प्रोपियोनिक एसिड (PPA), एक एन्टिफंगल एजेन्ट र सामान्य आहार योजक, मुसाहरूमा असामान्य न्यूरोडेभलपमेन्ट निम्त्याउने देखाइएको छ जसमा ग्यास्ट्रोइंटेस्टाइनल डिसफंक्शन हुन्छ, जुन आन्द्राको डिस्बायोसिसको कारणले हुन सक्छ। आहार PPA एक्सपोजर र आन्द्राको माइक्रोबायोटा डिस्बायोसिस बीचको सम्बन्ध सुझाव दिइएको छ, तर प्रत्यक्ष रूपमा अनुसन्धान गरिएको छैन। यहाँ, हामीले आन्द्राको माइक्रोबायोटा संरचनामा PPA-सम्बन्धित परिवर्तनहरूको अनुसन्धान गर्यौं जसले डिस्बायोसिस निम्त्याउन सक्छ। मुसाहरूको आन्द्राको माइक्रोबायोमहरूलाई उपचार नगरिएको आहार (n=9) र PPA-समृद्ध आहार (n=13) खुवाइएको थियो जसले माइक्रोबियल संरचना र ब्याक्टेरिया मेटाबोलिक मार्गहरूमा भिन्नताहरू मूल्याङ्कन गर्न लामो-दायरा मेटाजेनोमिक अनुक्रमण प्रयोग गरेर क्रमबद्ध गरिएको थियो। आहार PPA धेरै ब्याक्टेरोइड्स, प्रिभोटेला, र रुमिनोकोकस प्रजातिहरू सहित महत्त्वपूर्ण ट्याक्साको प्रशस्ततामा वृद्धिसँग सम्बन्धित थियो, जसका सदस्यहरू पहिले PPA उत्पादनमा संलग्न थिए। PPA-एक्सपोजर गरिएका मुसाहरूको माइक्रोबायोमहरूमा लिपिड मेटाबोलिज्म र स्टेरोइड हार्मोन बायोसिन्थेसिससँग सम्बन्धित थप मार्गहरू पनि थिए। हाम्रा नतिजाहरूले संकेत गर्छन् कि PPA ले आन्द्राको माइक्रोबायोटा र यसको सम्बन्धित मेटाबोलिक मार्गहरूलाई परिवर्तन गर्न सक्छ। यी अवलोकन गरिएका परिवर्तनहरूले उपभोगको लागि सुरक्षित भनेर वर्गीकृत गरिएका संरक्षकहरूले पेटको माइक्रोबायोटाको संरचना र फलस्वरूप मानव स्वास्थ्यलाई असर गर्न सक्छन् भन्ने कुरालाई प्रकाश पार्छ।
मानव माइक्रोबायोमलाई प्रायः "शरीरको अन्तिम अंग" भनेर चिनिन्छ र यसले मानव स्वास्थ्यमा महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छ (बाक्वेरो र नोम्बेला, २०१२)। विशेष गरी, आन्द्राको माइक्रोबायोम यसको प्रणाली-व्यापी प्रभाव र धेरै आवश्यक कार्यहरूमा भूमिकाको लागि मान्यता प्राप्त छ। कोमेन्सल ब्याक्टेरिया आन्द्रामा प्रचुर मात्रामा पाइन्छ, धेरै पारिस्थितिक निचहरू ओगटेको छ, पोषक तत्वहरू प्रयोग गर्दछ, र सम्भावित रोगजनकहरूसँग प्रतिस्पर्धा गर्दछ (जन्ध्याला एट अल।, २०१५)। आन्द्राको माइक्रोबायोटाका विविध ब्याक्टेरिया घटकहरूले भिटामिन जस्ता आवश्यक पोषक तत्वहरू उत्पादन गर्न र पाचनलाई प्रवर्द्धन गर्न सक्षम छन् (रोल्याण्ड एट अल।, २०१८)। ब्याक्टेरिया मेटाबोलाइटहरूले तन्तु विकासलाई प्रभाव पार्ने र चयापचय र प्रतिरक्षा मार्गहरू बढाउने देखाइएको छ (हेइज्ट्ज एट अल।, २०११; यु एट अल।, २०२२)। मानव आन्द्राको माइक्रोबायोमको संरचना अत्यन्तै विविध छ र आहार, लिङ्ग, औषधि र स्वास्थ्य स्थिति जस्ता आनुवंशिक र वातावरणीय कारकहरूमा निर्भर गर्दछ (कुम्भरे एट अल।, २०१९)।
मातृ आहार भ्रूण र नवजात शिशुको विकासको एक महत्वपूर्ण घटक हो र विकासलाई प्रभाव पार्न सक्ने यौगिकहरूको अनुमानित स्रोत हो (बाजर एट अल।, २००४; इनिस, २०१४)। त्यस्तै एउटा चासोको यौगिक प्रोपियोनिक एसिड (पीपीए) हो, जुन ब्याक्टेरिया किण्वन र खाद्य योजकबाट प्राप्त छोटो-श्रृंखला फ्याटी एसिड उप-उत्पादन हो (डेन बेस्टेन एट अल।, २०१३)। पीपीएमा जीवाणुरोधी र एन्टिफंगल गुणहरू छन् र त्यसैले यसलाई खाद्य संरक्षकको रूपमा र मोल्ड र ब्याक्टेरियाको वृद्धिलाई रोक्न औद्योगिक अनुप्रयोगहरूमा प्रयोग गरिन्छ (वेमेनहोभ एट अल।, २०१६)। पीपीएको विभिन्न तन्तुहरूमा फरक प्रभाव हुन्छ। कलेजोमा, पीपीएको म्याक्रोफेजहरूमा साइटोकाइन अभिव्यक्तिलाई असर गरेर एन्टी-इन्फ्लेमेटरी प्रभाव हुन्छ (कावासो एट अल।, २०२२)। यो नियामक प्रभाव अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाहरूमा पनि अवलोकन गरिएको छ, जसले गर्दा सूजनको नियमन घट्छ (हासे एट अल।, २०२१)। यद्यपि, मस्तिष्कमा विपरीत प्रभाव अवलोकन गरिएको छ। अघिल्ला अध्ययनहरूले देखाएका छन् कि PPA एक्सपोजरले मुसाहरूमा अटिजम जस्तो व्यवहारलाई प्रेरित गर्छ (एल-अन्सारी एट अल।, २०१२)। अन्य अध्ययनहरूले देखाएका छन् कि PPA ले ग्लियोसिसलाई प्रेरित गर्न सक्छ र मस्तिष्कमा प्रो-इन्फ्लेमेटरी मार्गहरू सक्रिय गर्न सक्छ (अब्डेली एट अल।, २०१९)। किनभने PPA एक कमजोर एसिड हो, यो आन्द्राको एपिथेलियम मार्फत रक्तप्रवाहमा फैलिन सक्छ र यसरी रगत-मस्तिष्क अवरोध साथै प्लेसेन्टा सहित प्रतिबन्धात्मक अवरोधहरू पार गर्न सक्छ (स्टिन्सन एट अल।, २०१९), ब्याक्टेरियाद्वारा उत्पादित नियामक मेटाबोलाइटको रूपमा PPA को महत्त्वलाई हाइलाइट गर्दै। यद्यपि अटिजमको लागि जोखिम कारकको रूपमा PPA को सम्भावित भूमिका हाल अनुसन्धान अन्तर्गत छ, अटिजम भएका व्यक्तिहरूमा यसको प्रभाव तंत्रिका भिन्नतालाई प्रेरित गर्नुभन्दा बाहिर जान सक्छ।
स्नायु विकास विकार भएका बिरामीहरूमा पखाला र कब्जियत जस्ता ग्यास्ट्रोइंटेस्टाइनल लक्षणहरू सामान्य हुन्छन् (काओ एट अल।, २०२१)। अघिल्ला अध्ययनहरूले देखाएका छन् कि अटिजम स्पेक्ट्रम विकार (ASD) भएका बिरामीहरूको माइक्रोबायोम स्वस्थ व्यक्तिहरूको भन्दा फरक हुन्छ, जसले आन्द्राको माइक्रोबायोटा डिस्बायोसिसको उपस्थितिलाई सुझाव दिन्छ (फाइनेगोल्ड एट अल।, २०१०)। त्यस्तै गरी, सूजन आन्द्रा रोग, मोटोपना, अल्जाइमर रोग, आदि भएका बिरामीहरूको माइक्रोबायोम विशेषताहरू पनि स्वस्थ व्यक्तिहरूको भन्दा फरक हुन्छन् (टर्नबाग एट अल।, २००९; भोग्ट एट अल।, २०१७; हेन्के एट अल।, २०१९)। यद्यपि, आजसम्म, आन्द्राको माइक्रोबायोम र स्नायु रोगहरू वा लक्षणहरू बीच कुनै कारण सम्बन्ध स्थापित भएको छैन (याप एट अल।, २०२१), यद्यपि धेरै ब्याक्टेरिया प्रजातिहरूले यी केही रोग अवस्थाहरूमा भूमिका खेल्ने सोचाइ छ। उदाहरणका लागि, अटिजम भएका बिरामीहरूको माइक्रोबायोटामा अक्करमेन्सिया, ब्याक्टेरोइड्स, क्लोस्ट्रिडियम, ल्याक्टोबैसिलस, डेसल्फोभिब्रिओ र अन्य जेनेराहरू बढी प्रचुर मात्रामा हुन्छन् (टोमोभा एट अल।, २०१५; गोलुबेभा एट अल।, २०१७; क्रिस्टियानो एट अल।, २०१८; जुरिता एट अल।, २०२०)। उल्लेखनीय रूपमा, यी जेनेराका केही सदस्य प्रजातिहरूमा पीपीए उत्पादनसँग सम्बन्धित जीनहरू हुन्छन् भनेर चिनिन्छ (रेचार्ड एट अल।, २०१४; युन र ली, २०१६; झाङ एट अल।, २०१९; बाउर र डुरे, २०२३)। पीपीएको एन्टिमाइक्रोबियल गुणहरूलाई ध्यानमा राख्दै, यसको प्रचुरता बढाउनु पीपीए-उत्पादक ब्याक्टेरियाको वृद्धिको लागि लाभदायक हुन सक्छ (ज्याकबसन एट अल।, २०१८)। यसरी, पीएफए-समृद्ध वातावरणले पेटको माइक्रोबायोटामा परिवर्तन ल्याउन सक्छ, जसमा जठरांत्र रोगजनकहरू पनि समावेश छन्, जुन जठरांत्र लक्षणहरू निम्त्याउने सम्भावित कारक हुन सक्छन्।
माइक्रोबायोम अनुसन्धानमा एउटा केन्द्रीय प्रश्न भनेको माइक्रोबियल संरचनामा भिन्नता अन्तर्निहित रोगहरूको कारण वा लक्षण हो कि होइन भन्ने हो। आहार, पेटको माइक्रोबायोम र स्नायु रोगहरू बीचको जटिल सम्बन्धलाई स्पष्ट पार्ने पहिलो चरण भनेको माइक्रोबियल संरचनामा आहारको प्रभावहरूको मूल्याङ्कन गर्नु हो। यस उद्देश्यका लागि, हामीले PPA-युक्त वा PPA-मुक्त आहार खुवाइएका मुसाका सन्तानको आन्द्राको माइक्रोबायोमहरूको तुलना गर्न लामो-पढिएको मेटाजेनोमिक अनुक्रमण प्रयोग गर्यौं। सन्तानलाई तिनीहरूका आमाहरूले जस्तै आहार खुवाइयो। हामीले परिकल्पना गर्यौं कि PPA-युक्त आहारले आन्द्राको माइक्रोबियल संरचना र माइक्रोबियल कार्यात्मक मार्गहरूमा परिवर्तन ल्याउनेछ, विशेष गरी PPA चयापचय र/वा PPA उत्पादनसँग सम्बन्धित।
यस अध्ययनले FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J ट्रान्सजेनिक मुसाहरू (ज्याक्सन ल्याबोरेटरीज) प्रयोग गर्‍यो जसले सेन्ट्रल फ्लोरिडा विश्वविद्यालयको संस्थागत पशु हेरचाह र प्रयोग समिति (UCF-IACUC) (पशु प्रयोग अनुमति नम्बर: PROTO202000002) को दिशानिर्देशहरू पालना गर्दै ग्लिया-विशिष्ट GFAP प्रमोटरको नियन्त्रणमा हरियो फ्लोरोसेन्ट प्रोटीन (GFP) लाई ओभरएक्सप्रेस गर्दछ। दूध छुटाएपछि, मुसाहरूलाई प्रत्येक पिंजरामा प्रत्येक लिङ्गको १-५ मुसाको साथ पिंजराहरूमा व्यक्तिगत रूपमा राखिएको थियो। मुसाहरूलाई शुद्ध नियन्त्रण आहार (परिमार्जित खुला-लेबल मानक आहार, १६ kcal% फ्याट) वा सोडियम प्रोपियोनेट-पूरक आहार (परिमार्जित खुला-लेबल मानक आहार, १६ kcal% फ्याट, ५,००० ppm सोडियम प्रोपियोनेट समावेश) खुवाइएको थियो। प्रयोग गरिएको सोडियम प्रोपियोनेटको मात्रा ५,००० मिलीग्राम PFA/किग्रा कुल खाद्य तौल बराबर थियो। यो खाद्य संरक्षकको रूपमा प्रयोगको लागि स्वीकृत PPA को उच्चतम सांद्रता हो। यस अध्ययनको तयारीको लागि, अभिभावक मुसाहरूलाई संभोग गर्नुभन्दा ४ हप्ता अघि दुवै आहार खुवाइयो र बाँदरको गर्भावस्थाभरि जारी राखियो। सन्तान मुसाहरू [२२ मुसा, ९ नियन्त्रण (६ भाले, ३ पोथी) र १३ पीपीए (४ भाले, ९ पोथी)] लाई दूध छुटाइयो र त्यसपछि ५ महिनासम्म बाँदर जस्तै आहारमा जारी राखियो। सन्तान मुसाहरूलाई ५ महिनाको उमेरमा बलिदान दिइयो र तिनीहरूको आन्द्राको दिसा सामग्रीहरू सङ्कलन गरियो र सुरुमा १.५ मिलीलीटर माइक्रोसेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबहरूमा -२० डिग्री सेल्सियसमा भण्डारण गरियो र त्यसपछि होस्ट डीएनए समाप्त नभएसम्म र माइक्रोबियल न्यूक्लिक एसिडहरू निकालिएसम्म -८० डिग्री सेल्सियस फ्रिजरमा स्थानान्तरण गरियो।
परिमार्जित प्रोटोकल (Charalampous et al., 2019) अनुसार होस्ट DNA हटाइयो। संक्षेपमा, मल सामग्रीहरू 500 µl InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) मा स्थानान्तरण गरियो र जमेको भण्डारण गरियो। प्रति निकासी अधिकतम 1-2 मल गोलीहरू प्रशोधन गरियो। त्यसपछि मल सामग्रीहरू ट्यूब भित्र प्लास्टिकको मुसल प्रयोग गरेर यान्त्रिक रूपमा एकरूप गरियो जसले स्लरी बनाउँछ। नमूनाहरूलाई 5 मिनेटको लागि वा नमूनाहरू गोली नभएसम्म 10,000 RCF मा केन्द्रित गर्नुहोस्, त्यसपछि सुपरनेटेन्टलाई एस्पिरेट गर्नुहोस् र गोलीलाई 250 µl 1× PBS मा पुन: निलम्बन गर्नुहोस्। युकेरियोटिक कोशिका झिल्लीहरू खुकुलो पार्न डिटर्जेन्टको रूपमा नमूनामा 250 µl 4.4% saponin घोल (TCI, उत्पादन नम्बर S0019) थप्नुहोस्। नमूनाहरू चिल्लो नभएसम्म बिस्तारै मिसाइयो र 10 मिनेटको लागि कोठाको तापक्रममा इन्क्युबेट गरियो। त्यसपछि, युकेरियोटिक कोषहरूलाई विघटन गर्न, नमूनामा ३५० μl न्यूक्लिज-मुक्त पानी थपियो, ३० सेकेन्डको लागि इन्क्युबेट गरियो, र त्यसपछि १२ μl ५ M NaCl थपियो। त्यसपछि नमूनाहरूलाई ५ मिनेटको लागि ६००० RCF मा सेन्ट्रीफ्यूज गरियो। सुपरनेटेन्टलाई एस्पिरेट गर्नुहोस् र १०० μl १X PBS मा गोलीलाई पुन: निलम्बन गर्नुहोस्। होस्ट DNA हटाउन, १०० μl HL-SAN बफर (१२.८५६८ ग्राम NaCl, ४ मिली १M MgCl२, ३६ मिली न्यूक्लिज-मुक्त पानी) र १० μl HL-SAN इन्जाइम (ArticZymes P/N ७०९१०-२०२) थप्नुहोस्। नमुनाहरूलाई पाइपेटिङद्वारा राम्ररी मिसाइयो र Eppendorf™ ThermoMixer C मा ८०० rpm मा ३० मिनेटको लागि ३७ °C मा इन्क्युबेट गरियो। इन्क्युबेट गरेपछि, ६००० RCF मा ३ मिनेटको लागि सेन्ट्रीफ्यूज गरियो र ८०० µl र १००० µl १X PBS ले दुई पटक धोइयो। अन्तमा, १०० µl १X PBS मा गोली पुन: निलम्बन गरियो।
न्यू इङ्गल्याण्ड बायोल्याब्स मोनार्क जीनोमिक डीएनए शुद्धीकरण किट (न्यू इङ्गल्याण्ड बायोल्याब्स, इप्सविच, एमए, क्याट# T3010L) प्रयोग गरेर कुल ब्याक्टेरियाको डीएनए अलग गरिएको थियो। किटसँग प्रदान गरिएको मानक सञ्चालन प्रक्रिया थोरै परिमार्जन गरिएको छ। अन्तिम उत्सर्जनको लागि सञ्चालन गर्नु अघि 60°C मा न्यूक्लियस-मुक्त पानी इन्क्युबेट गर्नुहोस् र राख्नुहोस्। प्रत्येक नमूनामा 10 µl प्रोटीनेज K र 3 µl RNase A थप्नुहोस्। त्यसपछि 100 µl सेल लाइसिस बफर थप्नुहोस् र बिस्तारै मिश्रण गर्नुहोस्। त्यसपछि नमूनाहरूलाई Eppendorf™ ThermoMixer C मा 56°C र 1400 rpm मा कम्तिमा 1 घण्टा र 3 घण्टासम्म इन्क्युबेट गरिएको थियो। इन्क्युबेट गरिएका नमूनाहरूलाई 12,000 RCF मा 3 मिनेटको लागि सेन्ट्रीफ्यूज गरिएको थियो र प्रत्येक नमूनाबाट सुपरनेटेन्टलाई 400 µL बाइन्डिङ घोल भएको छुट्टै 1.5 mL माइक्रोसेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबमा स्थानान्तरण गरिएको थियो। त्यसपछि ट्यूबहरूलाई १ सेकेन्ड अन्तरालमा ५-१० सेकेन्डको लागि पल्स भोर्टेक्स गरियो। प्रत्येक नमूनाको सम्पूर्ण तरल पदार्थ (लगभग ६००-७०० µL) लाई फ्लो-थ्रु सङ्कलन ट्यूबमा राखिएको फिल्टर कार्ट्रिजमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्। प्रारम्भिक DNA बाइन्डिङलाई अनुमति दिन ट्यूबहरूलाई ३ मिनेटको लागि १,००० RCF मा सेन्ट्रीफ्यूज गरियो र त्यसपछि अवशिष्ट तरल पदार्थ हटाउन १ मिनेटको लागि १२,००० RCF मा सेन्ट्रीफ्यूज गरियो। नमूना स्तम्भलाई नयाँ सङ्कलन ट्यूबमा स्थानान्तरण गरियो र त्यसपछि दुई पटक धोइयो। पहिलो धुलाईको लागि, प्रत्येक ट्यूबमा ५०० µL वाश बफर थप्नुहोस्। ट्यूबलाई ३-५ पटक उल्टाउनुहोस् र त्यसपछि १ मिनेटको लागि १२,००० RCF मा सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस्। सङ्कलन ट्यूबबाट तरल पदार्थ खारेज गर्नुहोस् र फिल्टर कार्ट्रिजलाई उही सङ्कलन ट्यूबमा फिर्ता राख्नुहोस्। दोस्रो धुलाईको लागि, उल्टो नगरी फिल्टरमा ५०० µL वाश बफर थप्नुहोस्। नमूनाहरूलाई १ मिनेटको लागि १२,००० RCF मा सेन्ट्रीफ्यूज गरियो। फिल्टरलाई १.५ एमएल लोबाइन्ड® ट्यूबमा स्थानान्तरण गर्नुहोस् र १०० µL पूर्व-तातो न्यूक्लिज-मुक्त पानी थप्नुहोस्। फिल्टरहरूलाई कोठाको तापक्रममा १ मिनेटको लागि इन्क्युबेट गरिएको थियो र त्यसपछि १२,००० आरसीएफमा १ मिनेटको लागि सेन्ट्रीफ्यूज गरिएको थियो। एल्युटेड डीएनए -८०°C मा भण्डारण गरिएको थियो।
Qubit™ 4.0 फ्लोरोमिटर प्रयोग गरेर DNA सांद्रता मापन गरिएको थियो। निर्माताको निर्देशन अनुसार Qubit™ 1X dsDNA उच्च संवेदनशीलता किट (Cat. No. Q33231) प्रयोग गरेर DNA तयार गरिएको थियो। DNA खण्ड लम्बाइ वितरण Aglient™ 4150 वा 4200 TapeStation प्रयोग गरेर मापन गरिएको थियो। Agilent™ जीनोमिक DNA अभिकर्मक (Cat. No. 5067-5366) र Genomic DNA स्क्रिनटेप (Cat. No. 5067-5365) प्रयोग गरेर DNA तयार गरिएको थियो। निर्माताको निर्देशन अनुसार Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) प्रयोग गरेर पुस्तकालय तयारी गरिएको थियो। Min106D फ्लो सेल (R 9.4.1) को साथ ONT Gridion™ Mk1 सिक्वेन्सर प्रयोग गरेर DNA अनुक्रमित गरिएको थियो। अनुक्रम सेटिङहरू थिए: उच्च सटीकता आधार कलिङ, न्यूनतम q मान 9, बारकोड सेटअप, र बारकोड ट्रिम। नमूनाहरूलाई ७२ घण्टाको लागि अनुक्रमित गरिएको थियो, त्यसपछि थप प्रशोधन र विश्लेषणको लागि आधार कल डेटा पेश गरिएको थियो।
बायोइन्फर्मेटिक्स प्रशोधन पहिले वर्णन गरिएका विधिहरू प्रयोग गरेर गरिएको थियो (ग्रीनम्यान एट अल।, २०२४)। अनुक्रमणबाट प्राप्त FASTQ फाइलहरूलाई प्रत्येक नमूनाको लागि निर्देशिकाहरूमा विभाजन गरिएको थियो। बायोइन्फर्मेटिक्स विश्लेषण गर्नु अघि, डेटा निम्न पाइपलाइन प्रयोग गरेर प्रशोधन गरिएको थियो: पहिले, नमूनाहरूको FASTQ फाइलहरूलाई एकल FASTQ फाइलमा मर्ज गरिएको थियो। त्यसपछि, १००० bp भन्दा कम पढ्नेहरूलाई Filtlong v. ०.२.१ प्रयोग गरेर फिल्टर गरिएको थियो, जसमा एक मात्र प्यारामिटर परिवर्तन गरिएको थियो –min_length १००० (विक, २०२४)। थप फिल्टर गर्नु अघि, पढ्ने गुणस्तरलाई निम्न प्यारामिटरहरू सहित NanoPlot v. १.४१.३ प्रयोग गरेर नियन्त्रण गरिएको थियो: –fastq –plots dot –N50 -o(De Coster and Rademakers, 2023)। निम्न प्यारामिटरहरू सहित होस्ट-दूषित रिडहरू हटाउन minimap2 v. 2.24-r1122 प्रयोग गरेर माउस सन्दर्भ जीनोम GRCm39 (GCF_000001635.27) मा पठनहरू पङ्क्तिबद्ध गरिएको थियो: -L -ax map-ont(ली, २०१८)। उत्पन्न गरिएका पङ्क्तिबद्ध फाइलहरूलाई samtools v. 1.16.1 मा samtools view -b (Danecek et al., 2021) प्रयोग गरेर BAM ढाँचामा रूपान्तरण गरिएको थियो। त्यसपछि samtools view -b -f 4 प्रयोग गरेर अनअलाइन गरिएका पठनहरू पहिचान गरिएको थियो, जसले यी पठनहरू होस्ट जीनोमसँग सम्बन्धित थिएनन् भनेर संकेत गर्दछ। पूर्वनिर्धारित प्यारामिटरहरू सहित samtools bam2fq प्रयोग गरेर अनअलाइन गरिएका पठनहरूलाई FASTQ ढाँचामा रूपान्तरण गरिएको थियो। पहिले वर्णन गरिएका सेटिङहरू प्रयोग गरेर थप फिल्टर गरिएका पठनहरूमा NanoPlot पुन: चलाइएको थियो। फिल्टर गरेपछि, निम्न प्यारामिटरहरू सहित मेटाफ्लाइ v. 2.8.2-b1689 प्रयोग गरेर मेटाजेनोमिक डेटा भेला गरिएको थियो: –nano-raw–meta (Kolmogorov et al., 2020)। बाँकी प्यारामिटरहरूलाई तिनीहरूको पूर्वनिर्धारित मानहरूमा छोड्नुहोस्। एसेम्बली पछि, फिल्टर गरिएको रिडहरू minimap2 प्रयोग गरेर एसेम्बलीमा म्याप गरिएको थियो, र -ax map-ont प्यारामिटर SAM ढाँचामा पङ्क्तिबद्ध फाइल उत्पन्न गर्न प्रयोग गरिएको थियो। एसेम्बलीलाई पहिले निम्न प्यारामिटरहरू सहित racon v. 1.4.20 प्रयोग गरेर परिष्कृत गरिएको थियो: -m 8 -x -6 -g -8 -w 500 -u (Vaser et al., 2017)। racon पूरा भएपछि, यसलाई medaka v. 1.7.2 सँग थप परिष्कृत गरिएको थियो, medaka_consesus प्रयोग गरेर, -m प्यारामिटर बाहेक सबै प्यारामिटरहरू तिनीहरूको पूर्वनिर्धारित मानहरूमा छोडिएको थियो। हाम्रो डेटाको लागि प्रयोग गरिएको प्रवाह सेल रसायन विज्ञान र उच्च-शुद्धता आधार कलिङ निर्दिष्ट गर्न -m प्यारामिटर r941_min_hac_g507 मा सेट गरिएको छ (nanoporetech/medaka, 2024)। फिल्टर गरिएको डेटा (यसपछि माइक्रोबियल डेटा भनिन्छ) र अन्तिम सफा गरिएको संयोजन पछिको विश्लेषणको लागि प्रयोग गरियो।
वर्गीकरण वर्गीकरणको लागि, Kraken2 v. 2.1.2 (वुड एट अल।, २०१९) प्रयोग गरेर पठन र भेला गरिएका कन्टिगहरूलाई वर्गीकृत गरिएको थियो। क्रमशः पठन र भेलाहरूको लागि रिपोर्टहरू र आउटपुट फाइलहरू उत्पन्न गर्नुहोस्। पठन र भेलाहरूको विश्लेषण गर्न -उपयोग-नामहरू विकल्प प्रयोग गर्नुहोस्। पढ्ने खण्डहरूको लागि -gzip-संकुचित र -जोडा गरिएका विकल्पहरू निर्दिष्ट गरिएका छन्। मेटाजेनोमहरूमा ट्याक्साको सापेक्षिक प्रशस्तता Bracken v. 2.8 (लु एट अल।, २०१७) प्रयोग गरेर अनुमान गरिएको थियो। हामीले पहिले निम्न प्यारामिटरहरू सहित bracken-build प्रयोग गरेर १००० आधारहरू भएको kmer डाटाबेस सिर्जना गर्यौं: -d-k ३५ -l १००० एक पटक निर्माण भएपछि, ब्रेकेन kraken2 द्वारा उत्पन्न रिपोर्टको आधारमा चल्छ र निम्न विकल्पहरू प्रयोग गरेर डेटा फिल्टर गर्दछ: -d -I -O-पृ १००० -ल

ती मध्ये, विश्लेषण गरिँदै गरेको वर्गीकरण स्तरको आधारमा P, G वा S चयन गरिन्छ। गलत सकारात्मक वर्गीकरणको प्रभावलाई कम गर्न, 1e-4 (1/10,000 पठन) को न्यूनतम सापेक्षिक प्रशस्तता थ्रेसहोल्ड अपनाइएको थियो। तथ्याङ्कीय विश्लेषण गर्नु अघि, ब्रेकेन (fraction_total_reads) द्वारा रिपोर्ट गरिएको सापेक्षिक प्रशस्तता केन्द्रित लग-अनुपात (CLR) रूपान्तरण (Aitchison, 1982) प्रयोग गरेर रूपान्तरण गरिएको थियो। CLR विधि डेटा रूपान्तरणको लागि छनोट गरिएको थियो किनभने यो स्केल-अपरिवर्तनीय छ र गैर-स्पर्स डेटासेटहरूको लागि पर्याप्त छ (Gloor et al., 2017)। CLR रूपान्तरणले प्राकृतिक लोगारिदम प्रयोग गर्दछ। ब्रेकेन द्वारा रिपोर्ट गरिएको गणना डेटा सापेक्षिक लग अभिव्यक्ति (RLE) (Anders and Huber, 2010) प्रयोग गरेर सामान्यीकृत गरिएको थियो। matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 र अनुक्रमिक लोगारिदम (Gloor et al., 2017) को संयोजन प्रयोग गरेर तथ्याङ्कहरू उत्पन्न गरिएको थियो। ०.१२.२ र स्ट्यान्टानोटेसनहरू v. ०.५.० (हन्टर, २००७; वास्कोम, २०२१; चार्लियर एट अल।, २०२२)। प्रत्येक नमूनाको लागि सामान्यीकृत ब्याक्टेरिया गणना प्रयोग गरेर ब्यासिलस/ब्याक्टेरोइडेट्स अनुपात गणना गरिएको थियो। तालिकाहरूमा रिपोर्ट गरिएका मानहरू ४ दशमलव स्थानमा गोलाकार छन्। सिम्पसन विविधता सूचकांक KrakenTools v. १.२ प्याकेज (Lu एट अल।, २०२२) मा प्रदान गरिएको alpha_diversity.py लिपि प्रयोग गरेर गणना गरिएको थियो। ब्रेकेन रिपोर्ट स्क्रिप्टमा प्रदान गरिएको छ र -an प्यारामिटरको लागि सिम्पसन सूचकांक "Si" प्रदान गरिएको छ। प्रशस्ततामा महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरूलाई औसत CLR भिन्नताहरू ≥ १ वा ≤ -१ को रूपमा परिभाषित गरिएको थियो। ±१ को औसत CLR भिन्नताले नमूना प्रकारको प्रशस्ततामा २.७ गुणा वृद्धिलाई जनाउँछ। चिन्ह (+/-) ले PPA नमूना र नियन्त्रण नमूनामा क्रमशः ट्याक्सन बढी प्रचुर मात्रामा छ कि छैन भनेर संकेत गर्दछ। मान-ह्विटनी यू परीक्षण (भिर्टानेन एट अल।, २०२०) प्रयोग गरेर महत्व निर्धारण गरिएको थियो। स्ट्याट्समोडेलहरू v. ०.१४ (बेन्जामिनी र होचबर्ग, १९९५; सिबोल्ड र पर्कटोल्ड, २०१०) प्रयोग गरिएको थियो, र धेरै परीक्षणहरूको लागि सुधार गर्न बेन्जामिनी-होचबर्ग प्रक्रिया लागू गरिएको थियो। सांख्यिकीय महत्व निर्धारण गर्न थ्रेसहोल्डको रूपमा समायोजित p-मान ≤ ०.०५ प्रयोग गरिएको थियो।
जीन एनोटेसन र सापेक्षिक प्रशस्तता अनुमान Maranga et al. (Maranga et al., 2023) द्वारा वर्णन गरिएको प्रोटोकलको परिमार्जित संस्करण प्रयोग गरेर गरिएको थियो। पहिले, SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016) प्रयोग गरेर सबै एसेम्बलीहरूबाट 500 bp भन्दा कम कन्टिगहरू हटाइयो। त्यसपछि चयन गरिएका एसेम्बलीहरूलाई प्यान-मेटाजेनोममा जोडियो। निम्न प्यारामिटरहरू सहित Prodigal v. 1.0.1 (Prodigal v. 2.6.3 को समानान्तर संस्करण) प्रयोग गरेर खुला पठन फ्रेमहरू (ORFs) पहिचान गरियो: -d-f gff-i -O-T 24 -p meta -C 10000 (Hyett et al., 2012; Jaenicke, 2024)। त्यसपछि सबै अपूर्ण जीनहरू हटाउन पाइथन प्रयोग गरेर परिणामस्वरूप न्यूक्लियोटाइड फाइलहरू फिल्टर गरियो। त्यसपछि CD-HIT v. 4.8.1 निम्न प्यारामिटरहरू सहित जीनहरूलाई क्लस्टर गर्न प्रयोग गरियो: cd-hit-est -i -O-c ०.९५ -s ०.८५ -aS ०.९ -n १० -d २५६ -M ३५०००० -T २४ -l १०० -g १ (Fu et al., २०१२)। उत्पन्न गरिएको गैर-अनावश्यक जीन क्याटलग जीन प्रशस्तता र एनोटेसन अनुमान गर्न प्रयोग गरिएको थियो। KMA v. १.४.९ (Clausen et al., २०१८) प्रयोग गरेर सापेक्ष जीन प्रशस्तता अनुमान गरिएको थियो। पहिले, निम्न प्यारामिटरहरू सहित KMA अनुक्रमणिका प्रयोग गरेर अनुक्रमणिका फाइल सिर्जना गर्नुहोस्: -i -Oत्यसपछि, बायोइन्फर्मेटिक्स पाइपलाइन खण्डमा वर्णन गरिए अनुसार प्रत्येक नमूनाको लागि माइक्रोबियल रिडहरूसँगै उत्पन्न गरिएको सूचकांक प्रयोग गरेर, KMA निम्न प्यारामिटरहरू सहित चलाइएको थियो: -i -O-टी_डीबी-bcNano -bc 0.7 -ef -t 24. त्यसपछि, CLR प्रयोग गरेर जीन गणनाहरू सामान्यीकृत गरियो, र विज्ञान-किट सिक्ने प्रमुख घटक विश्लेषण (PCA) वर्ग प्रयोग गरियो (Pedregosa et al., 2011)। भविष्यवाणी गरिएको जीन एनोटेसन eggNOG v. 2.1.12 को emapper.py स्क्रिप्ट र eggNOG डाटाबेस संस्करण 5.0.2 प्रयोग गरेर गैर-अनावश्यक जीन क्याटलगमा निम्न प्यारामिटरहरू सहित प्रदर्शन गरिएको थियो: –itype CDS –cpu 24 -i- डाटा क्याटलग–go_evidence गैर-इलेक्ट्रोनिक – आउटपुट- आउटपुट निर्देशिका–लक्ष्य_अर्थोलोगहरू सबै –सीड_अर्थोलोग_भ्यालु ०.००१ –सीड_अर्थोलोग_स्कोर ६० –क्वेरी_कभर २० –विषय_कभर ० –अनुवाद –ओभरराइड –टेम्प_डाइर(Cantalapiedra et al., 2021)। पर्याप्त टेम्प्लेट कभरेज र टेम्प्लेट पहिचान (≥ 90%) र प्रशस्तता (गहिराई ≥ 3) भएका जीनहरू चयन गर्न KMA नतिजाहरू स्क्रिन गरिएको थियो। माथि वर्णन गरिए अनुसार CLR प्रयोग गरेर KMA गहिराइ नतिजाहरू रूपान्तरण गरिएको थियो। त्यसपछि KMA नतिजाहरूलाई प्रत्येक जीनको लागि कन्टिग स्रोत प्रयोग गरेर कार्यात्मक एनोटेसन र वर्गीकरण परिणामहरूबाट कन्टिग ID हरूसँग तुलना गरिएको थियो। ट्याक्साको रूपमा, जीन प्रचुरतामा महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरूलाई औसत CLR भिन्नता ≥ 1 वा ≤ -1 भएका जीनहरूको रूपमा परिभाषित गरिएको थियो, जसमा (+/-) चिन्हले PPA वा नियन्त्रण नमूनाहरूमा जीन बढी प्रचुर मात्रामा रहेको संकेत गर्दछ।
जीनहरूलाई पहिले एग्नोजीद्वारा तोकिएको क्योटो इन्साइक्लोपीडिया अफ जीन्स एण्ड जीनोम्स (KEGG) अर्थोलोग (KO) पहिचानकर्ताहरू अनुसार समूहबद्ध गरिएको थियो जसले जीन मार्ग प्रचुरताहरूको तुलना गर्दछ। विश्लेषण गर्नु अघि नकआउट बिनाका जीनहरू वा धेरै नकआउट भएका जीनहरू हटाइएका थिए। त्यसपछि प्रति नमूना प्रत्येक KO को औसत प्रशस्तता गणना गरिएको थियो र तथ्याङ्कीय विश्लेषण गरिएको थियो। PPA मेटाबोलिज्म जीनहरूलाई KEGG_Pathway स्तम्भमा पङ्क्ति ko00640 तोकिएको कुनै पनि जीनको रूपमा परिभाषित गरिएको थियो, जसले KEGG अनुसार प्रोपियोनेट मेटाबोलिज्ममा भूमिकालाई संकेत गर्दछ। PPA उत्पादनसँग सम्बन्धित रूपमा पहिचान गरिएका जीनहरू पूरक तालिका १ (रेचार्ड्ट एट अल।, २०१४; याङ एट अल।, २०१७) मा सूचीबद्ध छन्। प्रत्येक नमूना प्रकारमा उल्लेखनीय रूपमा बढी प्रचुर मात्रामा रहेका PPA मेटाबोलिज्म र उत्पादन जीनहरू पहिचान गर्न क्रमपरिवर्तन परीक्षणहरू गरिएको थियो। विश्लेषण गरिएको प्रत्येक जीनको लागि एक हजार क्रमपरिवर्तनहरू गरिएको थियो। तथ्याङ्कीय महत्त्व निर्धारण गर्न कटअफको रूपमा ०.०५ को p-मान प्रयोग गरिएको थियो। क्लस्टर भित्रका प्रतिनिधि जीनहरूको एनोटेसनको आधारमा क्लस्टर भित्रका व्यक्तिगत जीनहरूलाई कार्यात्मक एनोटेसनहरू तोकिएको थियो। PPA मेटाबोलिज्म र/वा PPA उत्पादनसँग सम्बन्धित ट्याक्सालाई EggNOG प्रयोग गरेर कार्यात्मक एनोटेसनको समयमा राखिएको समान कन्टिग आईडीहरूसँग Kraken2 आउटपुट फाइलहरूमा कन्टिग आईडीहरू मिलाएर पहिचान गर्न सकिन्छ। पहिले वर्णन गरिएको Mann-Whitney U परीक्षण प्रयोग गरेर महत्व परीक्षण गरिएको थियो। बेन्जामिनी-होचबर्ग प्रक्रिया प्रयोग गरेर धेरै परीक्षणको लागि सुधार गरिएको थियो। सांख्यिकीय महत्व निर्धारण गर्न कटअफको रूपमा ≤ 0.05 को p-मान प्रयोग गरिएको थियो।
सिम्पसन विविधता सूचकांक प्रयोग गरेर मुसाको पेटको माइक्रोबायोमको विविधताको मूल्याङ्कन गरिएको थियो। नियन्त्रण र PPA नमूनाहरू बीच जीनस र प्रजाति विविधताको सन्दर्भमा कुनै महत्त्वपूर्ण भिन्नता देखिएन (जीनसको लागि p-मान: 0.18, प्रजातिको लागि p-मान: 0.16) (चित्र १)। त्यसपछि प्रमुख घटक विश्लेषण (PCA) प्रयोग गरेर सूक्ष्मजीव संरचनाको तुलना गरिएको थियो। चित्र २ ले तिनीहरूको फाइलाद्वारा नमूनाहरूको क्लस्टरिङ देखाउँछ, जसले PPA र नियन्त्रण नमूनाहरू बीच माइक्रोबायोमहरूको प्रजाति संरचनामा भिन्नताहरू थिए भनेर संकेत गर्दछ। यो क्लस्टरिङ जीनस स्तरमा कम स्पष्ट थियो, जसले सुझाव दिन्छ कि PPA ले निश्चित ब्याक्टेरियालाई असर गर्छ (पूरक चित्र १)।
चित्र १. मुसाको पेटको माइक्रोबायोमको जेनेरा र प्रजाति संरचनाको अल्फा विविधता। PPA र नियन्त्रण नमूनाहरूमा जेनेरा (A) र प्रजाति (B) को सिम्पसन विविधता सूचकांक देखाउने बक्स प्लटहरू। मान-ह्विटनी U परीक्षण प्रयोग गरेर महत्त्व निर्धारण गरिएको थियो, र बेन्जामिनी-होचबर्ग प्रक्रिया प्रयोग गरेर धेरै सुधार गरिएको थियो। ns, p-मान महत्त्वपूर्ण थिएन (p>0.05)।
चित्र २. प्रजाति स्तरमा मुसाको पेटको माइक्रोबायोम संरचनाको प्रमुख घटक विश्लेषणको नतिजा। प्रमुख घटक विश्लेषण प्लटले तिनीहरूको पहिलो दुई प्रमुख घटकहरूमा नमूनाहरूको वितरण प्रदर्शन गर्दछ। रङहरूले नमूना प्रकारलाई संकेत गर्दछ: PPA-एक्सपोज गरिएका मुसाहरू बैजनी र नियन्त्रण मुसाहरू पहेंलो हुन्छन्। प्रमुख घटक १ र २ क्रमशः x-अक्ष र y-अक्षमा प्लट गरिएका छन्, र तिनीहरूको व्याख्या गरिएको भिन्नता अनुपातको रूपमा व्यक्त गरिएका छन्।
RLE रूपान्तरित गणना डेटा प्रयोग गरेर, नियन्त्रण र PPA मुसाहरूमा मध्य ब्याक्टेरोइडेट्स/बैसिलि अनुपातमा उल्लेखनीय कमी अवलोकन गरिएको थियो (नियन्त्रण: 9.66, PPA: 3.02; p-मान = 0.0011)। यो भिन्नता नियन्त्रणहरूको तुलनामा PPA मुसाहरूमा ब्याक्टेरोइडेट्सको उच्च प्रचुरताको कारणले थियो, यद्यपि भिन्नता महत्त्वपूर्ण थिएन (नियन्त्रण औसत CLR: 5.51, PPA मतलब CLR: 6.62; p-मान = 0.054), जबकि ब्याक्टेरोइडेट्सको प्रचुरता समान थियो (नियन्त्रण औसत CLR: 7.76, PPA मतलब CLR: 7.60; p-मान = 0.18)।
पेटको माइक्रोबायोमका वर्गीकरण सदस्यहरूको प्रचुरताको विश्लेषणले पत्ता लगायो कि १ फाइलम र ७७ प्रजातिहरू PPA र नियन्त्रण नमूनाहरू बीच उल्लेखनीय रूपमा भिन्न थिए (पूरक तालिका २)। PPA नमूनाहरूमा ५९ प्रजातिहरूको प्रचुरता नियन्त्रण नमूनाहरूको भन्दा उल्लेखनीय रूपमा बढी थियो, जबकि नियन्त्रण नमूनाहरूमा केवल १६ प्रजातिहरूको प्रचुरता PPA नमूनाहरूको भन्दा बढी थियो (चित्र ३)।
चित्र ३. PPA र नियन्त्रण मुसाको पेटको माइक्रोबायोममा ट्याक्साको भिन्नतापूर्ण प्रशस्तता। ज्वालामुखी प्लटहरूले PPA र नियन्त्रण नमूनाहरू बीच जेनेरा (A) वा प्रजाति (B) को प्रशस्ततामा भिन्नताहरू देखाउँछन्। खैरो थोप्लाहरूले ट्याक्साको प्रशस्ततामा कुनै महत्त्वपूर्ण भिन्नता नभएको संकेत गर्छन्। रंगीन थोप्लाहरूले ट्याक्साको प्रशस्ततामा महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्छन् (p-मान ≤ ०.०५)। नमूना प्रकारहरू बीच प्रशस्ततामा सबैभन्दा ठूलो भिन्नता भएका शीर्ष २० ट्याक्साहरू क्रमशः रातो र हल्का नीलो (नियन्त्रण र PPA नमूनाहरू) मा देखाइएका छन्। पहेंलो र बैजनी थोप्लाहरू नियन्त्रणहरू भन्दा नियन्त्रण वा PPA नमूनाहरूमा कम्तिमा २.७ गुणा बढी प्रचुर मात्रामा थिए। कालो थोप्लाहरूले -१ र १ बीचको औसत CLR भिन्नताहरू सहित उल्लेखनीय रूपमा फरक प्रचुरता भएको ट्याक्सालाई प्रतिनिधित्व गर्दछ। P मानहरू मान-ह्विटनी U परीक्षण प्रयोग गरेर गणना गरिएको थियो र बेन्जामिनी-होचबर्ग प्रक्रिया प्रयोग गरेर धेरै परीक्षणको लागि सच्याइयो। बोल्ड औसत CLR भिन्नताहरूले प्रशस्ततामा महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ।
पेटको माइक्रोबियल संरचनाको विश्लेषण गरेपछि, हामीले माइक्रोबायोमको कार्यात्मक एनोटेसन प्रदर्शन गर्यौं। कम-गुणस्तरका जीनहरू फिल्टर गरेपछि, सबै नमूनाहरूमा कुल ३७८,३५५ अद्वितीय जीनहरू पहिचान गरियो। यी जीनहरूको रूपान्तरित प्रशस्ततालाई प्रमुख घटक विश्लेषण (PCA) को लागि प्रयोग गरिएको थियो, र परिणामहरूले तिनीहरूको कार्यात्मक प्रोफाइलहरूमा आधारित नमूना प्रकारहरूको उच्च स्तरको क्लस्टरिङ देखाए (चित्र ४)।
चित्र ४. मुसाको पेटको माइक्रोबायोमको कार्यात्मक प्रोफाइल प्रयोग गरेर PCA परिणामहरू। PCA प्लटले तिनीहरूको पहिलो दुई प्रमुख घटकहरूमा नमूनाहरूको वितरण प्रदर्शन गर्दछ। रङहरूले नमूना प्रकारलाई संकेत गर्दछ: PPA-एक्सपोज गरिएका मुसाहरू बैजनी र नियन्त्रण मुसाहरू पहेंलो हुन्छन्। प्रमुख घटक १ र २ क्रमशः x-अक्ष र y-अक्षमा प्लट गरिएका छन्, र तिनीहरूको व्याख्या गरिएको भिन्नता अनुपातको रूपमा व्यक्त गरिएका छन्।
हामीले त्यसपछि विभिन्न नमूना प्रकारहरूमा KEGG नकआउटहरूको प्रशस्तताको जाँच गर्यौं। कुल ३६४८ अद्वितीय नकआउटहरू पहिचान गरियो, जसमध्ये १९६ नियन्त्रण नमूनाहरूमा उल्लेखनीय रूपमा बढी प्रचुर मात्रामा थिए र १०६ PPA नमूनाहरूमा बढी प्रचुर मात्रामा थिए (चित्र ५)। नियन्त्रण नमूनाहरूमा कुल १४५ जीनहरू र PPA नमूनाहरूमा ६१ जीनहरू पत्ता लगाइयो, जसमा उल्लेखनीय रूपमा फरक प्रचुरता थियो। लिपिड र एमिनोसुगर मेटाबोलिज्मसँग सम्बन्धित मार्गहरू PPA नमूनाहरूमा उल्लेखनीय रूपमा बढी समृद्ध थिए (पूरक तालिका ३)। नाइट्रोजन मेटाबोलिज्म र सल्फर रिले प्रणालीहरूसँग सम्बन्धित मार्गहरू नियन्त्रण नमूनाहरूमा उल्लेखनीय रूपमा बढी समृद्ध थिए (पूरक तालिका ३)। PPA नमूनाहरूमा एमिनोसुगर/न्यूक्लियोटाइड मेटाबोलिज्म (ko:K21279) र इनोसिटोल फस्फेट मेटाबोलिज्म (ko:K07291) सँग सम्बन्धित जीनको प्रशस्तता उल्लेखनीय रूपमा बढी थियो (चित्र ५)। नियन्त्रण नमूनाहरूमा बेन्जोएट मेटाबोलिज्म (ko:K22270), नाइट्रोजन मेटाबोलिज्म (ko:K00368), र ग्लाइकोलिसिस/ग्लुकोनियोजेनेसिस (ko:K00131) सँग सम्बन्धित उल्लेखनीय रूपमा बढी जीनहरू थिए (चित्र 5)।
चित्र ५. PPA र नियन्त्रण मुसाको पेटको माइक्रोबायोममा KO को भिन्नतापूर्ण प्रचुरता। ज्वालामुखी प्लटले कार्यात्मक समूहहरू (KO) को प्रशस्ततामा भिन्नताहरू चित्रण गर्दछ। खैरो थोप्लाहरूले KO लाई संकेत गर्दछ जसको प्रशस्तता नमूना प्रकारहरू (p-मान > ०.०५) बीच उल्लेखनीय रूपमा फरक थिएन। रंगीन थोप्लाहरूले प्रशस्ततामा महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ (p-मान ≤ ०.०५)। नमूना प्रकारहरू बीच प्रशस्ततामा सबैभन्दा ठूलो भिन्नता भएका २० KO हरू क्रमशः नियन्त्रण र PPA नमूनाहरूसँग मिल्दोजुल्दो रातो र हल्का नीलो रंगमा देखाइएका छन्। पहेंलो र बैजनी थोप्लाहरूले KO हरूलाई संकेत गर्दछ जुन नियन्त्रण र PPA नमूनाहरूमा क्रमशः कम्तिमा २.७ गुणा बढी प्रचुर मात्रामा थिए। कालो थोप्लाहरूले -१ र १ बीचको औसत CLR भिन्नताहरू सहित उल्लेखनीय रूपमा फरक प्रचुरता भएका KO हरूलाई संकेत गर्दछ। P मानहरू मान-ह्विटनी U परीक्षण प्रयोग गरेर गणना गरिएको थियो र बेन्जामिनी-होचबर्ग प्रक्रिया प्रयोग गरेर धेरै तुलनाहरूको लागि समायोजन गरिएको थियो। NaN ले KO KEGG मा मार्गसँग सम्बन्धित छैन भनेर संकेत गर्दछ। बोल्ड औसत CLR भिन्नता मानहरूले प्रशस्ततामा महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ। सूचीबद्ध KO हरू कुन मार्गहरूमा सम्बन्धित छन् भन्ने बारे विस्तृत जानकारीको लागि, पूरक तालिका ३ हेर्नुहोस्।
एनोटेटेड जीनहरू मध्ये, १६०१ जीनहरूमा नमूना प्रकारहरू (p ≤ ०.०५) बीच उल्लेखनीय रूपमा फरक प्रचुरता थियो, प्रत्येक जीन कम्तिमा २.७ गुणा बढी प्रचुर मात्रामा थियो। यी जीनहरू मध्ये, नियन्त्रण नमूनाहरूमा ४ जीनहरू बढी प्रचुर मात्रामा थिए र PPA नमूनाहरूमा १५९७ जीनहरू बढी प्रचुर मात्रामा थिए। PPA मा एन्टिमाइक्रोबियल गुणहरू भएकोले, हामीले नमूना प्रकारहरू बीच PPA चयापचय र उत्पादन जीनको प्रचुरता जाँच गर्यौं। १३३२ PPA चयापचय-सम्बन्धित जीनहरू मध्ये, २७ जीनहरू नियन्त्रण नमूनाहरूमा उल्लेखनीय रूपमा बढी प्रचुर मात्रामा थिए र १२ जीनहरू PPA नमूनाहरूमा बढी प्रचुर मात्रामा थिए। २२३ PPA उत्पादन-सम्बन्धित जीनहरू मध्ये, १ जीन PPA नमूनाहरूमा उल्लेखनीय रूपमा बढी प्रचुर मात्रामा थियो। चित्र ६ए ले PPA चयापचयमा संलग्न जीनको उच्च प्रचुरतालाई थप प्रदर्शन गर्दछ, नियन्त्रण नमूनाहरूमा उल्लेखनीय रूपमा उच्च प्रचुरता र ठूलो प्रभाव आकारहरू सहित, जबकि चित्र ६बीले PPA नमूनाहरूमा अवलोकन गरिएको उल्लेखनीय रूपमा उच्च प्रचुरता भएका व्यक्तिगत जीनहरूलाई हाइलाइट गर्दछ।
चित्र ६. मुसाको पेटको माइक्रोबायोममा PPA-सम्बन्धित जीनको भिन्नतापूर्ण प्रचुरता। ज्वालामुखी प्लटहरूले PPA मेटाबोलिज्म (A) र PPA उत्पादन (B) सँग सम्बन्धित जीनको प्रशस्ततामा भिन्नताहरू चित्रण गर्दछ। खैरो थोप्लाहरूले नमूना प्रकारहरू (p-मान > ०.०५) बीचको प्रचुरतामा उल्लेखनीय रूपमा फरक नभएको जीनहरूलाई संकेत गर्दछ। रंगीन थोप्लाहरूले प्रचुरतामा महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ (p-मान ≤ ०.०५)। प्रचुरतामा सबैभन्दा ठूलो भिन्नता भएका २० जीनहरू क्रमशः रातो र हल्का नीलो (नियन्त्रण र PPA नमूनाहरू) मा देखाइएका छन्। पहेंलो र बैजनी थोप्लाहरूको प्रचुरता नियन्त्रण नमूनाहरू भन्दा नियन्त्रण र PPA नमूनाहरूमा कम्तिमा २.७ गुणा बढी थियो। कालो थोप्लाहरूले -१ र १ बीचको औसत CLR भिन्नताहरू सहित, उल्लेखनीय रूपमा फरक प्रचुरता भएका जीनहरूलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ। P मानहरू मान-ह्विटनी U परीक्षण प्रयोग गरेर गणना गरिएको थियो र बेन्जामिनी-होचबर्ग प्रक्रिया प्रयोग गरेर धेरै तुलनाहरूको लागि सच्याइयो। जीनहरू गैर-रिडन्डन्ट जीन क्याटलगमा प्रतिनिधि जीनहरूसँग मेल खान्छ। जीन नामहरूमा KO जीनलाई जनाउने KEGG प्रतीक हुन्छ। बोल्ड मीन CLR भिन्नताले उल्लेखनीय रूपमा फरक प्रचुरतालाई जनाउँछ। ड्यास (-) ले KEGG डाटाबेसमा जीनको लागि कुनै प्रतीक छैन भनेर जनाउँछ।
पीपीए मेटाबोलिज्म र/वा उत्पादनसँग सम्बन्धित जीनहरू भएका ट्याक्साहरूलाई जीनको कन्टिग आईडीसँग कन्टिगहरूको वर्गीकरण पहिचान मिलाएर पहिचान गरिएको थियो। जीनस स्तरमा, १३० जेनेराहरूमा पीपीए मेटाबोलिज्मसँग सम्बन्धित जीनहरू पाइयो र ६१ जेनेराहरूमा पीपीए उत्पादनसँग सम्बन्धित जीनहरू पाइयो (पूरक तालिका ४)। यद्यपि, कुनै पनि जेनेराले प्रशस्ततामा महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू देखाएनन् (p > ०.०५)।
प्रजाति स्तरमा, १४४ ब्याक्टेरिया प्रजातिहरूमा PPA चयापचयसँग सम्बन्धित जीनहरू पाइयो र ६८ ब्याक्टेरिया प्रजातिहरूमा PPA उत्पादनसँग सम्बन्धित जीनहरू पाइयो (पूरक तालिका ५)। PPA मेटाबोलाइजरहरू मध्ये, आठ ब्याक्टेरियाहरूले नमूना प्रकारहरू बीच प्रशस्ततामा उल्लेखनीय वृद्धि देखाए, र सबैले प्रभावमा उल्लेखनीय परिवर्तनहरू देखाए (पूरक तालिका ६)। प्रशस्ततामा उल्लेखनीय भिन्नता भएका सबै पहिचान गरिएका PPA मेटाबोलाइजरहरू PPA नमूनाहरूमा बढी प्रचुर मात्रामा थिए। प्रजाति-स्तर वर्गीकरणले जेनेराका प्रतिनिधिहरू प्रकट गर्‍यो जुन नमूना प्रकारहरू बीच उल्लेखनीय रूपमा भिन्न थिएनन्, जसमा धेरै ब्याक्टेरोइड्स र रुमिनोकोकस प्रजातिहरू, साथै डन्कानिया डुबोइस, माइक्सोब्याक्टेरियम एन्टरिका, मोनोकोकस पेक्टिनोलाइटिकस, र अल्कालिजेन्स पोलिमोर्फा समावेश थिए। PPA-उत्पादक ब्याक्टेरियाहरू मध्ये, चार ब्याक्टेरियाहरूले नमूना प्रकारहरू बीच प्रशस्ततामा उल्लेखनीय भिन्नता देखाए। प्रशस्ततामा उल्लेखनीय भिन्नता भएका प्रजातिहरूमा ब्याक्टेरोइड्स नोभोरोसी, डन्कानिया डुबोइस, माइक्सोब्याक्टेरियम एन्टरिटिडिस र रुमिनोकोकस बोभिस समावेश थिए।
यस अध्ययनमा, हामीले मुसाको पेटको माइक्रोबायोटामा PPA एक्सपोजरको प्रभावहरूको जाँच गर्यौं। PPA ले ब्याक्टेरियामा फरक प्रतिक्रियाहरू उत्पन्न गर्न सक्छ किनभने यो निश्चित प्रजातिहरूद्वारा उत्पादन गरिन्छ, अन्य प्रजातिहरूद्वारा खाद्य स्रोतको रूपमा प्रयोग गरिन्छ, वा एन्टिमाइक्रोबियल प्रभावहरू हुन्छन्। त्यसकारण, आहार पूरक मार्फत आन्द्राको वातावरणमा यसको थपले सहनशीलता, संवेदनशीलता, र यसलाई पोषक स्रोतको रूपमा प्रयोग गर्ने क्षमतामा निर्भर गर्दै फरक प्रभावहरू हुन सक्छ। संवेदनशील ब्याक्टेरिया प्रजातिहरूलाई हटाउन र PPA प्रतिरोधी वा खाद्य स्रोतको रूपमा प्रयोग गर्न सक्षम व्यक्तिहरूद्वारा प्रतिस्थापन गर्न सकिन्छ, जसले गर्दा पेटको माइक्रोबायोटाको संरचनामा परिवर्तनहरू हुन्छन्। हाम्रा नतिजाहरूले माइक्रोबियल संरचनामा महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू प्रकट गरे तर समग्र माइक्रोबियल विविधतामा कुनै प्रभाव पारेनन्। सबैभन्दा ठूलो प्रभावहरू प्रजाति स्तरमा अवलोकन गरिएको थियो, PPA र नियन्त्रण नमूनाहरू बीच प्रचुर मात्रामा ७० भन्दा बढी ट्याक्सा उल्लेखनीय रूपमा फरक थिए (पूरक तालिका २)। PPA-एक्सपोजर नमूनाहरूको संरचनाको थप मूल्याङ्कनले अनएक्सपोजर नमूनाहरूको तुलनामा माइक्रोबियल प्रजातिहरूको ठूलो विषमता प्रकट गर्‍यो, जसले सुझाव दिन्छ कि PPA ले ब्याक्टेरियाको वृद्धि विशेषताहरू बढाउन सक्छ र PPA-समृद्ध वातावरणमा बाँच्न सक्ने ब्याक्टेरिया जनसंख्यालाई सीमित गर्न सक्छ। यसरी, PPA ले पेटको माइक्रोबायोटा विविधताको व्यापक अवरोध निम्त्याउनुको सट्टा छनौट रूपमा परिवर्तनहरू प्रेरित गर्न सक्छ।
PPA जस्ता खाद्य संरक्षकहरूले समग्र विविधतालाई असर नगरी आन्द्राको माइक्रोबायोम घटकहरूको प्रशस्ततालाई परिवर्तन गर्ने देखाइएको छ (नागपाल एट अल।, २०२१)। यहाँ, हामीले फाइलम ब्याक्टेरोइडेट्स (पहिले ब्याक्टेरोइडेट्स भनेर चिनिन्थ्यो) भित्र ब्याक्टेरोइडेट्स प्रजातिहरू बीचको सबैभन्दा उल्लेखनीय भिन्नताहरू अवलोकन गर्यौं, जुन PPA-एक्सपोज गरिएका मुसाहरूमा उल्लेखनीय रूपमा समृद्ध थिए। ब्याक्टेरोइडेट्स प्रजातिहरूको बढ्दो प्रचुरता बढेको म्यूकस डिग्रेडेसनसँग सम्बन्धित छ, जसले संक्रमणको जोखिम बढाउन सक्छ र सूजनलाई बढावा दिन सक्छ (कोर्निक एट अल।, २०१५; देसाई एट अल।, २०१६; पेन्जोल एट अल।, २०१९)। एउटा अध्ययनले पत्ता लगायो कि ब्याक्टेरोइडेस फ्र्याजिलिससँग उपचार गरिएको नवजात पुरुष मुसाहरूले अटिजम स्पेक्ट्रम डिसअर्डर (ASD) को सम्झना दिलाउने सामाजिक व्यवहारहरू प्रदर्शन गरे (कार्मेल एट अल।, २०२३), र अन्य अध्ययनहरूले देखाएका छन् कि ब्याक्टेरोइडेस प्रजातिहरूले प्रतिरक्षा गतिविधि परिवर्तन गर्न सक्छन् र अटोइम्यून इन्फ्लेमेटरी कार्डियोमायोप्याथी निम्त्याउन सक्छन् (गिल-क्रुज एट अल।, २०१९)। PPA (Coretti et al., 2018) को सम्पर्कमा आएका मुसाहरूमा रुमिनोकोकस, प्रिभोटेला र प्याराब्याक्टेरोइड्स जेनेराका प्रजातिहरू पनि उल्लेखनीय रूपमा बढेका थिए। केही रुमिनोकोकस प्रजातिहरू प्रोइन्फ्लेमेटरी साइटोकाइनहरू (हेन्के एट अल., 2019) को उत्पादन मार्फत क्रोहन रोग जस्ता रोगहरूसँग सम्बन्धित छन्, जबकि प्रिभोटेला ह्युमानी जस्ता प्रिभोटेला प्रजातिहरू उच्च रक्तचाप र इन्सुलिन संवेदनशीलता जस्ता चयापचय रोगहरूसँग सम्बन्धित छन् (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017)। अन्तमा, हामीले पत्ता लगायौं कि ब्याक्टेरोइडेट्स (पहिले फर्मिक्युट्स भनेर चिनिने) र ब्याक्टेरोइडेट्सको अनुपात नियन्त्रण मुसाहरूको तुलनामा PPA-उपस्थित मुसाहरूमा उल्लेखनीय रूपमा कम थियो किनभने ब्याक्टेरोइडेट्स प्रजातिहरूको कुल प्रचुरता उच्च थियो। यो अनुपात पहिले नै आन्द्राको होमियोस्टेसिसको एक महत्त्वपूर्ण सूचकको रूपमा देखाइएको छ, र यस अनुपातमा गडबडीहरू विभिन्न रोग अवस्थाहरूसँग सम्बन्धित छन् (टर्पिन एट अल।, २०१६; ताकेजावा एट अल।, २०२१; एन एट अल।, २०२३), सूजन आन्द्रा रोगहरू सहित (स्टोजानोभ एट अल।, २०२०)। सामूहिक रूपमा, ब्याक्टेरोइडेट्स फाइलमका प्रजातिहरू उच्च आहार PPA द्वारा सबैभन्दा बढी प्रभावित देखिन्छन्। यो PPA को लागि उच्च सहनशीलता वा ऊर्जा स्रोतको रूपमा PPA प्रयोग गर्ने क्षमताको कारण हुन सक्छ, जुन कम्तिमा एक प्रजाति, होयलेसेला एनोसिया (हिच एट अल।, २०२२) को लागि सत्य देखाइएको छ। वैकल्पिक रूपमा, मातृ PPA एक्सपोजरले मुसाको सन्तानको आन्द्रालाई ब्याक्टेरोइडेट्स उपनिवेशीकरणको लागि बढी संवेदनशील बनाएर भ्रूण विकास बढाउन सक्छ; यद्यपि, हाम्रो अध्ययन डिजाइनले यस्तो मूल्याङ्कनलाई अनुमति दिएन।
मेटाजेनोमिक सामग्री मूल्याङ्कनले PPA मेटाबोलिज्म र उत्पादनसँग सम्बन्धित जीनको प्रचुरतामा उल्लेखनीय भिन्नताहरू प्रकट गर्‍यो, PPA-एक्सपोजर भएका मुसाहरूले PPA उत्पादनको लागि जिम्मेवार जीनको उच्च प्रचुरता प्रदर्शन गरे, जबकि गैर-PPA-एक्सपोजर भएका मुसाहरूले PAA मेटाबोलिज्मको लागि जिम्मेवार जीनको उच्च प्रचुरता प्रदर्शन गरे (चित्र 6)। यी नतिजाहरूले सुझाव दिन्छ कि माइक्रोबियल संरचनामा PPA को प्रभाव केवल यसको प्रयोगको कारणले नहुन सक्छ, अन्यथा PPA मेटाबोलिज्मसँग सम्बन्धित जीनको प्रचुरताले PPA-एक्सपोजर भएका मुसाहरूको पेटको माइक्रोबायोममा उच्च प्रचुरता देखाउनुपर्थ्यो। एउटा व्याख्या यो हो कि PPA ले ब्याक्टेरियाको प्रचुरतालाई मुख्यतया यसको एन्टिमाइक्रोबियल प्रभावहरू मार्फत मध्यस्थता गर्दछ, पोषक तत्वको रूपमा ब्याक्टेरियाको प्रयोग मार्फत होइन। अघिल्ला अध्ययनहरूले देखाएका छन् कि PPA ले खुराक-निर्भर तरिकाले साल्मोनेला टाइफिमुरियमको वृद्धिलाई रोक्छ (ज्याकबसन एट अल।, २०१८)। PPA को उच्च सांद्रताको एक्सपोजरले ब्याक्टेरियाहरूको लागि छनौट गर्न सक्छ जुन यसको एन्टिमाइक्रोबियल गुणहरूको प्रतिरोधी छन् र आवश्यक रूपमा यसलाई मेटाबोलिज्म वा उत्पादन गर्न सक्षम नहुन सक्छन्। उदाहरणका लागि, धेरै प्याराब्याक्टेरोइड्स प्रजातिहरूले PPA नमूनाहरूमा उल्लेखनीय रूपमा उच्च प्रचुरता देखाए, तर PPA चयापचय वा उत्पादनसँग सम्बन्धित कुनै पनि जीन पत्ता लागेन (पूरक तालिका २, ४, र ५)। यसबाहेक, किण्वन उप-उत्पादनको रूपमा PPA उत्पादन विभिन्न ब्याक्टेरियाहरूमा व्यापक रूपमा वितरित गरिएको छ (गोन्जालेज-गार्सिया एट अल।, २०१७)। नियन्त्रण नमूनाहरूमा PPA चयापचयसँग सम्बन्धित जीनहरूको उच्च प्रचुरताको कारण उच्च ब्याक्टेरिया विविधता हुन सक्छ (एभेरिना एट अल।, २०२०)। यसबाहेक, १३३२ जीनहरू मध्ये केवल २७ (२.१४%) मात्र PPA चयापचयसँग सम्बन्धित जीनहरू हुने भविष्यवाणी गरिएको थियो। PPA चयापचयसँग सम्बन्धित धेरै जीनहरू अन्य चयापचय मार्गहरूमा पनि संलग्न छन्। यसले थप देखाउँछ कि PPA चयापचयमा संलग्न जीनहरूको प्रचुरता नियन्त्रण नमूनाहरूमा उच्च थियो; यी जीनहरूले PPA उपयोग वा उप-उत्पादनको रूपमा गठनको परिणाम नदिने मार्गहरूमा कार्य गर्न सक्छन्। यस अवस्थामा, PPA उत्पादनसँग सम्बन्धित केवल एउटा जीनले नमूना प्रकारहरू बीच प्रचुरतामा महत्त्वपूर्ण भिन्नता देखायो। PPA मेटाबोलिज्मसँग सम्बन्धित जीनको विपरीत, PPA उत्पादनको लागि मार्कर जीनहरू चयन गरिएको थियो किनभने तिनीहरू PPA उत्पादनको लागि ब्याक्टेरिया मार्गमा प्रत्यक्ष रूपमा संलग्न छन्। PPA-उद्घाटन भएका मुसाहरूमा, सबै प्रजातिहरूमा PPA उत्पादन गर्ने प्रशस्तता र क्षमता उल्लेखनीय रूपमा बढेको पाइयो। यसले PPA ले PPA उत्पादकहरू चयन गर्नेछ भन्ने भविष्यवाणीलाई समर्थन गर्दछ र त्यसैले PPA उत्पादन क्षमता बढ्ने भविष्यवाणी गर्दछ। यद्यपि, जीन प्रचुरता आवश्यक रूपमा जीन अभिव्यक्तिसँग सम्बन्धित छैन; यसरी, नियन्त्रण नमूनाहरूमा PPA चयापचयसँग सम्बन्धित जीनको प्रशस्तता उच्च भए पनि, अभिव्यक्ति दर फरक हुन सक्छ (शी एट अल।, २०१४)। PPA-उत्पादक जीनको व्यापकता र PPA उत्पादन बीचको सम्बन्ध पुष्टि गर्न, PPA उत्पादनमा संलग्न जीनको अभिव्यक्तिको अध्ययन आवश्यक छ।
PPA र नियन्त्रण मेटाजेनोमहरूको कार्यात्मक एनोटेसनले केही भिन्नताहरू प्रकट गर्‍यो। जीन सामग्रीको PCA विश्लेषणले PPA र नियन्त्रण नमूनाहरू बीचको अलग क्लस्टरहरू प्रकट गर्‍यो (चित्र ५)। भित्र-नमूना क्लस्टरिङले नियन्त्रण जीन सामग्री बढी विविध भएको पत्ता लगायो, जबकि PPA नमूनाहरू एकसाथ क्लस्टर गरिएका थिए। जीन सामग्रीद्वारा क्लस्टरिङ प्रजाति संरचनाद्वारा क्लस्टरिङसँग तुलनात्मक थियो। यसरी, मार्ग प्रचुरतामा भिन्नताहरू विशिष्ट प्रजातिहरू र तिनीहरू भित्रका स्ट्रेनहरूको प्रचुरतामा परिवर्तनहरूसँग मिल्दोजुल्दो छन्। PPA नमूनाहरूमा, उल्लेखनीय रूपमा उच्च प्रचुरता भएका दुई मार्गहरू एमिनोसुगर/न्यूक्लियोटाइड चिनी चयापचय (ko:K21279) र बहु ​​लिपिड मेटाबोलिज्म मार्गहरू (ko:K00647, ko:K03801; पूरक तालिका ३) सँग सम्बन्धित थिए। ko:K21279 सँग सम्बन्धित जीनहरू ब्याक्टेरोइड्स जीनससँग सम्बन्धित भएको जानिन्छ, जुन PPA नमूनाहरूमा प्रजातिहरूको उल्लेखनीय रूपमा उच्च संख्या भएको जेनेरा हो। यो इन्जाइमले क्याप्सुलर पोलिसेकराइडहरू व्यक्त गरेर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाबाट बच्न सक्छ (वाङ एट अल।, २००८)। यसले PPA-उपस्थित मुसाहरूमा अवलोकन गरिएको ब्याक्टेरॉइडेट्समा वृद्धिको कारण हुन सक्छ। यसले PPA माइक्रोबायोममा अवलोकन गरिएको बढेको फ्याटी एसिड संश्लेषणलाई पूरक बनाउँछ। ब्याक्टेरियाले फ्याटी एसिड उत्पादन गर्न FASIIko:K00647 (fabB) मार्ग प्रयोग गर्दछ, जसले होस्ट मेटाबोलिक मार्गहरूलाई प्रभाव पार्न सक्छ (Yao and Rock, 2015; Johnson et al., 2020), र लिपिड मेटाबोलिज्ममा परिवर्तनहरूले स्नायु विकासमा भूमिका खेल्न सक्छ (Yu et al., 2020)। PPA नमूनाहरूमा बढ्दो प्रचुरता देखाउने अर्को मार्ग स्टेरोइड हार्मोन बायोसिन्थेसिस (ko:K12343) थियो। त्यहाँ बढ्दो प्रमाणहरू छन् कि आन्द्राको माइक्रोबायोटाको हर्मोन स्तरलाई प्रभाव पार्ने र हर्मोनहरूद्वारा प्रभावित हुने क्षमता बीच एक उल्टो सम्बन्ध छ, जस्तै उच्च स्टेरोइड स्तरहरूले डाउनस्ट्रीम स्वास्थ्य परिणामहरू हुन सक्छन् (Tetel et al., 2018)।
यो अध्ययन सीमितता र विचारहरू बिना छैन। एउटा महत्त्वपूर्ण भिन्नता यो हो कि हामीले जनावरहरूको शारीरिक मूल्याङ्कन गरेनौं। त्यसकारण, माइक्रोबायोममा हुने परिवर्तनहरू कुनै रोगसँग सम्बन्धित छन् कि छैनन् भन्ने कुरा प्रत्यक्ष रूपमा निष्कर्षमा पुग्न सम्भव छैन। अर्को विचार यो हो कि यस अध्ययनमा मुसाहरूलाई उनीहरूका आमाहरूले जस्तै खाना खुवाइएको थियो। भविष्यका अध्ययनहरूले PPA-युक्त आहारबाट PPA-मुक्त आहारमा स्विच गर्दा माइक्रोबायोममा यसको प्रभाव सुधार हुन्छ कि हुँदैन भनेर निर्धारण गर्न सक्छन्। हाम्रो अध्ययनको एउटा सीमा, धेरै अन्य जस्तै, सीमित नमूना आकार हो। यद्यपि वैध निष्कर्षहरू निकाल्न सकिन्छ, परिणामहरूको विश्लेषण गर्दा ठूलो नमूना आकारले ठूलो सांख्यिकीय शक्ति प्रदान गर्नेछ। हामी पेटको माइक्रोबायोममा परिवर्तनहरू र कुनै पनि रोग बीचको सम्बन्धको बारेमा निष्कर्ष निकाल्न पनि सतर्क छौं (याप एट अल।, २०२१)। उमेर, लिङ्ग, र आहार सहितका भ्रामक कारकहरूले सूक्ष्मजीवहरूको संरचनालाई उल्लेखनीय रूपमा प्रभाव पार्न सक्छन्। यी कारकहरूले जटिल रोगहरूसँग पेटको माइक्रोबायोमको सम्बन्धको बारेमा साहित्यमा देखिएका असंगतिहरूलाई व्याख्या गर्न सक्छन् (जोनसन एट अल।, २०१९; लागोड र नासेर, २०२३)। उदाहरणका लागि, ASD भएका जनावरहरू र मानिसहरूमा ब्याक्टेरोइडेट्स जातका सदस्यहरू या त बढेको वा घटेको देखाइएको छ (एन्जेलिस एट अल।, २०१३; कुशक एट अल।, २०१७)। त्यस्तै गरी, सूजन आन्द्रा रोग भएका बिरामीहरूमा आन्द्राको संरचनाको अध्ययनले एउटै ट्याक्सामा वृद्धि र कमी दुवै फेला पारेको छ (वाल्टर्स एट अल।, २०१४; फोर्ब्स एट अल।, २०१८; उपाध्याय एट अल।, २०२३)। लिङ्ग पूर्वाग्रहको प्रभावलाई सीमित गर्न, हामीले लिङ्गहरूको समान प्रतिनिधित्व सुनिश्चित गर्ने प्रयास गर्यौं ताकि भिन्नताहरू प्रायः आहारद्वारा संचालित हुन सकून्। कार्यात्मक एनोटेसनको एउटा चुनौती अनावश्यक जीन अनुक्रमहरू हटाउनु हो। हाम्रो जीन क्लस्टरिङ विधिलाई ९५% अनुक्रम पहिचान र ८५% लम्बाइ समानता, साथै झूटा क्लस्टरिङ हटाउन ९०% पङ्क्तिबद्धता कभरेज आवश्यक पर्दछ। यद्यपि, केही अवस्थामा, हामीले समान एनोटेसनहरू (जस्तै, MUT) (चित्र ६) भएका COG हरू अवलोकन गर्यौं। यी अर्थोलोगहरू फरक छन् कि छैनन्, विशिष्ट जेनेरासँग सम्बन्धित छन् कि छैनन्, वा यो जीन क्लस्टरिङ दृष्टिकोणको सीमा हो कि छैन भनेर निर्धारण गर्न थप अध्ययनहरू आवश्यक छन्। कार्यात्मक एनोटेसनको अर्को सीमा सम्भावित गलत वर्गीकरण हो; ब्याक्टेरिया जीन mmdA प्रोपियोनेट संश्लेषणमा संलग्न एक ज्ञात इन्जाइम हो, तर KEGG ले यसलाई प्रोपियोनेट मेटाबोलिक मार्गसँग सम्बद्ध गर्दैन। यसको विपरित, scpB र mmcD अर्थोलोगहरू सम्बन्धित छन्। तोकिएको नकआउट बिना जीनको ठूलो संख्याले जीन प्रशस्तताको मूल्याङ्कन गर्दा PPA-सम्बन्धित जीनहरू पहिचान गर्न असमर्थता निम्त्याउन सक्छ। भविष्यका अध्ययनहरूले मेटाट्रान्सक्रिप्टोम विश्लेषणबाट लाभ उठाउनेछन्, जसले पेटको माइक्रोबायोटाको कार्यात्मक विशेषताहरूको गहिरो बुझाइ प्रदान गर्न सक्छ र जीन अभिव्यक्तिलाई सम्भावित डाउनस्ट्रीम प्रभावहरूसँग जोड्न सक्छ। विशिष्ट न्यूरोडेभलपमेन्टल विकारहरू वा सूजन आन्द्रा रोगहरू समावेश गर्ने अध्ययनहरूको लागि, यी विकारहरूसँग माइक्रोबायोम संरचनामा परिवर्तनहरू लिङ्क गर्न जनावरहरूको शारीरिक र व्यवहारिक मूल्याङ्कन आवश्यक छ। पेटको माइक्रोबायोमलाई कीटाणु-मुक्त मुसाहरूमा प्रत्यारोपण गर्ने थप अध्ययनहरू पनि माइक्रोबायोम रोगको चालक वा विशेषता हो कि भनेर निर्धारण गर्न उपयोगी हुनेछ।
संक्षेपमा, हामीले देखाएका छौं कि आहार PPA ले पेटको माइक्रोबायोटाको संरचना परिवर्तन गर्ने कारकको रूपमा काम गर्छ। PPA एक FDA-अनुमोदित संरक्षक हो जुन विभिन्न खाद्य पदार्थहरूमा व्यापक रूपमा पाइन्छ, जुन लामो समयसम्म सम्पर्कमा रहँदा, सामान्य पेटको वनस्पतिमा अवरोध ल्याउन सक्छ। हामीले धेरै ब्याक्टेरियाको प्रशस्ततामा परिवर्तनहरू फेला पार्यौं, जसले सुझाव दिन्छ कि PPA ले पेटको माइक्रोबायोटाको संरचनालाई प्रभाव पार्न सक्छ। माइक्रोबायोटामा परिवर्तनले निश्चित मेटाबोलिक मार्गहरूको स्तरमा परिवर्तन ल्याउन सक्छ, जसले होस्ट स्वास्थ्यसँग सान्दर्भिक शारीरिक परिवर्तनहरू निम्त्याउन सक्छ। माइक्रोबियल संरचनामा आहार PPA को प्रभावले डिस्बायोसिस वा अन्य रोगहरू निम्त्याउन सक्छ कि भनेर निर्धारण गर्न थप अध्ययनहरू आवश्यक छन्। यो अध्ययनले पेटको संरचनामा PPA को प्रभावले मानव स्वास्थ्यलाई कसरी असर गर्न सक्छ भन्ने बारे भविष्यका अध्ययनहरूको लागि जग बसाल्छ।
यस अध्ययनमा प्रस्तुत गरिएका डेटासेटहरू अनलाइन भण्डारहरूमा उपलब्ध छन्। भण्डारको नाम र पहुँच नम्बर यस प्रकार छन्: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431।
यो पशु अध्ययनलाई सेन्ट्रल फ्लोरिडा विश्वविद्यालयको संस्थागत पशु हेरचाह र प्रयोग समिति (UCF-IACUC) (पशु प्रयोग अनुमति नम्बर: PROTO202000002) द्वारा अनुमोदित गरिएको थियो। यो अध्ययनले स्थानीय कानून, नियमहरू, र संस्थागत आवश्यकताहरूको पालना गर्दछ।
NG: अवधारणाकरण, डेटा क्युरेसन, औपचारिक विश्लेषण, अनुसन्धान, विधिशास्त्र, सफ्टवेयर, दृश्यीकरण, लेखन (मूल मस्यौदा), लेखन (समीक्षा र सम्पादन)। LA: अवधारणाकरण, डेटा क्युरेसन, विधिशास्त्र, स्रोतहरू, लेखन (समीक्षा र सम्पादन)। SH: औपचारिक विश्लेषण, सफ्टवेयर, लेखन (समीक्षा र सम्पादन)। SA: अनुसन्धान, लेखन (समीक्षा र सम्पादन)। प्रमुख न्यायाधीश: अनुसन्धान, लेखन (समीक्षा र सम्पादन)। SN: अवधारणाकरण, परियोजना प्रशासन, स्रोतहरू, पर्यवेक्षण, लेखन (समीक्षा र सम्पादन)। TA: अवधारणाकरण, परियोजना प्रशासन, पर्यवेक्षण, लेखन (समीक्षा र सम्पादन)।
लेखकहरूले यस लेखको अनुसन्धान, लेखकत्व, र/वा प्रकाशनको लागि कुनै आर्थिक सहयोग प्राप्त नगरेको घोषणा गरे।
लेखकहरूले घोषणा गर्छन् कि अनुसन्धान कुनै पनि व्यावसायिक वा वित्तीय सम्बन्धको अभावमा गरिएको थियो जसलाई सम्भावित स्वार्थको द्वन्द्वको रूपमा व्याख्या गर्न सकिन्छ। लागू हुँदैन।
यस लेखमा व्यक्त गरिएका सबै विचारहरू केवल लेखकहरूका हुन् र तिनीहरूका संस्थाहरू, प्रकाशकहरू, सम्पादकहरू, वा समीक्षकहरूको विचारहरू प्रतिबिम्बित गर्दैनन्। यस लेखमा मूल्याङ्कन गरिएका कुनै पनि उत्पादनहरू, वा तिनीहरूका निर्माताहरूले गरेका कुनै पनि दावीहरू, प्रकाशकद्वारा ग्यारेन्टी वा समर्थन गरिएका छैनन्।
यस लेखको लागि पूरक सामग्री अनलाइन पाउन सकिन्छ: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
अब्देली एलएस, सामसम ए, नासेर एसए (२०१९)। प्रोपियोनिक एसिडले अटिजम स्पेक्ट्रम विकारहरूमा PTEN/AKT मार्गलाई नियमन गरेर ग्लियोसिस र न्यूरोइन्फ्लेमेशनलाई प्रेरित गर्छ। वैज्ञानिक रिपोर्टहरू ९, ८८२४–८८२४। doi: १०.१०३८/s४१५९८-०१९-४५३४८-z
एचिसन, जे. (१९८२)। रचनात्मक डेटाको तथ्याङ्कीय विश्लेषण। जेआर स्टेट सोक सेर बी मेथोडोल। ४४, १३९–१६०। डोइ: १०.११११/जे.२५१७-६१६१.१९८२.tb०११९५.x
आन जे, क्वोन एच, किम वाईजे (२०२३)। स्तन क्यान्सरको जोखिम कारकको रूपमा फर्मिक्युट्स/ब्याक्टेरोइडेट्स अनुपात। जर्नल अफ क्लिनिकल मेडिसिन, १२, २२१६। doi: १०.३३९०/jcm१२०६२२१६
एन्डर्स एस., ह्युबर डब्ल्यू. (२०१०)। अनुक्रम गणना डेटाको भिन्न अभिव्यक्ति विश्लेषण। Nat अघिल्लो १–१, १–१०। doi: १०.१०३८/npre.२०१०.४२८२.१
एन्जेलिस, एमडी, पिकोलो, एम., भानिनी, एल., सिरागुसा, एस., जियाकोमो, एडी, सेराजानेट्टी, डीआई, एट अल. (२०१३)। अटिजम र व्यापक विकास विकार भएका बच्चाहरूमा मलको माइक्रोबायोटा र मेटाबोलोम अन्यथा निर्दिष्ट गरिएको छैन। PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
एभरिना ओभी, कोभटुन एएस, पोल्याकोभा एसआई, साभिलोभा एएम, रेब्रिकोभ डीभी, डानिलेन्को भीएन (२०२०)। अटिजम स्पेक्ट्रम विकार भएका साना बच्चाहरूमा आन्द्राको माइक्रोबायोटाको ब्याक्टेरियल न्यूरोमेटाबोलिक विशेषताहरू। जर्नल अफ मेडिकल माइक्रोबायोलोजी ६९, ५५८–५७१। doi: १०.१०९९/jmm.०.००११७८
बाक्वेरो एफ., नोम्बेला के. (२०१२)। मानव अंगको रूपमा माइक्रोबायोम। क्लिनिकल माइक्रोबायोलोजी र संक्रमण १८, २–४। doi: १०.११११/j.१४६९-०६९१.२०१२.०३९१६.x
बाउर टी., डुरे पी. (२०२३)। प्रोपियोनिक एसिड उत्पादन गर्ने ब्याक्टेरियाको शरीर विज्ञानमा नयाँ अन्तर्दृष्टि: एनारोटिग्नम प्रोपियोनिकम र एनारोटिग्नम निओप्रोपियोनिकम (पहिले क्लोस्ट्रिडियम प्रोपियोनिकम र क्लोस्ट्रिडियम निओप्रोपियोनिकम)। सूक्ष्मजीवहरू ११, ६८५। doi: १०.३३९०/सूक्ष्मजीवहरू ११०३०६८५
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004)। मातृ पोषण र भ्रूण विकास। जे न्युटर। १३४, २१६९–२१७२। doi: 10.1093/jn/134.9.2169
बेन्जामिनी, वाई., र होचबर्ग, जे. (१९९५)। गलत-सकारात्मक दर नियन्त्रण: बहु परीक्षणको लागि एक व्यावहारिक र कुशल दृष्टिकोण। जेआर स्टेट सोक सेर बी मेथोडोल। ५७, २८९–३००। डोइ: १०.११११/जे.२५१७-६१६१.१९९५.tb02031.x