछ र मानव क्यान्सरको उपचारको लागि सम्भावित इम्युनोथेरापी लक्ष्यको प्रतिनिधित्व गर्दछ।
©२०२१ अमेरिकन एसोसिएशन फर द एडभान्समेन्ट अफ साइन्स। सबै अधिकार सुरक्षित। AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef र COUNTER को साझेदार हो। ScienceAdvances ISSN 2375-2548।