Nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद।तपाईंले प्रयोग गरिरहनुभएको ब्राउजर संस्करणमा CSS को लागि सीमित समर्थन छ।उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई अद्यावधिक गरिएको ब्राउजर प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड बन्द गर्नुहोस्)।यस बीचमा, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी शैली र जाभास्क्रिप्ट बिना साइट प्रदर्शन गर्नेछौं।
कशेरुका जनावरहरू भन्दा फरक, कीराहरूमा पुरुष-पक्षपाती यौन स्टेरोइड हार्मोनको अभाव रहेको व्यापक रूपमा मानिन्छ। एनोफिलिस गाम्बियामा, एक्डिसोन स्टेरोइड २०-हाइड्रोक्साइएक्डिसोन (२०E) ले महिलाहरूद्वारा संश्लेषित गर्दा अण्डाको विकासलाई नियन्त्रण गर्न र पुरुषहरूद्वारा यौन स्थानान्तरण गर्दा संभोगको अवरोधक अवधिलाई प्रेरित गर्न विकसित भएको देखिन्छ। अण्डाको विकास र संभोग आवश्यक प्रजनन विशेषताहरू भएकाले, महिला एनोफिलिस लामखुट्टेहरूले यी हार्मोनल संकेतहरूलाई कसरी एकीकृत गर्छन् भनेर बुझ्नाले नयाँ मलेरिया नियन्त्रण कार्यक्रमहरूको डिजाइनलाई सहज बनाउन सक्छ। यहाँ, हामी प्रकट गर्छौं कि यी प्रजनन कार्यहरू एक्डिसेरोइड-सक्रिय/निष्क्रिय इन्जाइमहरूको जटिल नेटवर्क मार्फत विशिष्ट यौन स्टेरोइडहरूद्वारा विनियमित हुन्छन्। हामीले एक पुरुष-विशिष्ट अक्सिडाइज्ड एक्डिसोन, ३-डिहाइड्रो-२०E (३D२०E) पहिचान गर्यौं, जसले यौन स्थानान्तरण र डिफोस्फोरिलेसनद्वारा सक्रियता पछि महिला यौन ग्रहणशीलता बन्द गरेर अभिभावकत्वलाई सुरक्षित गर्दछ। उल्लेखनीय रूपमा, ३D२०E स्थानान्तरणले प्लाज्मोडियम संक्रमणको समयमा अण्डाको विकास कायम राख्ने प्रजनन जीनहरूको अभिव्यक्तिलाई पनि प्रेरित गर्‍यो, संक्रमित महिलाहरूको स्वास्थ्य सुनिश्चित गर्दै। महिला-व्युत्पन्न २०E यौन प्रतिक्रिया उत्पन्न गर्दैन, तर २०E-निरोधक काइनेजहरू निषेधित भएपछि सम्भोग गर्ने व्यक्तिहरूलाई अण्डा पार्न अनुमति दिन्छ। यो पुरुष-विशिष्ट कीरा स्टेरोइड हार्मोनको पहिचान र महिला यौन ग्रहणशीलता, प्रजनन क्षमता र प्लाज्मोडियमसँगको अन्तरक्रियालाई नियमन गर्ने यसको भूमिकाले औलो प्रसारण गर्ने लामखुट्टेको प्रजनन सफलतालाई कम गर्ने सम्भावनालाई सुझाव दिन्छ।
मानव मलेरिया परजीवीहरूको एकमात्र वाहक एनोफिलिस लामखुट्टेमा व्यापक कीटनाशक प्रतिरोधको कारणले गर्दा औलोका घटनाहरू र मृत्युहरू फेरि बढ्दै गइरहेका छन्। यी लामखुट्टेको संभोग जीवविज्ञान नयाँ मलेरिया नियन्त्रण हस्तक्षेपहरूको लागि विशेष रूपमा आकर्षक लक्ष्य हो किनभने पोथीहरूले एक पटक मात्र संभोग गर्छन्; यो एकल संभोग घटनालाई बाँझ बनाउनाले खेतमा लामखुट्टेको जनसंख्या घटाउने ठूलो सम्भावना हुनेछ।
पुरुषहरूबाट उच्च-टाइटर स्टेरोइड हर्मोन प्राप्त गरेपछि महिलाहरू यौन रूपमा अशक्त हुन्छन्। अध्ययनहरूले देखाएको छ कि थप संभोगमा कठिनाइको कारण २०-हाइड्रोक्साइक्डाइसोन (२०ई) हो, एक स्टेरोइड हर्मोन जुन लार्भा चरणमा पग्लने चक्रको नियामकको रूपमा चिनिन्छ। २०ई संश्लेषण र स्थानान्तरण गर्ने पुरुषहरूको क्षमता विशेष गरी एनोफिलिस प्रजातिहरूमा विकसित भएको छ जुन उप-जीनस सेलिया७ को भाग हो, जुन अफ्रिकामा वितरित हुन्छ र एनोफिलिस गाम्बिया सहित मलेरियाको सबैभन्दा खतरनाक भेक्टरहरू समावेश गर्दछ। यो विशेष गरी उल्लेखनीय छ किनभने यी प्रजातिहरूमा महिलाहरूले प्रत्येक रगत खाना पछि २०ई उत्पादन गर्छन्, र २०ईले ओजेनेसिस चक्र चलाउँछ (सन्दर्भ ८ हेर्नुहोस्)। यद्यपि, महिलाहरूले कसरी एक्डिसोन (पुरुष स्थानान्तरण र रगत खुवाउने प्रेरण) को दुई फरक स्रोतहरूबाट संकेतहरू एकीकृत गर्छन् भन्ने तरिकाको बारेमा थोरै मात्र थाहा छ, जसमा महिलाहरूले आफ्नो संभोग गर्ने क्षमतामा सम्झौता नगरी गर्छन्। वास्तवमा, यदि महिलाहरूले उत्पादन गरेको २०ईले यौन असहिष्णुतालाई ट्रिगर गर्छ भने, यसले कुमारी-खुवाउने व्यक्तिहरूमा बाँझोपन निम्त्याउनेछ, यी लामखुट्टेहरूमा धेरै सामान्य व्यवहार।
सम्भावित व्याख्या यो हो कि A. gambiae पुरुषहरूले परिमार्जित पुरुष-विशिष्ट ecdysone स्थानान्तरण गर्छन्, जसले महिला प्रजनन पथमा सिग्नलिङ क्यास्केड सक्रिय गर्दछ, जसले गर्दा संभोग अस्थिरता हुन्छ। यद्यपि, कशेरुकाहरूमा एस्ट्रोजेन र एन्ड्रोजन जस्ता धेरै स्टेरोइड हार्मोनहरू हुन्छन् (सन्दर्भ 9 मा समीक्षा गरिएको), हाम्रो ज्ञानमा, कीराहरूमा एन्ड्रोजेनिक-पक्षपाती स्टेरोइडहरू पहिचान गरिएको छैन।
हामी सम्भावित परिमार्जन गर्ने स्टेरोइडहरूको खोजीमा यौन परिपक्व A. gambiae को पुरुष सहायक ग्रंथि (MAG) मा स्टेरोइड हार्मोनको भण्डार निर्धारण गर्न निस्कियौं। पहिले प्रयोग गरिएको कम विशिष्ट विधिको सट्टा ट्यान्डम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HPLC-MS/MS) सँग जोडिएको उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी प्रयोग गरेर, हामीले यस तन्तुमा ecdysone (E) र 20E पत्ता लगायौं, जसले अघिल्लो परिणाम पुष्टि गर्‍यो। यद्यपि, नमूनामा अक्सिडाइज्ड फस्फोरिलेटेड स्टेरोइडहरूको प्रभुत्व थियो, सूत्र 3-डिहाइड्रो-20E-22-फस्फेट (3D20E22P)12 (चित्र 1) सँग मिल्दोजुल्दो। अन्य रूपहरूमा 3-डिहाइड्रो-20E (3D20E) र 20E-22-फस्फेट (20E22P) समावेश छन्। 3D20E22P को HPLC-MS/MS संकेत तीव्रता यसको डिफस्फोरिलेटेड रूप, 3D20E भन्दा दुई अर्डर परिमाण बढी थियो, र E र 20E भन्दा तीन अर्डर परिमाण बढी थियो (चित्र १)। शरीरका अन्य भागहरू र तल्लो प्रजनन मार्गमा (LRT; विस्तारित डेटा चित्र १a)। हामीले भर्खरै बन्द (<१ दिन पुरानो) पुरुष र महिलाहरूमा पनि एकडिस्टेरोइडहरूको विश्लेषण गर्यौं र MAG मा मात्र 3D20E र 3D20E22P पत्ता लगायौं; E, 20E र 20E22P दुवै लिङ्गहरूमा उपस्थित थिए (विस्तारित डेटा चित्र १b)। यी डेटाले सुझाव दिन्छ कि A. gambiae वयस्क पुरुषहरूले आफ्नो MAG मा परिमार्जन गर्ने हार्मोनहरूको उच्च टाइटरहरू उत्पादन गर्छन् जुन महिलाहरू द्वारा संश्लेषित हुँदैनन्।
MAG र महिला LRT (एट्रिया, सेमिनल भेसिकल र पारोभेरियम सहित) ४-दिन पुरानो (४-दिन पुरानो) कुमारी पुरुषहरू र कुमारी र मिलन भएका महिलाहरू (०.५, ३, र १२ hpm) बाट विच्छेदन गरिएको थियो। यी तन्तुहरूमा रहेको एक्डिसोनलाई HPLC-MS/MS द्वारा विश्लेषण गरिएको थियो (औसत ± sem; जोडा नबनाइएको t-परीक्षण, दुई-पक्षीय, गलत खोज दर (FDR) सच्याइयो; NS, महत्त्वपूर्ण छैन; *P < ०.०५, **P < ०.०१। ३D२०E: ३ घण्टा बनाम ०.५ घण्टा, P = ०.०३५; १२ घण्टा बनाम ३ घण्टा, P = ०.००१५; १२ घण्टा बनाम ०.५ घण्टा, P = ०.०३०। ३D२०E२२P: ३ घण्टा बनाम ०.५ घण्टा, P = ०.२५; १२ घण्टा बनाम ३ घण्टा, P = ०.००३२; १२ घण्टा बनाम ०.५ घण्टा, P = ०.०१५)। डेटा तीन जैविक प्रतिकृतिहरूबाट लिइएको हो। रुचिको प्रत्येक एक्डिसोनको लागि शिखर क्षेत्र लामखुट्टेको संख्याद्वारा गणना र सामान्यीकृत गरिएको थियो। एक्डिसोनलाई निम्नानुसार रंगद्वारा प्रतिनिधित्व गरिएको छ: E, हरियो; २०E, सुन्तला; २०E२२P, बैजनी; ३D२०E, नीलो; ३D२०E२२P, गुलाबी। इनसेटले कम एक्डिसोन स्तरहरू देखाउन y-अक्षमा स्केल बढाउँछ।
3D20E22P र 3D20E समागमको समयमा स्थानान्तरण हुन्छन् कि हुँदैनन् भनेर अनुसन्धान गर्न, हामीले समागम पछि विभिन्न समय बिन्दुहरूमा महिला LRT हरूको विच्छेदन गर्यौं। यद्यपि कुमारीहरूमा ecdysone फेला परेन, हामीले समागम पछि तुरुन्तै LRT मा 3D20E22P को पर्याप्त मात्रा (0.5 घण्टा पछि-समागम, hpm) अवलोकन गर्यौं, समयसँगै घट्दै गयो, जबकि 3D20E स्तरहरू उल्लेखनीय रूपमा बढ्यो (चित्र 1)। रासायनिक रूपमा संश्लेषित 3D20E लाई मानकको रूपमा प्रयोग गरेर, हामीले निर्धारण गर्यौं कि समागम LRT हरूमा यो स्टेरोइड हार्मोनको स्तर 20E भन्दा कम्तिमा 100 गुणा बढी थियो (विस्तारित डेटा तालिका 1)। यसरी, 3D20E22P प्रमुख पुरुष ecdysone हो जुन समागमको समयमा महिला LRT मा स्थानान्तरण हुन्छ, र यसको डिफोस्फोरिलेटेड रूप, 3D20E, समागम पछि केही समय पछि अत्यधिक प्रचुर मात्रामा हुन्छ। यसले महिला समागम पछिको जीवविज्ञानमा पछिल्लो ecdysone को लागि महत्त्वपूर्ण भूमिकाको सुझाव दिन्छ।
नयाँ RNA अनुक्रमण (RNA-seq) डेटासेट (चित्र 2a) उत्पन्न गरेपछि, अनुकूलित बायोइन्फर्मेटिक्स पाइपलाइन प्रयोग गरेर, हामीले ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO), र ecdysone एन्कोडिङ 20E-परिमार्जित फास्फेटेज जीनको खोजी गर्यौं। EPP) प्रजनन तन्तुहरूमा व्यक्त गरिन्छ। हामीले एउटा उम्मेदवार EPP जीन र दुई सम्भावित EcK जीनहरू (EcK1 र EcK2) पहिचान गर्यौं, तर राम्रो उम्मेदवार EO जीन फेला पार्न सकेनौं। उल्लेखनीय रूपमा, व्यक्तिगत EPP जीनहरू गाम्बियन MAGs मा उच्च स्तर (98.9 औं प्रतिशत) मा व्यक्त गरिएको थियो तर महिला LRTs (चित्र 2b) मा होइन, यस महिला तन्तुमा 3D20E22P को डिफोस्फोरिलेसन भएकोले हाम्रो अपेक्षाहरूको विपरीत। त्यसकारण, हामी विश्वास गर्छौं कि पुरुष EPP संभोगको समयमा स्थानान्तरण हुन सक्छ। वास्तवमा, हामीले संभोग पछि महिला प्रोटीनलाई मास्क गर्न भिभो स्थिर आइसोटोप लेबलिंग प्रयोग गर्यौं, महिला एट्रियममा MS द्वारा पहिचान गरिएको इन्जाइम (चित्र 2c र पूरक तालिका)। १)। MAG र मिलन गरिएको (तर कुमारी होइन) महिला LRT मा EPP को उपस्थिति पनि विशिष्ट एन्टिबडीहरू प्रयोग गरेर पुष्टि गरिएको थियो (चित्र २d)।
a, EcKs, EOs, र EPPs एन्कोड गर्ने जीनहरूको लागि प्रत्येक लिङ्गको प्रजनन तन्तुहरू खोज्नको लागि एक अनुकूलित बायोइन्फर्मेटिक्स पाइपलाइन। तीरको छेउमा रहेका संख्याहरूले प्रत्येक चरणमा पुरुष र महिला उम्मेदवारहरूको संख्यालाई संकेत गर्दछ। यो विश्लेषणले एउटा EPP जीन (EPP) र एउटा EcK जीन (EcK1) पहिचान गर्‍यो जुन पुरुषहरूमा व्यक्त गरिन्छ, र एउटा EcK जीन (EcK2) जुन दुवै लिङ्गहरूमा व्यक्त गरिन्छ तर उम्मेदवार EO जीन उत्पादन गर्दैन।b, कुमारी (V) र मिलन (M) एनोफिलिस गाम्बिया र एनोफिलिस अल्बिकान्स तन्तुहरूमा उम्मेदवार जीन अभिव्यक्तिको तुलना गर्ने हीटम्याप।Spca, निषेचन; MAGs, पुरुषहरूमा सहायक ग्रंथिहरू; शरीरका अन्य भागहरू, स्तन, पखेटा, खुट्टा, बोसो शरीर, र दुवै लिङ्गका आन्तरिक अंगहरू, र महिलाहरूमा अण्डाशयहरू सहित। EcK2 गाम्बियाको MAG र एट्रिया दुवैमा अत्यधिक रूपमा व्यक्त गरिएको छ, जबकि EPP केवल MAG मा पाइन्छ।c, पुरुष स्खलन समूहको महिला एट्रियामा स्थानान्तरणको प्रोटियोमिक विश्लेषण ३, १२ र २४ hpm मा, जसले ६७ सबैभन्दा प्रचुर मात्रामा प्रोटीनहरू देखाउँछ। महिलाहरूलाई सबै प्रोटीनहरू लेबल (र मास्क) गर्न १५N भएको आहारमा हुर्काइएको थियो। ट्याग नगरिएका पुरुषहरूलाई ट्याग गरिएका महिलाहरूसँग मिलाइएको थियो, र महिला LRT हरूलाई प्रोटियोमिक विश्लेषणको लागि ३, १२ र २४ hpm मा विच्छेदन गरिएको थियो (स्खलन प्रोटीनहरूको पूर्ण सूचीको लागि पूरक तालिका १ हेर्नुहोस्)। यी तन्तुहरूको प्रोटियोमिक विश्लेषणद्वारा कुमारी पुरुषहरूको MAG मा इनसेट, EPP, Eck1 र EcK2 पत्ता लगाइयो।d, EPP MAG मा पश्चिमी ब्लट र मिलन गरिएका महिलाहरूको LRT द्वारा पत्ता लगाइएको थियो, तर कुमारी महिलाहरू वा पुरुषहरू वा बाँकी महिलाहरूमा होइन। शरीर। झिल्लीहरूलाई एकैसाथ एन्टी-एक्टिन (लोडिङ नियन्त्रण) र एन्टी-EPP एन्टिबडीहरूद्वारा जाँच गरिएको थियो। सबै पुरुषहरू कुमारी हुन्। जेल स्रोत डेटाको लागि पूरक चित्र १ हेर्नुहोस्। समान परिणामहरूका साथ पश्चिमी ब्लटहरू दुई पटक प्रदर्शन गरिएको थियो।
EPP को ecdysteroid phosphophosphatase गतिविधि HPLC-MS/MS द्वारा MAG बाट अलग गरिएको 3D20E22P द्वारा इन्क्युबेशन पछि प्रमाणित गरिएको थियो (विस्तारित डेटा चित्र 2a)। यसबाहेक, जब हामीले RNA-मध्यस्थता हस्तक्षेप (RNAi) द्वारा EPP लाई मौन गर्यौं, हामीले यी पुरुषहरूको प्रजनन तन्तुहरूमा फस्फेटेज गतिविधिमा बलियो कमी पत्ता लगायौं (चित्र 3a), र EPP-मौन पुरुषहरूसँग मिलन गरिएका महिलाहरूले आंशिक जीन मौनताको बावजुद dephosphorylated 3D20E (चित्र 3b) को कम अनुपात देखाए (विस्तारित डेटा चित्र 2b,c)। यसको विपरीत, हामीले एउटै लामखुट्टेमा 20E22P/20E अनुपातमा महत्त्वपूर्ण परिवर्तनहरू पत्ता लगाएनौं, जसले सुझाव दिन सक्छ कि इन्जाइम 3D20E22P (चित्र 3b) को लागि विशिष्ट छ।
a, डबल-स्ट्र्यान्डेड EPP RNA (dsEPP) वा डबल-स्ट्र्यान्डेड GFP RNA (dsGFP) नियन्त्रणहरू प्रयोग गरेर EPP मौनताका कारण MAG मा फास्फेटेज गतिविधिमा कमी आएको छ। प्रत्येक प्रतिकृतिमा बीस MAG पूलहरू प्रयोग गरिएको थियो (P = 0.0046, जोडी गरिएको t-परीक्षण, दुई-पक्षीय), छुट्टाछुट्टै थोप्लाहरूद्वारा प्रतिनिधित्व गरिएको। b, EPP-मौन पुरुषहरूसँग मिलन गरिएका महिलाहरूमा 3 hpm (P = 0.0043, जोडी नगरिएको t-परीक्षण, दुई-पक्षीय) मा dephosphorylated 3D20E को अनुपात उल्लेखनीय रूपमा कम थियो, जबकि 20E स्तरहरू अप्रभावित थिए (P = 0.063, जोडी नगरिएको)। t-परीक्षण, दुई-पक्षीय)। १३, १६ र १९ महिला प्रत्येकको तीन समूहबाट डेटा औसत ± सेमको रूपमा प्रस्तुत गरिएको छ। c, EPP-शान्त पुरुषहरूसँग मिलन गरिएका महिलाहरूमा पुन: मिलनको दर उल्लेखनीय रूपमा उच्च थियो (P = ०.०००२, फिशरको सटीक परीक्षण, दुई-पक्षीय)। महिलाहरूलाई पहिले उनीहरूको मिलन स्थिति सुनिश्चित गर्न मिलन गर्न बाध्य पारिएको थियो; २ दिन पछि, ट्रान्सजेनिक शुक्राणु बोकेका अन्य पुरुषहरूसँग ट्रान्सजीनको मात्रात्मक पीसीआर पत्ता लगाएर पुन: मिलन दरहरू मूल्याङ्कन गर्न सम्पर्क गरियो। d, EPP-मौन पुरुषहरूसँग मिलन गरेका रगत खुवाउने महिलाहरूले प्रजनन क्षमतामा उल्लेखनीय कमी ल्याएको थियो (P < ०.०००१; मान-ह्विटनी परीक्षण, दुई-पक्षीय) र अण्डा संख्यामा थोरै कमी आएको थियो (P = ०.०८८, मान-ह्विटनी परीक्षण, दुई-पक्षीय), जबकि स्प्यानिङ दर प्रभावित भएको थिएन (P = ०.९४, फिशरको सटीक परीक्षण, दुई-पक्षीय)। सबै प्यानलहरूमा, n ले जैविक रूपमा स्वतन्त्र लामखुट्टे नमूनाहरूको संख्यालाई प्रतिनिधित्व गर्दछ।NS, महत्त्वपूर्ण छैन।*P < ०.०५, **P < ०.०१, ***P < ०.००१, ****P < ०.००१।
अर्को, हामीले महिलाहरूमा समागम प्रतिरोध उत्प्रेरित गर्न एक्डिसोन डिफोस्फोरिलेसन महत्त्वपूर्ण छ कि छैन भनेर मूल्याङ्कन गर्यौं। उल्लेखनीय रूपमा, EPP-घटेका पुरुषहरूसँग मिलन गरिएका महिलाहरूले थप (ट्रान्सजेनिक) पुरुषहरू (चित्र 3c) को सम्पर्कमा आउँदा नियन्त्रण महिलाहरू (10.4%) भन्दा धेरै उच्च आवृत्ति (44.9%) मा पुन: मिलन गरे। हामीले प्रजनन क्षमतामा उल्लेखनीय कमी (चित्र 3d, बायाँ) र यी महिलाहरू (चित्र 3d, मध्य) द्वारा राखिएका अण्डाहरूको संख्यामा थोरै कमी पनि देख्यौं, जबकि महिलाहरूले राखेका अण्डाहरूको प्रतिशत (समागमद्वारा महिलाहरूमा प्राप्त अर्को प्रतिक्रिया) प्रभावित भएन (चित्र 3d, दायाँ)। 3D20E22P को लागि EPP को अवलोकन गरिएको विशिष्टतालाई ध्यानमा राख्दै, यी नतिजाहरूले सुझाव दिन्छन् कि समागमको समयमा स्थानान्तरण गरिएको EPP द्वारा 3D20E को सक्रियताले थप समागमको लागि महिला ग्रहणशीलता बन्द गर्न महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्न सक्छ, पहिले 20E को यौन स्थानान्तरणको लागि जिम्मेवार व्यवहार। त्यसकारण, यो पुरुष-विशिष्ट हार्मोनले महिला प्रजनन क्षमतालाई पनि कडा रूपमा असर गर्छ।
अर्को, हामीले रासायनिक रूपमा संश्लेषित 3D20E (चित्र 4a–c) र व्यावसायिक रूपमा उपलब्ध 20E प्रयोग गरेर यौन परिपक्व कुमारीहरूमा इंजेक्शन प्रयोगहरूमा 20E र 3D20E को गतिविधिहरूको तुलना गर्यौं। हामीले अवलोकन गर्यौं कि 3D20E दुवै सांद्रतामा महिलाहरूको संभोगप्रति संवेदनशीलता बन्द गर्न 20E भन्दा उल्लेखनीय रूपमा बढी प्रभावकारी थियो (चित्र 4d)। उल्लेखनीय रूपमा, LRT मा 3D20E को आधा शारीरिक स्तर (1,066 pg पोस्ट-इन्जेक्शन बनाम 2,022 pg पोस्ट-मिटिंग) ले दुर्दम्य महिलाहरूको अनुपातलाई प्रेरित गर्‍यो जुन 20E (361 pg पोस्ट-इन्जेक्शन) को शारीरिक स्तर भन्दा 20 गुणा बढी थियो। उच्चतम सांद्रता 18 pg पोस्ट-मिटिंगमा इंजेक्शन पछि 24 घण्टा; विस्तारित डेटा तालिका १)। यो नतिजा २०E को यौन स्थानान्तरणले समागम दुर्दम्य अवधि निम्त्याउँदैन भन्ने धारणासँग मेल खान्छ, र अभिभावक-बच्चा सम्बन्ध सुनिश्चित गर्न प्रमुख कारकको रूपमा 3D20E लाई औंल्याउँछ। कुमारी महिलाहरूमा अण्डा दिने परीक्षणहरूमा ३D२०E २०E भन्दा पनि उल्लेखनीय रूपमा बढी सक्रिय थियो (चित्र ४e), जसले सुझाव दिन्छ कि आंशिक EPP मौनता पछि हामीले अवलोकन गरेको सामान्य अण्डा दिने दर अझै पनि समागम-प्रेरित महिला कारकहरू द्वारा उत्पादित अवशिष्ट ३D२०E गतिविधिको उपस्थितिको कारणले थियो।
(a,b) २०E बाट रासायनिक रूपमा संश्लेषित ३D२०E (a) धेरै उच्च रूपान्तरण/दक्षता (तीन स्वतन्त्र संश्लेषण प्रतिक्रियाहरूबाट औसत ± sem को रूपमा प्रस्तुत गरिएको डेटा) (b).c, मास स्पेक्ट्रम (तलको आधा) मिलाइएको महिला LRT (माथिल्लो आधा) मा पाइने एक्डिसोनसँग ठ्याक्कै मेल खान्छ।d, २०E (०.६३ µg, P = ०.०२; ०.२१ µg, P < ०.०००१; फिशरको सटीक परीक्षण, दुई-पक्षीय) र १०% इथेनॉल (०.६३ µg, P < ०.०००१; ०.२१ µg, P < ०.०००१; फिशरको सटीक परीक्षण, २-पक्षीय) सँग तुलना गर्दा, जबकि २०E उच्च मात्रामा मात्र नियन्त्रण भन्दा उल्लेखनीय रूपमा उच्च थियो (०.६३ µg, P = ०.०००२; ०.२१ µg, P = ०.५४; फिशरको सटीक परीक्षण, २-पक्षीय)।e, 3D20E इन्जेक्सनले १०% इथेनॉल नियन्त्रणहरू (०.२१ µg, P < ०.०००१; ०.१३ µg, P = ०.०००३; फिशरको सटीक परीक्षण, दुई-पक्षीय) भन्दा कुमारी महिलाहरूमा उल्लेखनीय रूपमा उच्च स्प्यानिङ दरहरू प्रेरित गर्‍यो, जबकि २०E ले नियन्त्रणहरूको तुलनामा उच्च मात्रामा मात्र (०.२१ µg, P = ०.०२२; ०.१३ µg, P = ०.०८२३; फिशरको सटीक परीक्षण, दुई-पक्षीय)।३D20E ले उच्च मात्रामा २०E भन्दा उल्लेखनीय रूपमा उच्च स्प्यानिङ दरहरू प्रेरित गर्‍यो (०.२१ µg, P = ०.००१९; ०.१३ µg, P = ०.०७५; फिशरको सटीक परीक्षण, दुई-पक्षीय)।सबै प्यानलहरूमा, n ले जैविक रूपमा स्वतन्त्र लामखुट्टे नमूनाहरूको संख्यालाई प्रतिनिधित्व गर्दछ।NS, महत्त्वपूर्ण छैन।*P < ०.०५, **P < ०.०१, ***P < ०.००१, ****P < ०.००१।डेटा तीन प्रतिकृतिहरूबाट लिइएको हो।
अघिल्ला अध्ययनहरूमा, हामीले स्टेरोइड हार्मोनको यौन स्थानान्तरणले MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11) को अभिव्यक्तिलाई प्रेरित गर्छ भनेर निर्धारण गर्यौं, जुन महिला प्रजनन जीन हो जसले A. gambiae महिलाहरूलाई P. falciparum संक्रमणबाट बचाउँछ। सबैभन्दा घातक मानव मलेरिया परजीवी १३ बाट हुने स्वास्थ्य लागत। औलो-स्थानीय क्षेत्रहरूमा एनोफिलिसको प्रजनन फिटनेसमा MISO को महत्त्वलाई ध्यानमा राख्दै, हामीले कुन हार्मोन 3D20E वा 20E ले यो जीनको अभिव्यक्तिलाई ट्रिगर गर्छ भनेर निर्धारण गर्ने निर्णय गर्यौं। हामीले पत्ता लगायौं कि 20E इंजेक्शनले विशेष रूपमा वा बढी शक्तिशाली रूपमा केही आणविक हार्मोन रिसेप्टरहरू (HR), जस्तै HR3 र HR4, र विशिष्ट डाउनस्ट्रीम स्टेरोइड लक्ष्यहरू, जस्तै योल्कोजेनिक जीन Vg14, 15, 16, MISO लाई 3D20E द्वारा अधिक बलियो रूपमा प्रेरित गरिएको थियो (विस्तारित डेटा चित्र 3)। यसरी, यस एन्ड्रोजेनिक स्टेरोइड हार्मोनको यौन स्थानान्तरणले परजीवी संक्रमणबाट उत्पन्न लागतबाट महिलाहरूलाई जोगाउने संयन्त्रहरूलाई प्रेरित गर्ने देखिन्छ। यसबाहेक, 3D20E E रिसेप्टर EcR को दुवै आइसोफर्महरूलाई फरक रूपमा असर गर्छ, EcR-A लाई प्रेरित गर्छ र EcR-B लाई दबाउँछ, र HPX15 सहित अन्य मिलन-प्रेरित जीनहरूलाई अझ बलियो रूपमा ट्रिगर गर्छ, जसले महिला प्रजनन क्षमतालाई असर गर्छ। यसले EPP-शान्त पुरुषहरूसँग मिलन गरिएका महिलाहरूमा देखिएको महत्त्वपूर्ण बाँझोपनलाई व्याख्या गर्न सक्छ (विस्तारित डेटा चित्र 3)। यी डेटाले दुई ecdysone हार्मोनहरू द्वारा प्राथमिकतामा सक्रिय डाउनस्ट्रीम मार्गहरूको अस्तित्वलाई सुझाव दिन्छ जुन लिंग-विशिष्ट प्रकार्यलाई निहित गर्न सक्छ।
अर्को, हामीले हाम्रो बायोइन्फर्मेटिक्स पाइपलाइनमा पहिचान गरिएका दुई EcK जीनहरूको कार्य परीक्षण गर्यौं। EcK1 वा EcK2 लाई मौन गर्नाले पुरुषहरूमा उल्लेखनीय मृत्युदर भयो (विस्तारित डेटा चित्र 4a), जसले सुझाव दिन्छ कि ecdysone phosphorylation, र यसरी निष्क्रियता, बाँच्नको लागि महत्त्वपूर्ण छ। EcK2 EcK1 भन्दा उच्च स्तरमा व्यक्त गरिएको थियो र प्रोटियोमिक्स द्वारा MAGs मा पत्ता लगाइएको थियो (चित्र 2b,c र पूरक तालिका 2), हामीले 20E सँग इन्क्युबेट गरेर यसको ecdysteroid kinase गतिविधि प्रमाणित गर्यौं, जसले गर्दा phosphorylation 20E22P (विस्तारित डेटा चित्र 2) भयो। 4b)। 3D20E लाई सब्सट्रेटको रूपमा प्रयोग गर्दा, हामी phosphorylated उत्पादन 3D20E22P (विस्तारित डेटा चित्र 4c) पत्ता लगाउन असमर्थ भयौं, जसले सुझाव दिन्छ कि 3D20E को सट्टा 20E EcK2 को मनपर्ने लक्ष्य हुन सक्छ।
हाम्रो RNA-seq विश्लेषण अनुसार, EcK2 कुमारी महिलाहरूको LRT मा पनि अत्यधिक रूपमा व्यक्त गरिएको थियो, जहाँ यो संभोग पछि बन्द गरिएको थियो (चित्र 2b)। हामीले यी डेटा पुष्टि गर्यौं र निर्धारण गर्यौं कि EcK2 अभिव्यक्ति रगत खुवाउनेबाट प्रभावित भएको थिएन (विस्तारित डेटा चित्र 5a)। हाम्रा प्रारम्भिक MS प्रयोगहरू विस्तार गर्दै, हामीले निर्धारण गर्यौं कि 20E22P को शिखर 20E को शिखरसँग नजिकको सम्बन्ध थियो (रगत खाना पछि 22-26 घण्टा; विस्तारित डेटा चित्र 5b)। कुमारी महिलाहरूमा EcK2 को मौनताले रक्त खाना पछि 26 घण्टामा 20E देखि 20E22P को सापेक्षिक अनुपातमा 3 गुणा वृद्धि भयो (विस्तारित डेटा चित्र 2c र 5c), पुष्टि गर्दै कि EcK2 ले महिलाहरूमा 20E लाई पनि फस्फोरिलेट गर्दछ। उल्लेखनीय रूपमा, EcK2-कमी भएका कुमारीहरूले पूर्ण यौन ग्रहणशीलता कायम राखे (विस्तारित डेटा चित्र 5d,e), थप सुझाव दिन्छ कि 20E को महिला उत्पादनले संभोगलाई दुर्दम्य बनाउँदैन। अवधिहरू। यद्यपि, यी महिलाहरूमा नियन्त्रणको तुलनामा अण्डा दिने दरमा उल्लेखनीय वृद्धि भएको थियो, जसमा ३०% भन्दा बढी कुमारीहरूले अण्डा दिन्छन् (विस्तारित डेटा चित्र ५f)। यदि रगत चुसाइसकेपछि डबल-स्ट्र्यान्डेड Eck2 RNA (dsEcK2) इंजेक्शनहरू गरिएको थियो भने, स्प्यानिङ भएन, जुन बिन्दुमा रगत इन्जेसनको कारणले २०E शिखर घटेको थियो। समग्रमा, यी नतिजाहरूले रगत चुसिएपछि उत्पादन हुने २०E ले स्प्यानिङलाई प्रेरित गर्न सक्ने मोडेललाई समर्थन गर्दछ, तर जब स्प्यानिङ ब्लक (EcK2 र सम्भवतः अन्य कारकहरू) संभोगद्वारा बन्द गरिन्छ तब मात्र। न त २०E न त ३D२०E इंजेक्शनहरूले कुमारीहरूमा EcK2 अभिव्यक्तिलाई रोक लगाए (विस्तारित डेटा चित्र ५g), सुझाव दिन्छ कि अन्य कारकहरूले यस किनेजको अवरोधलाई मध्यस्थता गर्छन्। यद्यपि, रगत खुवाइसकेपछि २०E स्तरहरू संभोग असुविधा उत्पन्न गर्न पर्याप्त थिएनन्, तर यौन रूपमा स्थानान्तरण गरिएको ३D२०E को उच्च टाइटरहरूद्वारा प्रभावकारी रूपमा ट्रिगर गरिएको थियो।
हाम्रो नतिजाले A. gambiae को प्रजनन सफलतालाई नियमन गर्ने संयन्त्रहरूमा महत्त्वपूर्ण अन्तर्दृष्टि प्रदान गर्दछ। एउटा मोडेल देखा परेको छ जहाँ पुरुषहरूले 3D20E को उच्च टाइटरहरू संश्लेषण गर्न विकसित भएका छन्, एक पुरुष-विशिष्ट परिमार्जित ecdysone जसले महिलाहरूलाई थप संभोगको लागि असंवेदनशील बनाएर अभिभावकत्व सुनिश्चित गर्दछ। साथै, यी मलेरिया भेक्टरहरूले पुरुष-विशिष्ट EPP को यौन स्थानान्तरणको प्रतिक्रियामा महिलाहरूमा 3D20E सक्रिय गर्न एक कुशल प्रणाली पनि विकसित गरेका छन्। हाम्रो ज्ञानमा, यो कीराहरूमा एक अद्वितीय र महत्वपूर्ण कार्य गर्ने पुरुष- र महिला-प्रभुत्व भएको स्टेरोइड हार्मोन प्रणालीको पहिलो उदाहरण हो। पुरुष-विशिष्ट ecdysone प्रकार्यलाई पोष्टुलेट गरिएको छ तर निश्चित रूपमा प्रदर्शन गरिएको छैन। उदाहरणका लागि, धेरै हदसम्म अस्वीकृत परिकल्पना 18 यो हो कि यी कार्यहरू 20E पूर्ववर्ती E1 द्वारा प्रदर्शन गर्न सकिन्छ। यो राम्रोसँग थाहा छ कि ड्रोसोफिलामा, मोनान्ड्री साना सेक्स पेप्टाइडहरू 19,20 को यौन स्थानान्तरण द्वारा ट्रिगर गरिएको छ जसले विशिष्ट सेक्स पेप्टाइड रिसेप्टरहरू मार्फत महिला प्रजनन पथलाई भित्र्याउने न्यूरोनहरूसँग अन्तरक्रिया गर्दछ 21,22। थप काम हो A. gambiae महिलाहरूमा 3D20E द्वारा नियन्त्रित डाउनस्ट्रीम सिग्नलिङ क्यास्केडहरू निर्धारण गर्न र यी क्यास्केडहरू लामखुट्टे र ड्रोसोफिला बीच संरक्षण गर्न सकिन्छ कि भनेर निर्धारण गर्न आवश्यक छ।
हाम्रो अध्ययनमा पहिचान गरिएको महिला प्रजनन क्षमता र व्यवहारमा 3D20E को महत्त्वपूर्ण भूमिकालाई ध्यानमा राख्दै, 3D20E संश्लेषण र सक्रियतातर्फ डोऱ्याउने मार्गहरूले भविष्यको लामखुट्टे नियन्त्रण रणनीतिहरूको लागि नयाँ अवसरहरू प्रदान गर्दछ, जस्तै बाँझ कीट प्रविधि रणनीतिहरूमा प्रतिस्पर्धी बाँझ पुरुषहरूको उत्पादन। जंगली रिहाइको लागि प्रयोग गर्नुहोस् वा कुमारी खेलमा 3D20E को नक्कल गर्नुहोस्। 3D20E को पुरुष-विशिष्ट प्रकार्य विकसित भएको हुन सक्छ जब A. gambiae र अन्य Cellia प्रजातिहरूले आफ्नो वीर्यलाई मिलन प्लगहरूमा जम्मा गर्ने क्षमता प्राप्त गरे, किनकि यसले ठूलो संख्यामा हार्मोन र हार्मोन-सक्रिय इन्जाइमहरूको कुशल स्थानान्तरणको लागि अनुमति दिन्छ। फलस्वरूप, 3D20E विकास कार्यान्वयन गर्ने मोनान्ड्रीले महिलाहरूलाई (MISO को उच्च अभिव्यक्ति मार्फत) उच्च मलेरिया प्रचलनको क्षेत्रहरूमा उनीहरूको प्रजनन फिटनेसलाई समर्थन गर्न एक संयन्त्र प्रदान गर्दछ, जसले अप्रत्यक्ष रूपमा प्लाज्मोडियम प्रसारणमा योगदान पुर्‍याउँछ। महिला एनोफिलिस लामखुट्टेहरूमा P. फाल्सीपेरमको अस्तित्व र वृद्धिमा महिला 20E ले गहिरो प्रभाव पारेको देखाइएको छ, 24 पुरुष र महिला दुवै स्टेरोइड हार्मोन मार्गहरू अब लामखुट्टे-परजीवीका प्रमुख पक्षहरू हुन्। अन्तरक्रियाहरू।
A. gambiae G3 प्रजातिहरू मानक कीरा अवस्था (२६-२८ डिग्री सेल्सियस, ६५-८०% सापेक्षिक आर्द्रता, १२:१२ घण्टा प्रकाश/गाढा फोटोपिरियड) अन्तर्गत हुर्काइएका थिए। लार्भालाई धुलो माछाको खाना (टेट्रामिन ट्रपिकल फ्लेक्स, कोइ पेलेट र टेट्रा पोन्ड स्टिकहरू ७:७:२ को अनुपातमा) खुवाइयो। वयस्क लामखुट्टेहरूलाई १०% डेक्सट्रोज घोल र साप्ताहिक मानव रगत (रगतका घटकहरूको अध्ययन) खुवाइयो। माइक्रोस्कोपीद्वारा छेउको जाँच गरेपछि प्युपल चरणमा लिङ्गहरू अलग गरेर भर्जिन लामखुट्टेहरू प्राप्त गरिएको थियो। DsRed ट्रान्सजीन बोक्ने पुरुषहरूको बारेमा पहिले वर्णन गरिएको छ।
पहिले वर्णन गरिएको प्रोटोकल अनुसार जबरजस्ती संभोग प्रयोगहरू गरिएको थियो। प्राकृतिक संभोगको लागि, ४-दिनका कुमारी महिलाहरूलाई यौन परिपक्व कुमारी पुरुषहरूसँग १:३ अनुपातमा दुई रातको लागि राखिएको थियो। पुरुषहरूलाई dsEPP इंजेक्शन दिइएको प्रयोगहरूको लागि, सह-पिंजरा इंजेक्शन पछिको ३-४ दिनहरूसँग मेल खान्छ, जब फस्फेटेज गतिविधि अधिकतम रूपमा मौन गरिएको थियो (विस्तारित डेटा चित्र २b)।
लामखुट्टेको तन्तु, बाँकी रहेको लाश (शरीरको बाँकी भाग), वा सम्पूर्ण शरीरलाई १००% मिथेनोलमा विच्छेदन गरियो र बीडर (२ मिमी गिलास मोती, २,४०० आरपीएम, ९० सेकेन्ड) प्रयोग गरेर एकरूप बनाइयो। तन्तुको मात्रा र मिथेनोलको मात्रा यस प्रकार थियो: शरीरको बाँकी भाग, १,००० µl मा ५०; MAG, ५०–१०० ८० µl; महिला LRT, २५–५० ८० µl। अवक्षेपणलाई मिथेनोलको समान मात्राको साथ दोस्रो मिथेनोल निकासीको अधीनमा राखिएको थियो। कोषको मलबे सेन्ट्रीफ्यूगेशनद्वारा हटाइयो। दुबै निकासीबाट मिथेनोललाई नाइट्रोजन प्रवाह अन्तर्गत मिलाएर सुकाइयो, त्यसपछि पानीमा ८०% मिथेनोलको निम्न मात्रामा पुन: निलम्बन गरियो: शरीरको बाँकी भाग, ५० µl; MAG र महिला LRT, ३० µl।
नमूनाहरूलाई मास स्पेक्ट्रोमिटर (ID-X, थर्मो फिशर) मा LC उपकरण (Vanquish, Thermo Fisher) सँग जोडेर विश्लेषण गरिएको थियो। नमूनाको ५ µl २५ डिग्री सेल्सियसमा राखिएको ३ µm, १०० × ४.६ मिमी स्तम्भ (Inspire C8, Dikma) मा इन्जेक्ट गरिएको थियो। LC को लागि मोबाइल चरणहरू A (पानी, ०.१% फर्मिक एसिड) र B (एसिटोनिट्राइल, ०.१% फर्मिक एसिड) थिए। LC ग्रेडियन्ट निम्नानुसार थियो: १ मिनेटको लागि ५% B, त्यसपछि ११ मिनेटमा १००% B मा बढाइयो। १००% मा ८ मिनेट पछि, ४ मिनेटको लागि ५% B मा स्तम्भ पुन: सन्तुलन गर्नुहोस्। प्रवाह दर ०.३ मिली न्यूनतम-१ थियो। MS स्रोतमा आयोनाइजेसन सकारात्मक र नकारात्मक मोडहरूमा तातो इलेक्ट्रोस्प्रे आयनाइजेसन द्वारा पूरा हुन्छ।
मास स्पेक्ट्रोमिटरले पूर्ण MS मोडमा ६०,००० रिजोल्युसनमा ३५० देखि ६८० सम्मको m/z दायरामा डेटा मापन गर्दछ। MS/MS डेटा [M + H]+ (सबै लक्ष्यहरू), [M - H2O + H]+ (सबै लक्ष्यहरू), र [M - H]- (फस्फोरिलेटेड लक्ष्यहरू) मा प्राप्त गरिएको थियो। MS/MS डेटा लक्ष्यहरूको ecdysone गुणहरू पुष्टि गर्न प्रयोग गरिएको थियो जसको लागि कुनै मानक उपलब्ध थिएन। गैर-लक्षित ecdysteroids पहिचान गर्न, १५% भन्दा बढी सापेक्षिक प्रचुरता भएका सबै HPLC शिखरहरूको लागि MS/MS डेटा विश्लेषण गरिएको थियो। एक विशिष्ट नमूना (अन्य सबै लक्ष्यहरू) को निरपेक्ष मात्रा वा पातलो गणना गर्न शुद्ध मानकहरू (२०E, ३D२०E) बाट सिर्जना गरिएको मानक वक्रहरू प्रयोग गरेर परिमाण गर्नुहोस् एक पुरुषमा फेला परेको मात्रासँग तिनीहरूको समतुल्यता गणना गर्न। ३D२०E को लागि, निम्न एडक्टहरूको योग प्रयोग गरेर परिमाणीकरण गरिएको थियो: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.ट्रेसफाइन्डर (संस्करण ४.१) प्रयोग गरेर डेटा निकालियो र परिमाणित गरियो। Xcalibur (संस्करण ४.४) प्रयोग गरेर MS/MS डेटा विश्लेषण गरियो। E, 20E र 3D20E को MS स्पेक्ट्रा सम्बन्धित मापदण्डहरूसँग तुलना गरियो। 3D20E22P लाई Girard को अभिकर्मकसँग व्युत्पन्न गरेर विश्लेषण गरिएको थियो। 20E22P लाई m/z अनुपातद्वारा विश्लेषण गरिएको थियो।
3D20E22P लाई MAG बाट शुद्ध गरिएको थियो। HPLC-MS/MS विश्लेषण जस्तै LC अवस्थाहरूमा क्वाड्रपोल मास-आधारित डिटेक्टर (QDa, Acquity, Waters) सहित अल्ट्रा-प्रदर्शन लिक्विड क्रोमेटोग्राफ (Acquity, Waters) प्रयोग गरेर विश्लेषणात्मक स्केलमा शुद्धीकरण गरिएको थियो। पहिले निर्धारण गरिएको समान अवधारण समयमा 3D20E22P सँग सम्बन्धित m/z पत्ता लागेपछि फ्र्याक्सन सङ्कलन ट्रिगर गरिएको थियो। माथि वर्णन गरिए अनुसार HPLC-MS/MS द्वारा निकालिएका यौगिकहरूको शुद्धता त्यसपछि जाँच गरिएको थियो।
निर्माताको निर्देशन पालना गर्दै TRI अभिकर्मक (थर्मो फिशर) प्रयोग गरेर १०-१२ प्रजनन तन्तु वा शरीरका अन्य भागहरू (हेडलेस) बाट कुल RNA निकालिएको थियो। RNA लाई TURBO DNase (थर्मो फिशर) ले उपचार गरिएको थियो। निर्माताको निर्देशन पालना गर्दै मोलोनी मुरिन ल्युकेमिया भाइरस रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज (M-MLV RT; थर्मो फिशर) प्रयोग गरेर cDNA संश्लेषित गरिएको थियो। रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन क्वान्टिटेटिभ PCR (RT-qPCR; एक्सटेन्डेड डाटा तालिका २) को लागि प्राइमरहरू पहिले प्रकाशित गरिएको थियो24 वा प्राइमर-BLAST26 प्रयोग गरेर डिजाइन गरिएको थियो, ७०-१५० bp आकार र फैलिएको एक्सोन-एक्सोन जंक्शन वा प्राइमर जोडी प्राइमरहरू अलग एक्सोनका उत्पादनहरूलाई प्राथमिकता दिइएको थियो। तीन देखि चार जैविक प्रतिकृतिहरूबाट cDNA नमूनाहरू RT-qPCR को लागि पानीमा चार गुणा पातलो पारिएको थियो। क्वान्टिफिकेशन १× PowerUp SYBR ग्रीन मास्टर मिक्स (थर्मो फिशर), प्राइमरहरू, र ५ µl पातलो cDNA भएको १५ µl प्रतिकृति प्रतिक्रियाहरूमा गरिएको थियो। प्रतिक्रियाहरू एकमा चलाइएको थियो क्वान्टस्टुडियो ६ प्रो रियल-टाइम पीसीआर प्रणाली (थर्मो फिशर) र डिजाइन र विश्लेषण (संस्करण २.४.३) प्रयोग गरेर डेटा सङ्कलन र विश्लेषण गरिएको थियो। यस अध्ययनमा देखाइए अनुसार, सापेक्षिक मात्रालाई राइबोसोमल जीन RpL19 (AGAP004422) मा सामान्यीकृत गरिएको थियो, जसको अभिव्यक्ति रगत खुवाउने २७ वा मिलन ३ सँग उल्लेखनीय रूपमा परिवर्तन भएन।
Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) प्रयोग गरेर RNA गुणस्तर जाँच गरिएको थियो। Illumina paired-end पुस्तकालयहरू MIT र Harvard को ब्रोड इन्स्टिच्युटमा तयार पारिएका थिए र सञ्चालित थिए। पूर्वनिर्धारित प्यारामिटरहरू सहित HISAT2 (संस्करण 2.0.5) प्रयोग गरेर A. gambiae जीनोम (PEST स्ट्रेन, संस्करण 4.12) मा अनुक्रमणिका पठनहरू पङ्क्तिबद्ध गरिएको थियो। म्यापिङ गुणस्तर (MAPQ) स्कोरहरू <30 भएका पठनहरू Samtools (संस्करण 1.3.1) प्रयोग गरेर हटाइएका थिए। पूर्वनिर्धारित प्यारामिटरहरू सहित htseq-count (संस्करण 0.9.1) प्रयोग गरेर जीनमा म्याप गरिएका पठनहरूको संख्या गणना गरिएको थियो। R (संस्करण 4.0.3) मा DESeq2 प्याकेज (संस्करण 1.28.1) प्रयोग गरेर सामान्यीकृत पठन गणनाहरू गणना गरिएको थियो र भिन्न जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण गरिएको थियो।
Ecdysone-परिमार्जन गर्ने जीन उम्मेदवारहरूलाई पहिले PSI-BLAST एल्गोरिथ्म (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) प्रयोग गरेर A. gambiae जीनोम खोजी गरेर पहिचान गरिएको थियो। पूर्वनिर्धारित मानहरू प्रयोग गरेर निम्न क्वेरी प्रोटीन अनुक्रमहरू भएका प्यारामिटरहरू: Bombyx mori (Accession No. NP_001038956.1), Musca domestica (Accession No. XP_005182020.1, XP_005175332.1 र XP_011294434.1) र Microplitis demolitor (Accession No. XP_008552646.1 र XP_008552645.1) बाट EcK B. mori (Accession No. NP_001036900), Drosophila melanogaster (Accession No. NP_651202), बाट EcK। एपिस मेलिफेरा (एक्सेसन नम्बर XP_394838) र एसिरथोसिफोन पिसम (एक्सेसन नम्बर XP_001947166); र B. mori (एक्सेसन नम्बर XP_001947166) NP_001177919.1 र NP_001243996.1) बाट EPP र D. melanogaster (एक्सेसन नम्बर NP_572986.1) को EO (चरण १)। अर्को, गाम्बियामा प्रजनन तन्तु (महिला LRT वा MAG) मा उच्च mRNA अभिव्यक्ति (>१०० टुक्रा/किलोबेस एक्सन प्रति मिलियन म्याप गरिएको पठन (FPKM) वा >८५%) मा आधारित फिल्टर हिट (चरण २)। विशिष्टता सुधार गर्न, हामीले ए. अल्बिमानसको प्रजनन तन्तुमा पनि अभिव्यक्त हुने उम्मेदवार इन्जाइमहरू चयन गर्यौं, जुन एनोफिलिस प्रजाति हो जसले संभोगको समयमा एक्डिसोनलाई संश्लेषण वा स्थानान्तरण गर्दैन। उम्मेदवार जीनहरूलाई ए. अल्बिमानस प्रजनन तन्तु (चरण ३) मा कम अभिव्यक्ति (<१०० FPKM वा <८५ औं प्रतिशत) को आधारमा फिल्टर गरिएको थियो। अन्तिम फिल्टर (चरण ४) को रूपमा, उम्मेदवार जीनहरूले निम्न मध्ये कम्तिमा एउटालाई सन्तुष्ट पार्नु पर्छ: (१) भिन्न रूपमा व्यक्त गरिएको जीनको विश्लेषण अनुसार संभोग पछि उल्लेखनीय रूपमा अप-रेगुलेट गरिएको (P < ०.०५) र (२) गैर-प्रजनन तन्तुहरूमा (<८५% वा <१०० FPKM)।
हामीले पहिले वर्णन गरिएका विधिहरू २८,२९,३० लाई सम्पूर्ण जीव आइसोटोपिक लेबलिङ प्राप्त गर्न परिमार्जन गर्यौं। संक्षेपमा, जंगली-प्रकार Saccharomyces cerevisiae प्रकार II (YSC2, Sigma) लाई यीस्ट नाइट्रोजन बेस (BD Difco, DF0335) मा परीक्षण गरिएको थियो जसमा (wt/vol) २% ग्लुकोज (G7528, Sigma), १.७% एमिनो एसिड-रहित र अमोनियम सल्फेट। कल्चर माध्यम) र ५% १५N अमोनियम सल्फेट (NLM-७१३, >९९%, क्याम्ब्रिज आइसोटोप प्रयोगशालाहरू) नाइट्रोजनको एकमात्र स्रोतको रूपमा समावेश गरिएको थियो। खमीरलाई सेन्ट्रीफ्यूगेशनद्वारा पुन: प्राप्ति गरिएको थियो र लामखुट्टेको लार्भालाई प्युपेशन नभएसम्म लिबिटम खुवाइएको थियो। चौथो इन्स्टार मृत्युदर रोक्नको लागि माछाको खाना (प्रति ३०० लार्भामा ०.५ मिलीग्राम) को पूरक। त्यसपछि संभोगको समयमा स्थानान्तरण गरिएको पुरुष प्रोटियोमको विश्लेषण गर्न लेबल नगरिएका पुरुषहरूसँग संभोग प्रयोगहरूमा महिलाहरूलाई मात्र प्रयोग गरियो।
४-६ दिनका १५N-ट्याग गरिएका कुमारी महिलाहरूलाई उमेरसँग मिल्ने अनट्याग गरिएका कुमारी पुरुषहरूसँग मिलन गर्न बाध्य पारिएको थियो। एपिफ्लोरेसेन्स माइक्रोस्कोपी अन्तर्गत मिलन प्लगहरू पत्ता लगाएर सफल मिलन प्रमाणित गरिएको थियो। ३, १२, र २४ hpm मा, ४५-५५ मिलन गरिएका महिलाहरूको एट्रियालाई ५० µl अमोनियम बाइकार्बोनेट बफर (pH ७.८) मा विच्छेदन गरिएको थियो र मुसलले एकरूप गरिएको थियो। होमोजेनेटलाई सेन्ट्रीफ्यूज गरिएको थियो र सुपरनेटेन्टलाई ५० µl ०.१% RapiGest (१८६००१८६०, वाटर्स) को ५० µl ५० mM अमोनियम बाइकार्बोनेटमा मिसाइएको थियो। प्रत्येक नमूनाबाट सुपरनेटेन्ट र गोलीलाई सुख्खा बरफमा स्न्याप फ्रिज गरिएको थियो र रातभर वाशिंगटन विश्वविद्यालयको MacCoss प्रयोगशालामा पठाइएको थियो, जहाँ LC-MS/MS को लागि नमूना तयारी पूरा भएको थियो। ५० mM मा ०.१% RapiGest को ५० µl मा गोलीलाई पुन: निलम्बन गर्नुहोस्। पानीको नुहाउने ठाउँमा अमोनियम बाइकार्बोनेट र सोनिकेट। गोली र सुपरनाटेन्टको प्रोटिन सांद्रता BCA परखद्वारा मापन गरिएको थियो, नमूनाहरूलाई ५ mM dithiothreitol (DTT; Sigma) ले घटाइएको थियो, १५ mM iodoacetamide (Sigma) ले alkylated गरिएको थियो र ट्रिप्सिनाइजेसन: ट्रिप्सिन: सब्सट्रेट अनुपातको साथ १ घण्टाको लागि ३७ °C (१:० ५०) मा इन्क्युबेट गरिएको थियो। RapiGest लाई २०० mM HCl थपेर लाइस गरिएको थियो, त्यसपछि ३७ °C मा ४५ मिनेटको लागि इन्क्युबेशन र १४,००० rpm मा १० मिनेटको लागि ४ °C मा फोहोर हटाउनको लागि सेन्ट्रीफ्यूगेशन गरिएको थियो। नमूनाहरूलाई दोहोरो-मोड ठोस-चरण निकासी (Oasis MCX कार्ट्रिज, Waters) द्वारा धोइयो र ०.३३ µg µl-१ को अन्तिम प्रोटिन सांद्रताको लागि ०.१% फर्मिक एसिडमा पुन: निलम्बन गरिएको थियो। लेबल नगरिएका MAG प्रोटीओमहरू कुमारी पुरुषहरूबाट समान रूपमा विश्लेषण गरिएको थियो। दुई प्रत्येक नमूनाको लागि विश्लेषणात्मक प्रतिकृतिहरूको विश्लेषण गरिएको थियो। त्यसपछि, प्रत्येकको १ µg लाई २५-सेमी फ्युज्ड सिलिका ७५-μm स्तम्भ प्रयोग गरेर ४-सेमी फ्युज्ड सिलिका Kasil1 (PQ) फ्रिट ट्र्यापको साथ विश्लेषण गरिएको थियो जसमा जुपिटर C12 रिभर्स्ड-फेज रेजिन (फेनोमेनेक्स) र १८०-मिनेट लिक्विड क्रोमेटोग्राफी प्याक गरिएको थियो। नमूना डाइजेस्टहरू - MS/MS लाई nanoACQUITY UPLC प्रणाली (वाटर) को साथ Q-Exactive HF मास स्पेक्ट्रोमिटर (थर्मो फिशर) मा चलाइएको थियो। प्रत्येक रनको लागि उत्पन्न गरिएको डेटा-सम्बन्धित अधिग्रहण डेटालाई प्रोटियोविजार्ड (संस्करण 3.0.20287) प्रयोग गरेर र Comet31 (संस्करण 3.2) प्रयोग गरेर Anopheles gambiae (VectorBase संस्करण 54), Anopheles coluzzi बाट प्रोटीन अनुक्रमहरू भएको FASTA डाटाबेस विरुद्ध mzML ढाँचामा रूपान्तरण गरिएको थियो। Mali-NIH (VectorBase संस्करण 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, मार्च 2021), A. gambiae RNA-seq, र ज्ञात मानव प्रदूषकहरूको तीन-फ्रेम अनुवादहरूमा खोजी गरिएको थियो। पेप्टाइड नक्सा-मिल्ने FDR हरू ०.०१ को थ्रेसहोल्डको साथ Percolator32 (संस्करण 3.05) प्रयोग गरेर निर्धारण गरिएको थियो, र Limelight33 मा प्रोटीन पार्सिमोनी प्रयोग गरेर पेप्टाइडहरू प्रोटीन पहिचानमा भेला गरिएको थियो। (संस्करण २.२.०)। पहिले वर्णन गरिए अनुसार प्रत्येक रनमा प्रत्येक प्रोटिनको लागि गणना गरिएको सामान्यीकृत स्पेक्ट्रल प्रशस्तता कारक (NSAF) प्रयोग गरेर सापेक्षिक प्रोटिन प्रशस्तता अनुमान गरिएको थियो। प्रत्येक प्रोटिनको सापेक्ष NSAF दुई फरक जैविक प्रतिकृतिहरूबाट नमूनाहरूमा औसत गरिएको थियो। १५N लेबलिङले महिला प्रोटियोमलाई सफलतापूर्वक मास्क गर्यो, यद्यपि लेबल गरिएका कुमारीहरूबाट थोरै मात्रामा लेबल नगरिएको प्रोटिन पत्ता लगाउन सकियो। हामीले महिला कच्चा नमूनाहरूमा पुरुष प्रोटिन घटाउने (१-५ स्पेक्ट्रा) पत्ता लगाउने रेकर्ड गर्यौं केवल प्राविधिक रनहरूमा, जहाँ कच्चा नमूनाहरू पुरुष/मिलन नमूनाहरू पछि चलाइएको थियो, HPLC "क्यारी ओभर" को परिणामस्वरूप। लेबल गरिएका कुमारीहरूबाट 'दूषित पदार्थ' को रूपमा पाइने कहिलेकाहीं प्रोटिनहरू पूरक तालिका १ मा सूचीबद्ध छन्।
जेनस्क्रिप्टमा दुई एन्टिजेनिक पेप्टाइडहरू, QTTDRVAPAPDQQQ (आइसोटाइप PA भित्र) र MESDGTTPSGDSEQ (आइसोटाइप PA र PB भित्र)। दुई पेप्टाइडहरू संयुक्त थिए, त्यसपछि वाहक प्रोटीन KLH मा संयुग्मित थिए र न्यूजील्याण्ड खरायोहरूमा इंजेक्शन गरिएको थियो। चौथो इंजेक्शन पछि खरायोहरूको बलिदान गरिएको थियो, र कुल IgG लाई आत्मीयता शुद्धीकरण द्वारा अलग गरिएको थियो। सबैभन्दा EPP-विशिष्ट खरायोबाट IgG थप पश्चिमी ब्लटिंगको लागि प्रयोग गरिएको थियो।
पश्चिमी ब्लटहरूको लागि, MAG (n = १०, जहाँ n ले जैविक रूपमा स्वतन्त्र लामखुट्टे नमूनाहरूको संख्या प्रतिनिधित्व गर्दछ) र ४-दिनका कुमारी भाले र कुमारी वा जबरजस्ती-मिलाएका पोथीहरू (<१० पोस्ट-मिलाउने), प्रोटिन निकासी बफर (५० mM Tris, pH ८.०; १% NP-४०; ०.२५% सोडियम डिअक्सिकोलेट; १५० mM NaCl; १ mM EDTA; १× प्रोटीज इनहिबिटर ककटेल (रोचे)) बाट पोथी LRT (n = ३०) छुट्टै थपिएको थियो। नमूनाहरू बिडर (२ मिमी गिलास मोती, २,४०० rpm, ९० सेकेन्ड) सँग विच्छेदन पछि तुरुन्तै एकरूप बनाइयो। अघुलनशील मलबेलाई ४ डिग्री सेल्सियसमा २०,००० ग्राममा केन्द्रापसारद्वारा हटाइयो। प्रोटीनहरू ब्राडफोर्ड परख (बायो-र्याड) द्वारा परिमाणित गरियो। त्यसपछि, २० µg MAG प्रोटीन, ४० µg LRT प्रोटीन, र २० µg अवशिष्ट बल्क प्रोटिनलाई MOPS बफर प्रयोग गरेर १०% Bis-Tris NuPAGE द्वारा विकृत र अलग गरिएको थियो। iBlot2 स्थानान्तरण प्रणाली (थर्मो फिशर) प्रयोग गरेर प्रोटिनहरूलाई पोलिभिनिलिडेन फ्लोराइड झिल्लीमा स्थानान्तरण गरिएको थियो। झिल्लीहरूलाई १× PBS-T (PBS मा ०.१% Tween-२०) मा दुई पटक धोइयो र त्यसपछि २२°C मा १ घण्टाको लागि Odyssey ब्लकिङ बफर (Li-Cor) मा ब्लक गरियो। अनुकूलन खरायो एन्टी-EPP पोलिक्लोनल प्राथमिक एन्टिबडी (ब्लकिङ बफरमा १:७००) र मुसा एन्टी-एक्टिन मोनोक्लोनल प्राथमिक एन्टिबडी MAC237 (Abeam; १:४,०००) को साथ ४°C मा झिल्लीहरूलाई रातभर हल्लाइयो। झिल्लीहरूलाई PBS-T ले धोइयो र त्यसपछि माध्यमिक एन्टिबडीहरू (गधा एन्टी-खरायो ८००CW र बाख्रा एन्टी-मुसा ६८०LT (Li-Cor), दुबै १:२०,०००) ब्लकिङ बफरमा ०.०१% SDS र २२ डिग्री सेल्सियसमा १ घण्टाको लागि ०.२% ट्विन -२०। झिल्लीहरू PBS-T ले धोइएका थिए र ओडिसी CLx स्क्यानरद्वारा छविहरू लिइएका थिए। छविहरू छवि स्टुडियो (संस्करण ५.२) मा सङ्कलन र प्रशोधन गरिएका थिए। EPP-RA आइसोफर्म (८२ kDa) सँग सम्बन्धित कुनै विशिष्ट ब्यान्ड पत्ता लागेन।
EPP को कोडिङ क्षेत्रहरू (हिस्टिडाइन फास्फेटेज डोमेन भएको आइसोफर्म AGAP002463-RB को रूपमा, NCBI संरक्षित डोमेन खोज 34) र EcK2 (AGAP002181) लाई pET-21a(+) प्लाज्मिड (नोभाजेन मिलिपोर सिग्मा) मा क्लोन गरिएको थियो; प्राइमरहरू विस्तारित डेटा तालिका २ मा सूचीबद्ध छन्। pET-21a(+)-EcK2 निर्माणको C-टर्मिनल 6xHis ट्याग अघि आठ GS4 लिङ्करहरू (टेन्डममा) सम्मिलित गरिएको थियो। NEBExpress सेल-मुक्त E. coli प्रोटीन संश्लेषण प्रतिक्रिया (न्यू इङ्गल्याण्ड बायोल्याब्स) प्रयोग गरेर पुन: संयोजक प्रोटीनहरू उत्पादन गरिएको थियो। NEBExpress Ni स्पिन स्तम्भहरू (न्यू इङ्गल्याण्ड बायोल्याब्स) प्रयोग गरेर पुन: संयोजक प्रोटीनहरू शुद्ध गरिएको थियो। NEBExpress सेल-मुक्त E. coli प्रोटीन संश्लेषण किटबाट DNA टेम्प्लेट प्रयोग गरेर डाइहाइड्रोफोलेट रिडक्टेज (DHFR) नियन्त्रण प्रोटीन उत्पादन गरिएको थियो। प्रोटीनहरू PBS मा -20 °C मा 3 महिनासम्म 50% ग्लिसरोलमा भण्डारण गरिएको थियो।
EPP र टिस्यु अर्कको फस्फेटेज गतिविधि ४-नाइट्रोफेनिल फस्फेट (pNPP; सिग्मा-एल्ड्रिच) प्रयोग गरेर मापन गरिएको थियो। प्रतिक्रिया बफरमा २५ mM Tris, ५० mM एसिटिक एसिड, २५ mM Bis-Tris, १५० mM NaCl, ०.१ mM EDTA, र १ mM DTT थियो। प्रतिक्रिया बफरमा टिस्युलाई एकरूप बनाइएको थियो र सेन्ट्रीफ्यूगेशनद्वारा सेल मलबे हटाइएको थियो। २.५ mg ml-१ pNPP भएको प्रतिक्रिया बफरमा इन्जाइम वा टिस्यु अर्क थपेर प्रतिक्रिया सुरु गर्नुहोस्। प्रतिक्रिया मिश्रणलाई अँध्यारोमा कोठाको तापक्रममा इन्क्युबेट गरिएको थियो, र pNPP बाट रूपान्तरित pNP को मात्रा विभिन्न समयमा ४०५ nm मा अवशोषण मापन गरेर परिमाण गरिएको थियो।
इन भिट्रो EcK गतिविधिको लागि, प्रोटिनलाई ०.२ मिलीग्राम २०E वा ३D२०E ले २०० µl बफर (pH ७.५) मा १० mM HEPES–NaOH, ०.१% BSA, २ mM ATP र १० mM MgCl2 भएको २७ °C मा २ घण्टाको लागि इन्क्युबेट गरिएको थियो। ८०० µl मेथानोल थपेर प्रतिक्रिया रोकिएको थियो, त्यसपछि -२० °C मा १ घण्टाको लागि चिसो पारिएको थियो, त्यसपछि ४ °C मा १० मिनेटको लागि २०,००० ग्राममा सेन्ट्रीफ्यूज गरिएको थियो। त्यसपछि सुपरनेटेन्टलाई HPLC-MS/MS द्वारा विश्लेषण गरिएको थियो। नियन्त्रण समूहमा प्रयोग गरिएका प्रोटिनहरूलाई ताप-निष्क्रिय गर्न, प्रोटिनहरूलाई ९५°C मा २० मिनेटको लागि PBS मा ५०% ग्लिसरोलमा इन्क्युबेट गरिएको थियो।
इन भिट्रो EPP गतिविधिको लागि, प्रोटिनलाई १०० µl बफर (pH ७.५) मा ३D20E22P (HPLC-MS/MS द्वारा शुद्ध गरिएको १८ जोडी MAG मा पाइने मात्रा बराबर) संग इन्क्युबेट गरिएको थियो जसमा २५ mM Tris, ५० mM एसिटिक एसिड, २५ mM Bis-Tris, १५० mM NaCl, ०.१ mM EDTA, र १ mM DTT समावेश थियो जुन २७ °C मा ३ घण्टाको लागि थियो। ४०० µl मेथानोल थपेर प्रतिक्रिया रोकियो र -२० °C मा १ घण्टाको लागि चिसो पारियो, त्यसपछि २०,००० ग्राममा १० मिनेटको लागि ४ °C मा सेन्ट्रीफ्यूज गरियो। सुपरनेटेन्टलाई HPLC-MS/MS द्वारा विश्लेषण गरिएको थियो।
EPP (३६२ bp), EcK1 (AGAP004574, ३६५ bp) र EcK2 (५५६ bp) को लागि PCR टुक्राहरू मिश्रित-लिङ्गी टाउको नभएको लामखुट्टेको लाशबाट तयार पारिएको cDNA बाट प्रवर्द्धन गरिएको थियो। eGFP नियन्त्रणको PCR टुक्रा (४९५ bp) पहिले वर्णन गरिएको pCR2.1-eGFP बाट प्रवर्द्धन गरिएको थियो; PCR प्राइमरहरू विस्तारित डेटा तालिका २ मा सूचीबद्ध छन्। PCR टुक्रा pL4440 प्लाज्मिडमा उल्टो T7 प्रमोटरहरू बीच सम्मिलित गरिएको थियो। प्लाज्मिड निर्माणहरू NEB 5-α सक्षम E. coli (न्यू इङ्गल्याण्ड बायोल्याब्स) बाट पुन: प्राप्त गरिएको थियो र प्रयोग गर्नु अघि DNA अनुक्रमण द्वारा प्रमाणित गरिएको थियो (इन्सर्ट अनुक्रमको लागि पूरक डेटा 1 हेर्नुहोस्)। T7 प्रमोटर (विस्तारित डेटा तालिका 2) सँग मिल्ने प्राइमरहरू pL4440-आधारित प्लाज्मिडबाट सम्मिलित विस्तार गर्न प्रयोग गरिएको थियो। PCR उत्पादन आकार agarose जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा पुष्टि गरिएको थियो। dsRNA मेगास्क्रिप्ट T7 ट्रान्सक्रिप्शन किट (थर्मो फिशर) प्रयोग गरेर PCR टेम्प्लेटहरूबाट ट्रान्सक्राइब गरिएको थियो र पहिले वर्णन गरिएका परिमार्जनहरू सहित निर्माताको निर्देशन अनुसार शुद्ध गरिएको थियो।
dsRNA इंजेक्शनको लागि, १,३८० ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) लाई इक्लोजन पछि १ दिन भित्र वयस्क पुरुष वा महिला (Nanoject III, Drummond) को छातीमा १० ng nl-१ को सांद्रतामा इंजेक्शन गरिएको थियो। RNA निकासी, cDNA संश्लेषण, र RT-qPCR द्वारा कम्तिमा तीन जैविक प्रतिकृतिहरूमा जीन नकडाउन स्तरहरू निर्धारण गरिएको थियो। ecdysone इंजेक्शनको लागि, ४-दिनकी कुमारी वा ६-दिनकी कुमारी रगत खुवाउने महिलाहरूलाई प्रयोगात्मक डिजाइन वा ६.३ ng nl-१ मा निर्भर गर्दै क्रमशः १.३, २.१ को सांद्रतामा २०E वा ३D२०E (Nanoject III, Drummond) को ०.१३, ०.२१, वा ०.६३ µg इंजेक्शन गरिएको थियो। १०% (भोल्युम/भोल्युम) इथेनॉलको १०० nl इन्जेक्सन गर्नुहोस्। पानीमा; १०% इथेनॉलमा १०० एनएल 3D20E22P (MAGs को एक जोडीमा पाइने मात्राको ७५% बराबर)। लामखुट्टेहरू अनियमित रूपमा इंजेक्शन समूहमा तोकिएका थिए।
स्प्यानिङ परीक्षणको लागि, ३ दिन उमेरका पोथीहरूलाई मानव रगत खुवाइयो। आंशिक रूपमा खुवाइएको वा नखुवाइएको लामखुट्टेहरू हटाउनुहोस्। उपचारको आधारमा, पोथीहरूलाई रगत खाएको कम्तिमा ४८ घण्टा पछि चार रातको लागि छुट्टै स्प्यानिङ कपमा राखिएको थियो। स्टेरियोस्कोप (स्टेमी ५०८, जेइस) अन्तर्गत अण्डाहरू गणना गरिएको थियो; मिलन गरिएका पोथीहरूका लागि, लार्भामा निस्केका अण्डाहरूलाई उर्वर मानिन्थ्यो।
संभोग परीक्षणको लागि, महिलाहरूलाई संभोगको प्रतिरोध विकास गर्न उपचारको आधारमा कम्तिमा २ दिन अनुमति दिइएको थियो, र जंगली-प्रकारको उमेर-मिल्ने भालेहरूलाई पछि एउटै पिंजरामा ल्याइयो। दुई रात पछि, पोथी निषेचित भेसिकलहरू विच्छेदन गरियो र जीनोमिक डीएनए फ्रिज-थाउ र सोनिकेशनद्वारा १० एमएम ट्रिस-एचसीएल, १ एमएम ईडीटीए, र २५ एमएम NaCl (पीएच ८.२) भएको बफरमा रिलिज गरियो। नमूनाहरूलाई प्रोटीनेज के (०.८६ µg µl-१) ले ५५ डिग्री सेल्सियसमा १५ मिनेटको लागि इन्क्युबेट गरिएको थियो, त्यसपछि ९५ डिग्री सेल्सियसमा १० मिनेट। कच्चा जीनोमिक डीएनए तयारीहरू १०-गुणा पातलो पारिएको थियो र Y क्रोमोजोम अनुक्रमहरूको qPCR पत्ता लगाउने अधीनमा राखिएको थियो; प्राइमरहरू विस्तारित डेटा तालिका २ मा सूचीबद्ध छन्। Y क्रोमोजोम अनुक्रमको अनुपस्थितिले कुनै संभोग नभएको संकेत गर्दछ।
पुन: मिलन परीक्षणको लागि, बलपूर्वक मिलन गरिएका महिलाहरूलाई मिलन स्थिति पुष्टि गर्न मिलन प्लगहरूको उपस्थितिको लागि जाँच गरियो र पुरुषहरूको अनुपस्थितिमा मिलनको लागि अपवर्तकता विकास गर्न २ दिनको समय दिइयो, जस्तै पहिले वर्णन गरिएको छ 36। DsRed ट्रान्सजेनिक शुक्राणु बोक्ने पुरुषहरूलाई त्यसपछि महिला पिंजराहरूमा परिचय गराइयो। दुई रात पछि, महिलाहरूबाट निषेचन गर्ने भेसिकलहरू विच्छेदन गरियो, र माथि वर्णन गरिए अनुसार जीनोमिक DNA तयार गरियो र DsRed ट्रान्सजीनको qPCR पत्ता लगाइयो; प्राइमरहरू विस्तारित डेटा तालिका २ मा सूचीबद्ध छन्। DsRed ट्रान्सजीनको अनुपस्थितिले संकेत गर्‍यो कि कुनै पनि मिलन भएको छैन।
3D20E लाई पहिले वर्णन गरिए अनुसार संश्लेषित गरिएको थियो 37। संक्षेपमा, 10 मिलीग्राम 20E (सिग्मा-एल्ड्रिच) 10 मिलीग्राम पानीमा घोलिएको थियो, त्यसपछि 30 मिलीग्राम प्लेटिनम ब्ल्याक (पाउडरको रूपमा, सिग्मा-एल्ड्रिच) थपिएको थियो। प्रतिक्रिया मिश्रणमा O2 को एक कोमल धारा निरन्तर बबल गरिएको थियो, जुन कोठाको तापक्रममा हलचल गरिएको थियो। 6 घण्टा पछि, प्रतिक्रिया रोक्न 30 मिलीलीटर मेथानोल थपिएको थियो। उत्प्रेरक कणहरू हटाउन मिश्रणलाई सेन्ट्रीफ्यूज गरिएको थियो। सुपरनेटेन्टलाई कोठाको तापक्रममा भ्याकुओमा सुख्खा हुन वाष्पीकरण गरिएको थियो। HPLC-MS/MS विश्लेषणको लागि इंजेक्शनको लागि सुकेको प्रतिक्रिया उत्पादनलाई 10% इथेनॉल र मेथानोलमा घोलिएको थियो। रूपान्तरण दर (20E देखि 3D20E सम्म) लगभग 97% थियो (चित्र 4b), र संश्लेषित 3D20E को MS स्पेक्ट्रम मिलेको महिलाहरूमा पाइनेसँग मेल खायो (चित्र 4c)।
किंवदन्तीमा गरिएका तथ्याङ्कीय परीक्षणहरूको विशिष्ट विवरणहरू छन्। फिशरको सटीक परीक्षण, म्यानटेल-कक्स परीक्षण, र विद्यार्थीको टी-परीक्षण गर्न ग्राफप्याड (संस्करण ९.०) प्रयोग गरिएको थियो। कोचरान-म्यानटेल-हेन्सेल परीक्षणहरू अनुकूलन आर स्क्रिप्ट (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test मा उपलब्ध) प्रयोग गरेर गरिएको थियो। ०.०५ को महत्व थ्रेसहोल्डको साथ शापिरो-विल्क परीक्षण प्रयोग गरेर डेटा वितरण सामान्यताको लागि परीक्षण गरिएको थियो। जब डेटा सामान्यता परीक्षणमा असफल भयो, मान-ह्विटनी परीक्षण गरिएको थियो। म्यानटेल-कक्स परीक्षण प्रयोग गरेर बाँच्ने डेटा विश्लेषण गरिएको थियो। RNA-seq जीन-स्तर भिन्नता अभिव्यक्ति विश्लेषण गर्न DESeq2 प्याकेज (संस्करण १.२८.१) प्रयोग गरिएको थियो। ग्राफमा रहेको तेर्सो पट्टीले मध्यकलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ। सबै परीक्षणहरूको लागि थ्रेसहोल्डको रूपमा P = ०.०५ को महत्व मान प्रयोग गरिएको थियो।
अध्ययन डिजाइनको बारेमा थप जानकारीको लागि, यस लेखमा लिङ्क गरिएको प्रकृति अनुसन्धान रिपोर्ट सारांश हेर्नुहोस्।
एमएस प्रोटोमिक डेटा डेटासेट पहिचानकर्ता PXD032157 को साथ PRIDE पार्टनर रिपोजिटरी (https://www.ebi.ac.uk/pride/) मार्फत प्रोटियोमएक्सचेन्ज कन्सोर्टियम (http://proteomecentral.proteomexchange.org) मा जम्मा गरिएको थियो।
RNA-seq डेटासेटलाई सिरियल रेकर्ड GSE198665 अन्तर्गत जीन एक्सप्रेशन कम्प्रिहेन्सिभ लाइब्रेरी (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) मा जम्मा गरिएको छ।
हालको अध्ययनको क्रममा उत्पन्न र/वा विश्लेषण गरिएका थप डेटासेटहरू सम्बन्धित लेखकहरूबाट उचित अनुरोधमा प्राप्त गर्न सकिन्छ। यो लेखले स्रोत डेटा प्रदान गर्दछ।
डे लुफ, ए. एक्डिस्टेरोइड्स: उपेक्षित कीरा सेक्स स्टेरोइड्स? पुरुष: ब्ल्याक बक्स। कीरा विज्ञान।१३, ३२५–३३८ (२००६)।
रेडफर्न, CPF २०-हाइड्रोक्साइक्डाइसोन र एनोफिलिसमा डिम्बग्रंथि विकास स्टीफन्स। जे. इन्सेक्ट फिजियोलोजी।२८, ९७–१०९ (१९८२)।