सेल कम्पार्टमेन्टलाइजेसन र होमियोस्टेसिस कायम राख्नको लागि सेक्रेटरी मार्गमा प्रोटीन क्रमबद्ध गर्नु आवश्यक छ। शेल-मध्यस्थता क्रमबद्ध गर्नुको अतिरिक्त, सेक्रेटरी ट्रान्सपोर्टको प्रक्रियामा काइनेसिन क्रमबद्धमा लिपिडको भूमिका लामो समयदेखि चलिरहेको आधारभूत प्रश्न हो जुन अझै उत्तर दिइएको छैन। यहाँ, हामी धेरै लामो सेरामाइड लिपिड मोइटीहरू भएका नयाँ संश्लेषित ग्लाइकोसिल्फोस्फेटिडायलिनोजिटोल-इमोबिलाइज्ड प्रोटीनहरू क्लस्टर गरिएका छन् र विशेष एन्डोप्लाज्म नेट एक्जिट साइटमा वर्गीकृत गरिएका छन् भनेर प्रमाणित गर्न 3D एकसाथ बहुरंगी उच्च-रिजोल्युसन वास्तविक-समय इमेजिङ गर्छौं, जुन ट्रान्समेम्ब्रेन प्रोटीनहरूले प्रयोग गर्ने भन्दा फरक छ। थप रूपमा, हामी देखाउँछौं कि एन्डोप्लाज्मिक रेटिकुलम झिल्लीमा सेरामाइडको चेन लम्बाइ यस क्रमबद्ध चयनको लागि महत्त्वपूर्ण छ। हाम्रो अध्ययनले सेक्रेटरी मार्गमा लिपिड चेन लम्बाइको आधारमा प्रोटीन कार्गोहरूलाई सेक्रेटरी मार्गमा चयनात्मक निर्यात साइटहरूमा वर्गीकृत गर्ने पहिलो प्रत्यक्ष इन भिभो प्रमाण प्रदान गर्दछ।
युकेरियोटिक कोषहरूमा, एन्डोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ER) मा संश्लेषित प्रोटीनहरू त्यसपछि तिनीहरूको उपयुक्त सेलुलर गन्तव्यमा डेलिभरीको लागि स्रावित मार्ग मार्फत ढुवानीको क्रममा क्रमबद्ध गरिन्छ (१)। कोट-मध्यस्थता क्रमबद्ध गर्नुको अतिरिक्त, यो लामो समयदेखि अनुमान गरिएको थियो कि निश्चित लिपिडहरूले विशिष्ट प्रोटीनहरू (२-५) मा क्लस्टर गरेर चयनात्मक निकास बिन्दुहरूको रूपमा पनि काम गर्न सक्छन्। यद्यपि, यो सम्भावित लिपिड-आधारित संयन्त्र प्रमाणित गर्न प्रत्यक्ष इन भिभो प्रमाणको अभाव अझै छ। यो आधारभूत समस्या समाधान गर्न, हामीले यीस्टमा अध्ययन गर्यौं कि कसरी ग्लाइकोसिलफोस्फेटिडायलिनोसिटोल (GPI) एङ्कर गरिएको प्रोटीन (GPI-APs) ER बाट फरक रूपमा निर्यात गरिन्छ। GPI-APs लिपिड-जडित सेल सतह प्रोटीनहरूको एक प्रकार हो (६, ७)। GPI-AP ग्लाइकोलिपिड मोइटी (GPI एङ्कर) मार्फत प्लाज्मा झिल्लीको बाहिरी पत्रकहरूमा जोडिएको एक स्रावित प्रोटीन हो। तिनीहरूले ER लुमेन (८) मा रूढिवादी पोस्ट-अनुवादात्मक परिमार्जनहरूको रूपमा GPI एङ्करहरू स्वीकार गर्छन्। संलग्नता पछि, GPI-AP ER बाट प्लाज्मा झिल्लीमा Golgi उपकरण (5, 9) मार्फत जान्छ। GPI एङ्करहरूको उपस्थितिले GPI-AP लाई स्रावित मार्ग (5, 9, 10) मा ट्रान्समेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीनहरू (अन्य प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीनहरू सहित) बाट अलग ढुवानी गर्न बाध्य पार्छ। यीस्ट कोषहरूमा, GPI-AP हरूलाई एन्डोप्लाज्मिक रेटिकुलममा अन्य स्रावित प्रोटीनहरूबाट अलग गरिन्छ, र त्यसपछि कोट प्रोटीन कम्प्लेक्स II (COPII) (6, 7) द्वारा बेरिएको अद्वितीय भेसिकलहरूमा प्याकेज गरिन्छ। ER निर्यात प्रक्रियामा यस वर्गीकरण प्रक्रियाको निर्धारकहरू अस्पष्ट छन्, तर यो अनुमान गरिएको छ कि यो संयन्त्रलाई लिपिडहरू आवश्यक पर्न सक्छ, विशेष गरी GPI एङ्करको लिपिड भागको संरचनात्मक पुनर्निर्माण (5, 8)। यीस्टमा, GPI लिपिड पुनर्निर्माण GPI संलग्न भएपछि तुरुन्तै सुरु हुन्छ, र धेरै अवस्थामा, यसले सेरामाइडलाई 26-कार्बन लामो-श्रृंखला संतृप्त फ्याटी एसिड (C26:0) (11, 12) मा बाँध्न बाध्य पार्छ। C26 सेरामाइड अहिलेसम्म खमीर कोषहरूद्वारा उत्पादित मुख्य सेरामाइड हो। यो ER मा संश्लेषित गरिन्छ र यसको धेरैजसो भाग COPII भेसिकलहरू (13) मार्फत Golgi उपकरणमा निर्यात गरिन्छ। GPI-AP को ER निर्यातलाई विशेष रूपमा निरन्तर सेरामाइड संश्लेषण (14, 15) आवश्यक पर्दछ, र फलस्वरूप, Golgi उपकरणमा सेरामाइडलाई इनोसिटोल फस्फेट सेरामाइड (IPC) मा रूपान्तरण GPI एंकर संश्लेषण (16) मा निर्भर गर्दछ। कृत्रिम झिल्लीहरूसँग बायोफिजिकल अध्ययनहरूले देखाएको छ कि धेरै लामो एसाइल चेन सेरामाइडहरू अद्वितीय भौतिक गुणहरू (17, 18) भएका क्रमबद्ध डोमेनहरू बनाउन एकताबद्ध हुन सक्छन्। यी तथ्याङ्कहरूले यो परिकल्पनामा डोर्‍याउँछन् कि C26 सेरामाइड र GPI-AP C26 सेरामाइडसँग मिलेर अपेक्षाकृत अव्यवस्थित ER झिल्ली लिपिड वातावरणमा व्यवस्थित क्षेत्रहरू वा क्षेत्रहरूमा एकताबद्ध हुन आफ्नो भौतिक गुणहरू प्रयोग गर्छन्। यो मुख्यतया छोटो र असंतृप्त ग्लिसरोलिपिडहरू (C16:1 र C18:1) (19, 20) बाट बनेको हुन्छ। यी क्षेत्रहरू विशिष्ट ER निकास साइटहरू (ERES) मा चयनात्मक रूपमा केन्द्रित हुनेछन्, जहाँ सेरामाइड र सेरामाइड-आधारित GPI-AP लाई एउटै समर्पित COPII भेसिकल (5) मा गोलगीमा सह-ट्रान्सपोर्ट गर्न सकिन्छ।
यस अध्ययनमा, हामीले सुपर-रिजोल्युसन कन्फोकल रियल-टाइम इमेजिङ माइक्रोस्कोपी (SCLIM) प्रयोग गरेर यो लिपिड-आधारित संयन्त्रको प्रत्यक्ष परीक्षण गरेका छौं, जुन एक अत्याधुनिक माइक्रोस्कोपी प्रविधि हो जसले एकै साथ फ्लोरोसेन्टली लेबल गरिएको प्रोटीनहरू अवलोकन गर्न सक्छ। तीन-रङ र त्रि-आयामिक (3D) छविहरूमा जीवित कोशिकाहरूमा अत्यन्त उच्च रिजोल्युसन र गति हुन्छ (21, 22)।
हामीले पहिले SCLIM प्रविधि प्रयोग गर्यौं जसले S. cerevisiae मा ER छोडेपछि ट्रान्समेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीनबाट C26 सेरामाइड समूह भएको सामान्य GPI-AP कसरी स्क्रिन गरिएको थियो भनेर थप परिभाषित गर्दछ। ER को वर्गीकरण जाँच गर्न, हामीले एउटा आनुवंशिक प्रणाली प्रयोग गर्यौं जसले ERES मा प्रवेश गर्ने नयाँ संश्लेषित कार्गोलाई प्रत्यक्ष रूपमा कल्पना गर्न सक्छ (7, 23)। कार्गोको रूपमा, हामीले हरियो फ्लोरोसेन्ट प्रोटीन (GFP) ले लेबल गरिएको C26 सेरामाइड-आधारित GPI-AP Gas1 र नजिक-इन्फ्रारेड फ्लोरोसेन्ट प्रोटीन (iRFP) ले लेबल गरिएको ट्रान्समेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन Mid2 छनौट गर्यौं, जसले दुवै प्लाज्मा झिल्लीलाई लक्षित गर्दछ (24-26)। sec31-1 तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्तीमा, यी दुई कार्गोहरू ग्यालेक्टोज-इन्ड्युसिबल प्रमोटर र एक संवैधानिक ERES मार्कर अन्तर्गत व्यक्त गरिन्छ। चरम तापक्रम (37°C) मा, किनभने sec31-1 उत्परिवर्तनले COPII कोट घटक Sec31 को कार्यलाई COPII अंकुरण र ER निर्यातलाई रोक्न असर गर्छ, नयाँ संश्लेषित कार्गो ER (23) मा जम्मा हुन्छ। कम तापक्रम (२४°C) मा चिसो भएपछि, sec31-1 उत्परिवर्ती कोषहरू स्राव क्षेत्रबाट पुन: प्राप्त भए, र संचित नयाँ सिंथेटिक कार्गो ER बाट निर्यात गर्न थालियो। CLIM दृश्यले देखाएको छ कि धेरैजसो नयाँ संश्लेषित Gas1-GFP र Mid2-iRFP अझै पनि sec31-1 उत्परिवर्ती कोषहरूको ER मा ३७°C मा इन्क्युबेशन पछि जम्मा हुन्छन् र त्यसपछि २४°C मा ५ मिनेटको लागि छोडिन्छन् (चित्र १)। Mid2-iRFP सम्पूर्ण ER झिल्लीमा वितरित भएको हुनाले, र Gas1-GFP विच्छेदनशील ER झिल्ली क्षेत्रमा केन्द्रित र जम्मा भएको हुनाले, तिनीहरूको वितरण पूर्ण रूपमा फरक छ (चित्र १, A देखि C र चलचित्र S1)। थप रूपमा, चित्र १D मा देखाइए अनुसार, Gas1-GFP क्लस्टरमा Mid2-iRFP छैन। यी परिणामहरूले GPI-AP र ट्रान्समेम्ब्रेन प्रोटीनहरूलाई प्रारम्भिक रूपमा फरक ER झिल्ली क्षेत्रहरूमा अलग गरिएको संकेत गर्दछ। Gas1-GFP क्लस्टर mCherry को COPII कोट प्रोटीन Sec13 (चित्र 1, E र F, र चलचित्र S1) (23) ले लेबल गरिएको विशिष्ट ERES सँग जोडिएको छ।
sec31-1 कोषहरूले ग्यालेक्टोज-प्रेरित स्राव, लामो एसिल चेन (C26) सेरामाइड GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, हरियो) र ट्रान्समेम्ब्रेन प्रोटीन Mid2-iRFP (TMP, नीलो) व्यक्त गर्छन् र यो रचनात्मक ERES लेबलिंग Sec13-mCherry (ERES, म्याजेन्टा) लाई ३७°C मा ३० मिनेटको लागि इन्क्युबेट गरिएको थियो, २४°C मा सारिएको थियो, र ५ मिनेट पछि SCLIM द्वारा छवि गरिएको थियो। (A देखि C) ले प्लेन (A) को प्रतिनिधि मर्ज गरिएको वा एकल २D छवि, १० z-खण्डहरू (B) को २D प्रक्षेपण छवि वा कार्गो र ERES मार्करहरू (C) को ३D सेल गोलार्ध छवि देखाउँछ। स्केल बार १μm (A र B)। स्केल एकाइ ०.५५१μm (C) हो। Gas1-GFP अलग ER क्षेत्रहरू वा क्लस्टरहरूमा पत्ता लगाइएको थियो, जबकि Mid2-iRFP पत्ता लगाइएको थियो र ER झिल्ली (C) भरि वितरण गरिएको थियो। (D) ग्राफले सेतो तीर रेखा (बायाँ) सँगसँगै Gas1-GFP क्लस्टरमा Gas1-GFP र Mid2-iRFP को सापेक्षिक प्रतिदीप्ति तीव्रता देखाउँछ। AU, मनमानी एकाइ। (E र F) ले सामान र ERES चिन्हलाई संयोजन गर्ने 3D छविलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ। विशिष्ट ERES नजिकै Gas1-GFP क्लस्टरहरू पत्ता लगाइयो। स्केल एकाइ 0.551μm छ। (F) सेतो ठोस तीरले ERES सँग सम्बन्धित Gas1-GFP क्लस्टरलाई चिन्ह लगाउँछ। मध्य र दायाँ प्यानलहरूले मर्ज गरिएको विस्तारित 3D छवि र चयन गरिएको Gas1-GFP क्लस्टरको घुमाइएको दृश्य देखाउँछन्।
Gas1-GFP क्लस्टर र एक विशिष्ट ERES बीचको नजिकको स्थानिय सम्बन्धले Gas1-GFP ले चयनात्मक ERES मा प्रवेश गर्न सक्छ भन्ने संकेत गर्छ, जुन ER छोड्न Mid2-iRFP द्वारा प्रयोग गरिएको चयनात्मकता भन्दा फरक छ। यो सम्भावनालाई सम्बोधन गर्न, हामीले केवल एक वा दुई सामानहरूको लागि ERES अनुपात परिमाण गर्यौं (चित्र 2, A देखि C)। हामीले फेला पार्यौं कि धेरैजसो ERES (70%) मा केवल एक प्रकारको कार्गो हुन्छ। चित्र 2C को तल्लो छविले केवल Gas1-GFP (चित्र 1) वा केवल Mid2-iRFP (चित्र 2) भएका ERES का दुई विशिष्ट उदाहरणहरू देखाउँछ। यसको विपरित, लगभग ERES को 20% मा दुई कार्गोहरू हुन्छन् जुन एउटै क्षेत्रमा ओभरल्याप हुन्छन्। यो पत्ता लाग्यो कि केही ERES (10%) मा दुई प्रकारका कार्गोहरू थिए, तर तिनीहरू स्पष्ट रूपमा फरक क्षेत्रहरूमा अलग थिए। त्यसकारण, यो तथ्याङ्कीय विश्लेषणले देखाउँछ कि ER निर्यात गरिसकेपछि, GPI-AP Gas1-GFP र ट्रान्समेम्ब्रेन कार्गो Mid2-iRFP फरक ERES (चित्र 2D) मा विभाजित हुन्छन्। यो क्रमबद्ध दक्षता अघिल्लो जैव रासायनिक विश्लेषण (6) र रूपात्मक निर्धारण (7) सँग धेरै सुसंगत छ। हामी ERES मा प्रवेश गर्ने क्वारेन्टाइन गरिएको कार्गोको व्यवहार पनि अवलोकन गर्न सक्छौं (चित्र 2E र चलचित्र S2)। चित्र 2E ले देखाउँछ कि Gas1-GFP (प्यानल 3) वा Mid2-iRFP (प्यानल 4) को सानो भाग मात्र एक तर्फबाट ERES मा प्रवेश गर्दछ र एक अलग क्षेत्रमा सीमित छ। चित्र 2E को प्यानल 5 ले देखाउँछ कि Gas1-GFP र Mid2-iRFP कहिलेकाहीं एउटै ERES मा पाइन्छ, तर तिनीहरू फरक पक्षबाट प्रवेश गर्छन् र फरक COPII भेसिकलहरू प्रतिनिधित्व गर्न सक्ने छुट्टाछुट्टै क्षेत्रहरूमा केन्द्रित हुन्छन्। हामीले यो पनि पुष्टि गर्यौं कि C26 सेरामाइड-आधारित GPI-AP Gas1 को चयनात्मक ERES को रूपमा अवलोकन गरिएको पृथकीकरण र वर्गीकरण विशिष्ट छ किनभने अर्को ट्रान्समेम्ब्रेन स्राव कार्गो, GFP-ट्याग गरिएको प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन Axl2 (27), Mid2-iRFP जस्तै व्यवहार देखाउँदै। (चित्र S1 र चलचित्र S3)। नयाँ संश्लेषित Axl2-GFP Mid2-iRFP (चित्र S1, A र B) जस्ता ER झिल्ली मार्फत वितरण गरिन्छ, र धेरैजसो ERES (चित्र S1, B देखि D) मा Mid2-iRFP सँग सह-स्थानीयकृत हुन्छ। चित्र १ को प्यानल १ र २। S1C ले ERES का दुई विशिष्ट उदाहरणहरू देखाउँछ जहाँ दुई ट्रान्समेम्ब्रेन कार्गोहरू ओभरल्याप हुन्छन्। यी अवस्थामा, दुवै सामानहरू ERES मा सँगै प्रवेश गर्छन् (चित्र S1E, प्यानल ३ र चलचित्र S3)।
ग्यालेक्टोज इन्ड्युसिबल स्राव व्यक्त गर्ने sec31-1 कोषहरू, Gas1-GFP (GPI-AP, हरियो) र Mid2-iRFP (TMP, नीलो) र Sec13-mCherry (ERES, म्याजेन्टा) लेबल गर्ने संवैधानिक ERES लाई ३७ मा राखिएको थियो। °C मा ३० मिनेट इन्क्युबेट गरेपछि, स्राव ब्लक रिलिज गर्न २४ °C मा सार्नुहोस्, र २० मिनेट पछि SCLIM सँग छवि बनाउनुहोस्। (A देखि C) कार्गोको प्रतिनिधि २D प्रक्षेपण छविहरू (A; स्केल बार, १μm) वा ३D सेल गोलार्ध छविहरू (B र C; स्केल एकाइ, ०.४५६μm) र ERES द्वारा चिन्हित १० z-खण्डहरू। (B) मा तल्लो प्यानल र (C) मा प्यानलले ERES (म्याजेन्टा) [Gas1-GFP (खैरो) र Mid2-iRFP (हल्का नीलो)] मा उपस्थित सामानहरू मात्र प्रदर्शन गर्न प्रशोधित छविहरू प्रदर्शन गर्दछ। (C) खुला तीर: ERES ले केवल एक टुक्रा कार्गो बोक्छ (१ देखि ४)। खैरो तीर: ERES ले पृथक कार्गो समावेश गर्दछ (५)। सेतो ठोस तीर: सह-स्थित कार्गो समावेश गर्ने ERES। तल: चयन गरिएको एकल ERES मा केवल Gas1-GFP (१) वा Mid2-iRFP (२) समावेश छ। स्केल बार, १०० nm। (D) (C) मा वर्णन गरिएको फोटोमाइक्रोग्राफको परिमाणीकरण। केवल एक कार्गो (Gas1-GFP वा Mid2-iRFP), पृथक कार्गो र ओभरल्यापिङ कार्गो समावेश गर्ने ERES को औसत प्रतिशत। तीन स्वतन्त्र प्रयोगहरूमा, ५४ कक्षहरूमा n=४३२। त्रुटि बार = SD। दुई-पुच्छर नभएको t परीक्षण। *** P = ०.०००२। (E) (C) चिन्ह लगाइएको क्वारेन्टाइन गरिएको कार्गोको चयन गरिएको ERES को ३D छवि। Gas1-GFP (हरियो) (३) वा Mid2-iRFP (नीलो) (४) एक छेउबाट ERES (म्याजेन्टा) मा प्रवेश गर्दछ र ERES भित्रको सानो क्षेत्रमा सीमित छ। कहिलेकाहीँ, दुवै प्रकारका कार्गो एउटै ERES (5) मा एउटै छेउबाट प्रवेश गर्छन् र ERES भित्रको पृथक क्षेत्रमा सीमित हुन्छन्। स्केल बार, १०० एनएम।
अर्को, हामीले एउटा परिकल्पना परीक्षण गर्यौं कि ER झिल्लीमा रहेको लामो एसिल चेन सेरामाइड (C26) ले Gas1 को विशिष्ट क्लस्टरिङ र छनोटात्मक ERES मा क्रमबद्ध गर्ने काम गर्छ। यस उद्देश्यका लागि, हामीले परिमार्जित खमीर स्ट्रेन GhLag1 प्रयोग गर्यौं, जसमा दुई अन्तर्जात सेरामाइड संश्लेषणहरू Lag1 र Lac1 लाई GhLag1 (कपासको Lag1 होमोलोग) द्वारा प्रतिस्थापन गरिएको थियो, जसको परिणामस्वरूप जंगली प्रकार भन्दा छोटो कोशिका झिल्ली सेरामाइड स्ट्रेन भएको खमीर स्ट्रेन भयो (चित्र 3A) (28)। मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) विश्लेषणले देखाएको छ कि जंगली प्रकारका स्ट्रेनहरूमा, कुल सेरामाइडको 95% धेरै लामो (C26) चेन सेरामाइड हुन्छ, जबकि GhLag1 मा, सेरामाइडको 85% धेरै लामो (C18 र C16) हुन्छ। ), सेरामाइडको केवल 2% धेरै लामो (C26) चेन सेरामाइड हुन्छ। यद्यपि C18 र C16 सेरामाइडहरू GhLag1 झिल्लीमा अहिलेसम्म पत्ता लगाइएका मुख्य सेरामाइडहरू हुन्, MS विश्लेषणले यो पनि पुष्टि गर्‍यो कि GhLag1 स्ट्रेनमा व्यक्त गरिएको Gas1-GFP को GPI एङ्करमा C26 सेरामाइड हुन्छ, जुन जंगली-प्रकारको लिपिडहरूसँग तुलना गर्न सकिन्छ। गुणस्तर उस्तै छ (चित्र 3A) (26)। त्यसकारण, यसको अर्थ सेरामाइड रिमोडेलिंग इन्जाइम Cwh43 C26 सेरामाइडको लागि अत्यधिक चयनात्मक छ, चित्र 26 मा देखाइए अनुसार, यसले GhLag1 स्ट्रेनमा C26 सेरामाइडको सानो मात्राबाट GPI एङ्करलाई प्राथमिकतामा समावेश गर्दछ। S2 (29)। तैपनि, GhLag1 को कोशिका झिल्लीमा मूल रूपमा C18-C16 सेरामाइड मात्र हुन्छ, जबकि Gas1-GFP मा अझै पनि C26 सेरामाइड हुन्छ। यो तथ्यले यो स्ट्रेनलाई ER मा झिल्ली सेरामाइडको एसिल चेन लम्बाइको समस्या विशेष रूपमा समाधान गर्न एक आदर्श उपकरण बनाउँछ। वर्ग र क्रमबद्धताको काल्पनिक भूमिका। त्यसपछि, हामीले पहिले परम्परागत फ्लोरोसेन्स माइक्रोस्कोपी मार्फत sec31-1 को तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्ती एलीलको साथ GhLag1 मा क्लस्टरहरूमा जम्मा हुने C26 Gas1-GFP को क्षमताको अध्ययन गर्यौं, जहाँ ER झिल्ली Ceramide (चित्र 3) मा केवल लामो (C18-C16) श्रृंखला अवस्थित छ। हामीले अवलोकन गर्यौं कि sec31-1 मा, धेरैजसो Gas1-GFP क्लस्टरहरूमा केन्द्रित थियो, जबकि sec31-1 GhLag1 मा लामो (C18-C16) लामो ceramide ER झिल्ली भएको Gas1-GFP मुख्यतया सम्पूर्ण ER झिल्लीमा क्लस्टर र वितरित गरिएको थिएन। सटीक हुनको लागि, किनभने C26 ceramide-आधारित क्लस्टरिंग विशिष्ट ERES (चित्र 1) सँग नजिकबाट सम्बन्धित छ, हामीले अर्को पटक यो प्रक्रियामा ER निर्यात प्रोटीन संयन्त्रको कार्य पनि समावेश हुन सक्छ कि भनेर अनुसन्धान गर्यौं। GPI-AP ले ER निर्यातको लागि विशेष COPII प्रणाली प्रयोग गर्दछ, जुन GPI एंकरको ग्लाइकन भागको Ted1 को संरचनात्मक पुनर्निर्माण द्वारा सक्रिय रूपमा नियमन गरिएको छ (30, 31)। त्यसपछि पुनः संयोजक GPI-ग्लाइकनलाई ट्रान्समेम्ब्रेन कार्गो रिसेप्टर p24 कम्प्लेक्सद्वारा पहिचान गरिन्छ, जसले बारीमा Lst1 लाई छनौट रूपमा भर्ती गर्दछ, जुन प्रमुख COPII कार्गो बाइन्डिङ सबयुनिट Sec24 को एक विशिष्ट आइसोफर्म हो, जसले GPI-AP-युक्त COPII भेसिकलहरू आवश्यक हुन्छन् (31-33)। त्यसकारण, हामीले एउटा दोहोरो उत्परिवर्ती निर्माण गर्यौं जसले यी एकल प्रोटीनहरू (p24 जटिल घटक Emp24, GPI-ग्लाइकन रिमोडेलिंग इन्जाइम Ted1 र विशिष्ट COPII सबयुनिट Lst1) को मेटाउनेलाई sec31-1 उत्परिवर्ती स्ट्रेनसँग जोड्यो, र तिनीहरूलाई अध्ययन गर्यौं कि के Gas1-क्लस्टर GFP बनाउन सम्भव छ (चित्र 3)। हामीले अवलोकन गर्यौं कि sec31-1emp24Δ र sec31-1ted1Δ मा, Gas1-GFP मुख्यतया अनक्लस्टर गरिएको छ र ER झिल्लीभरि वितरित गरिएको छ, जस्तै पहिले sec31-1 GhLag1 मा देखियो, जबकि sec31-1lst1Δ मा, Gas1-GFP sec31-1 जस्तै। यी नतिजाहरूले संकेत गर्छन् कि ER झिल्लीमा C26 सेरामाइडको उपस्थितिको अतिरिक्त, Gas1-GFP को क्लस्टरिङलाई p24 कम्प्लेक्समा बाँध्न आवश्यक छ, र विशिष्ट Lst1 भर्ती आवश्यक पर्दैन। त्यसपछि, हामीले ER झिल्लीमा रहेको सेरामाइडको चेन लम्बाइले Gas1-GFP को बाइन्डिङलाई p24 मा नियमन गर्न सक्ने सम्भावनाको खोजी गर्यौं। यद्यपि, हामीले पत्ता लगायौं कि झिल्लीमा C18-C16 सेरामाइडको उपस्थितिले p24 कम्प्लेक्स (चित्र S3 र S4, A र B) द्वारा पुनर्निर्माण गरिएको GPI-ग्लाइकनहरू वा GPI-AP मा बाइन्डिङ र GPI-AP निर्यात गर्ने क्षमतालाई असर गर्दैन। भर्ती COPII उपप्रकार Lst1 (चित्र S4C)। त्यसकारण, C26 सेरामाइड-निर्भर क्लस्टरिङलाई विभिन्न ER निर्यात प्रोटीन संयन्त्रहरूसँग प्रोटीन अन्तरक्रिया आवश्यक पर्दैन, तर लिपिड लम्बाइद्वारा संचालित वैकल्पिक क्रमबद्ध संयन्त्रलाई समर्थन गर्दछ। त्यसपछि, हामीले विश्लेषण गर्यौं कि ER झिल्लीमा रहेको सेरामाइड एसिल चेन लम्बाइ Gas1-GFP को चयनात्मक ERES को रूपमा प्रभावकारी वर्गीकरणको लागि महत्त्वपूर्ण छ कि छैन। छोटो-चेन सेरामाइड भएको GhLag1 स्ट्रेनमा रहेको Gas1 ले ER छोडेर प्लाज्मा झिल्लीमा प्रवेश गर्ने भएकोले (चित्र S5), हामी विश्वास गर्छौं कि यदि क्रमबद्धता सेरामाइड एसाइल चेनको लम्बाइद्वारा संचालित हुन्छ भने, GhLag1 स्ट्रेनमा रहेको Gas1 लाई पुन: निर्देशित र क्रस गर्न सकिन्छ। एउटै झिल्ली भएको ERES सामानहरू।
(A) GhLag1 को कोशिका झिल्लीमा मुख्यतया छोटो C18-C16 सेरामाइडहरू हुन्छन्, जबकि Gas1-GFP को GPI एङ्करमा अझै पनि जंगली-प्रकारका कोशिकाहरू जस्तै C26 IPC हुन्छ। माथि: मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) द्वारा जंगली-प्रकार (Wt) र GhLag1p स्ट्रेनहरूको सेल झिल्लीमा सेरामाइडको एसिल चेन लम्बाइ विश्लेषण। डेटाले कुल सेरामाइडको प्रतिशत प्रतिनिधित्व गर्दछ। तीन स्वतन्त्र प्रयोगहरूको औसत। त्रुटि पट्टी = SD। दुई-पुच्छर अनपेयर गरिएको t परीक्षण। **** P ＜0.0001। तल्लो प्यानल: जंगली-प्रकार र GhLag1p स्ट्रेनहरूमा व्यक्त गरिएको Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI एङ्करमा उपस्थित IPC को एसिल चेन लम्बाइको MS विश्लेषण। डेटाले कुल IPC संकेतको प्रतिशत प्रतिनिधित्व गर्दछ। पाँच स्वतन्त्र प्रयोगहरूको औसत। त्रुटि पट्टी = SD। दुई-पुच्छर अनपेयर गरिएको t परीक्षण। ns, महत्त्वपूर्ण छैन। P = 0.9134। (B) ग्यालेक्टोज-प्रेरित Gas1-GFP व्यक्त गर्ने sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ र sec31-1lst1Δ कोषहरूको फ्लोरोसेन्स माइक्रोग्राफहरू 30 मिनेटको लागि 37°C मा इन्क्युबेट गरिएको थियो र 24°C पछि नियमित फ्लोरोसेन्स माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन गर्न तल पठाइएको थियो। सेतो तीर: ER Gas1-GFP क्लस्टर। खुला तीर: अनक्लस्टर गरिएको Gas1-GFP सम्पूर्ण ER झिल्लीमा वितरित गरिएको छ, ER विशेषता आणविक रिंग स्टेनिङ देखाउँदै। स्केल बार, 5μm। (C) (B) मा वर्णन गरिएको फोटोमाइक्रोग्राफको परिमाणीकरण। पङ्क्टेट Gas1-GFP संरचना भएका कोषहरूको औसत प्रतिशत। तीन स्वतन्त्र प्रयोगहरूमा, n≥300 कोषहरू। त्रुटि बार = SD। दुई-पुच्छर अनपेयर गरिएको t परीक्षण। **** P ＜0.0001।
यो समस्यालाई प्रत्यक्ष रूपमा समाधान गर्न, हामीले sec31-1 तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्ती एलिल (चित्र 4 र चलचित्र S4) को साथ GhLag1 मा Gas1-GFP र Mid2-iRFP को SCLIM दृश्यावलोकन गर्यौं। ER लाई 37°C मा राखिएपछि र पछि 24°C मा रिलिज गरिसकेपछि, परम्परागत माइक्रोस्कोपहरू द्वारा अवलोकन गरिए अनुसार, धेरैजसो नयाँ संश्लेषित Gas1-GFP क्लस्टर गरिएको थिएन र ER झिल्लीभरि वितरण गरिएको थिएन (चित्र 4, A र B)। थप रूपमा, ERES (67%) को ठूलो प्रतिशतमा यसमा सह-स्थित दुई प्रकारका कार्गोहरू समावेश छन् (चित्र 4D)। चित्र 4C को प्यानल 1 र 2 ले Gas1-GFP र Mid2-GFP लाई ओभरल्याप गर्ने ERES का दुई विशिष्ट उदाहरणहरू देखाउँछन्। थप रूपमा, दुबै सामानहरू एउटै ERES (चित्र 4E, प्यानल 3 र चलचित्र S4) मा भर्ती गरिएको थियो। त्यसकारण, हाम्रा नतिजाहरूले संकेत गर्दछ कि ER झिल्लीमा सेरामाइड एसिल चेनको लम्बाइ ER प्रोटीन एकत्रीकरण र वर्गीकरणको एक महत्त्वपूर्ण निर्धारक हो।
ग्यालेक्टोज-प्रेरित स्राव व्यक्त गर्ने Sec31-1 GhLag1 कोषहरू, Gas1-GFP (GPI-AP, हरियो) र Mid2-iRFP (TMP, नीलो) र संरचनात्मक ERES-लेबल गरिएको Sec13-mCherry (ERES, म्याजेन्टा) ३७°C मा इन्क्युबेट गर्नुहोस्। ३० मिनेटसम्म जारी राख्नुहोस्, स्रावहरू छोड्न २४°C मा खसाल्नुहोस्, र २० मिनेट पछि SCLIM सँग छवि बनाउनुहोस्। (A देखि C) कार्गो र ERES द्वारा चिन्हित १० z-खण्डहरूको प्रतिनिधि २D प्रक्षेपण छविहरू (A; स्केल बार, १μm) वा ३D सेल गोलार्ध छविहरू (B र C; स्केल एकाइ, ०.४५μm)। (B) मा तल्लो प्यानल र (C) मा प्यानलले ERES (म्याजेन्टा) [Gas1-GFP (खैरो) र Mid2-iRFP (हल्का नीलो)] मा उपस्थित सामानहरू मात्र प्रदर्शन गर्न प्रशोधित छविहरू प्रदर्शन गर्दछ। (C) सेतो भरिएको तीर: ERES, सामानहरू ओभरल्याप। खुला तीर: ERES मा एउटा मात्र वस्तु छ। तल्लो प्यानल: चयन गरिएको ERES मा (C) मा चिन्ह लगाइएका ओभरल्यापिङ सामानहरू (1 र 2) छन्। स्केल बार, १०० nm। (D) (C) मा वर्णन गरिएको फोटोमाइक्रोग्राफको परिमाणीकरण। sec31-1 र sec31-1 GhLag1 एकाइहरूमा, केवल एउटा कार्गो (Gas1-GFP वा Mid2-iRFP) समावेश गरिएको छ, र पृथक कार्गो र ओभरल्यापिङ कार्गोको लागि ERES को औसत प्रतिशत। तीन स्वतन्त्र प्रयोगहरूमा, 54 कोषहरूमा n = 432 (sec31-1) र 47 कोषहरूमा n = 430 (sec31-1 GhLag1)। त्रुटि बार = SD। दुई-पुच्छर नभएको t परीक्षण। *** P = 0.0002 (sec31-1) र ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1)। (E) (C) मा चिन्ह लगाइएका ओभरल्यापिङ कार्गो (3) भएको चयन गरिएको ERES को 3D छवि। Gas1-GFP (हरियो) र Mid2-iRFP (नीलो) एउटै छेउबाट ERES (म्याजेन्टा) मा पुग्छन् र एउटै ERES प्रतिबन्धित क्षेत्रमा रहन्छन्। स्केल बार, १०० एनएम।
यस अध्ययनले लिपिड-आधारित प्रोटीन कार्गोहरूलाई सेक्रेटरी मार्गमा चयनात्मक निर्यात साइटहरूमा वर्गीकृत गरिएको छ भन्ने प्रत्यक्ष इन भिभो प्रमाण प्रदान गर्दछ, र वर्गीकरण चयनात्मकताको लागि एसिल चेन लम्बाइको महत्त्व प्रकट गर्दछ। SCLIM भनिने शक्तिशाली र अत्याधुनिक माइक्रोस्कोपी प्रविधि प्रयोग गरेर, हामीले खमीरमा नयाँ संश्लेषित Gas1-GFP (धेरै लामो एसिल चेन (C26) सेरामाइड लिपिड भाग भएको प्रमुख प्लाज्मा झिल्ली GPI-AP) प्रदर्शन गर्यौं। डिस्क्रिट ER मा क्लस्टर गरिएका क्षेत्रहरू विशिष्ट ERES सँग सम्बन्धित छन्, जबकि ट्रान्समेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीनहरू ER झिल्लीभरि वितरित हुन्छन् (चित्र १)। थप रूपमा, यी दुई प्रकारका सामानहरू छनौट रूपमा फरक ERES मा प्रवेश गर्छन् (चित्र २)। झिल्लीमा सेलुलर सेरामाइडको एसिल चेन लम्बाइ C26 बाट C18-C16 मा घटाइन्छ, Gas1-GFP क्लस्टरलाई डिस्क्रिट ER क्षेत्रमा अवरोध गरिन्छ, र Gas1-GFP लाई ट्रान्समेम्ब्रेन प्रोटीनको साथ ER लाई उही ERES मार्फत छोड्न पुन: मार्गबद्ध गरिन्छ (चित्र ३ र चित्र ३)। ४)।
यद्यपि GPI-AP ले ER बाट बाहिर निस्कन विशेष प्रोटिन संयन्त्र प्रयोग गर्दछ, हामीले पत्ता लगायौं कि C26 सेरामाइड-निर्भर पृथकीकरणले ERES विशेषज्ञता (चित्र S4 र S5) निम्त्याउन सक्ने भिन्न प्रोटीन अन्तरक्रियामा भर पर्दैन। यसको सट्टा, हाम्रो निष्कर्षले लिपिड-आधारित प्रोटीन क्लस्टरिङ र अन्य कार्गोहरूको पछिल्ला बहिष्कारद्वारा संचालित वैकल्पिक वर्गीकरण संयन्त्रलाई समर्थन गर्दछ। हाम्रो अवलोकनले संकेत गर्दछ कि Gas1-GFP क्षेत्र वा विशिष्ट ERES सँग सम्बन्धित क्लस्टरमा ट्रान्समेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन Mid2-iRFP को अभाव छ, जसले संकेत गर्दछ कि C26 सेरामाइड-निर्भर GPI-AP क्लस्टरले सान्दर्भिक ERES मा तिनीहरूको प्रवेशलाई सहज बनाउनेछ, र एकै समयमा, ट्रान्समेम्ब्रेन बहिष्कार गर्दछ। स्रावहरू यस विशेष ERES मा प्रवेश गर्छन् (चित्र 1 र 2)। यसको विपरित, ER झिल्लीमा C18-C16 सेरामाइडहरूको उपस्थितिले GPI-AP लाई क्षेत्रहरू वा क्लस्टरहरू बनाउन दिँदैन, त्यसैले तिनीहरूले ट्रान्समेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीनहरूलाई समान ERES मा बहिष्कार वा प्रतिस्थापन गर्दैनन् (चित्र 3 र 4)। त्यसकारण, हामी प्रस्ताव गर्छौं कि C26 सेरामाइडले विशिष्ट ERES सँग जोडिएका प्रोटीनहरूको क्लस्टरिङलाई सहज बनाएर पृथकीकरण र वर्गीकरणलाई बढावा दिन्छ।
यो C26 सेरामाइड-निर्भर क्लस्टरिङलाई विशिष्ट ER क्षेत्रमा कसरी प्राप्त गर्ने? झिल्ली सेरामाइडको पार्श्व रूपमा अलग हुने प्रवृत्तिले GPI-AP र C26 सेरामाइडलाई छोटो र असंतृप्त ग्लिसरोलिपिडहरू भएको ER झिल्लीको अधिक अनियमित लिपिड वातावरणमा साना र तुरुन्तै क्रमबद्ध लिपिडहरू बनाउन सक्छ। गुणस्तरीय क्लस्टरहरू (17, 18)। यी साना अस्थायी क्लस्टरहरूलाई p24 जटिल (34) मा बाँधिएपछि ठूला, थप स्थिर क्लस्टरहरूमा थप फ्यूज गर्न सकिन्छ। यससँग मिल्दोजुल्दो, हामीले देखायौं कि C26 Gas1-GFP ले ठूला दृश्यात्मक क्लस्टरहरू बनाउन p24 जटिलसँग अन्तरक्रिया गर्न आवश्यक छ (चित्र 3)। p24 जटिल खमीरमा चार फरक p24 ट्रान्समेम्ब्रेन प्रोटीनहरू मिलेर बनेको एक हेटेरोजाइगस ओलिगोमर हो (35), जसले बहुसंवेदनशील बाइन्डिङ प्रदान गर्दछ, जसले साना GPI-AP क्लस्टरहरूको क्रस-लिङ्किङ गर्न सक्छ, जसले गर्दा ठूलो स्थिर क्लस्टर (34) उत्पन्न हुन्छ। स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकला कोषहरूमा GPI-APs को प्रोटीन एक्टोडोमाइनहरू बीचको अन्तरक्रियाले पनि तिनीहरूको एकत्रीकरणमा योगदान पुर्‍याउन सक्छ, जस्तै स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकला कोषहरूमा तिनीहरूको Golgi यातायातको समयमा देखाइएको छ (36)। यद्यपि, जब C18-C16 सेरामाइड ER झिल्लीमा उपस्थित हुन्छ, जब p24 जटिल Gas1-GFP मा बाँधिन्छ, ठूला छुट्टै क्लस्टरहरू बन्दैनन्। अन्तर्निहित संयन्त्र लामो एसाइल चेन सेरामाइडको विशिष्ट भौतिक र रासायनिक गुणहरूमा निर्भर हुन सक्छ। कृत्रिम झिल्लीहरूको बायोफिजिकल अध्ययनहरूले देखाउँछ कि यद्यपि लामो (C24) र छोटो (C18-C16) एसाइल चेन सेरामाइड दुवैले चरण विभाजन निम्त्याउन सक्छ, केवल लामो एसाइल चेन सेरामाइडहरू (C24) ले फिल्मलाई पुन: आकार दिन उच्च वक्रता र फिल्म झुकाउन प्रवर्द्धन गर्न सक्छ। पारस्परिक सन्दर्भ मार्फत (17, 37, 38)। यो देखाइएको छ कि TMED2 को ट्रान्समेम्ब्रेन हेलिक्स, Emp24 को मानव समरूप, साइटोप्लाज्मिक लोब्युलहरूमा C18 सेरामाइड-आधारित स्फिंगोमाइलिनसँग छनौट रूपमा अन्तरक्रिया गर्दछ (39)। आणविक गतिशीलता (MD) सिमुलेशनहरू प्रयोग गरेर, हामीले पत्ता लगायौं कि C18 र C26 सेरामाइडहरू Emp24 ट्रान्समेम्ब्रेन हेलिक्सको साइटोप्लाज्मिक लोब्युलहरू वरिपरि जम्मा हुन्छन्, र तिनीहरूको समान प्राथमिकताहरू छन् (चित्र S6)। यो ध्यान दिन लायक छ कि यसले संकेत गर्दछ कि Emp24 को ट्रान्समेम्ब्रेन हेलिक्सले झिल्लीमा लिपिडहरूको असममित वितरण निम्त्याउन सक्छ। यो स्तनधारी कोषहरूमा आधारित हालैको परिणाम हो। समान MD सिमुलेशनहरूले ईथर लिपिडहरूको उपस्थिति पनि देखाउँछन् (40)। त्यसकारण, हामी अनुमान गर्छौं कि ER26 को दुई लोब्युलहरूमा C26 सेरामाइड स्थानीय रूपमा समृद्ध छ। जब ल्युमिनल लोब्युलहरूमा रहेको GPI-AP सिधै बहुभ्यालेन्ट p24 मा बाँधिन्छ र साइटोप्लाज्मिक लोब्युलहरूमा p24 वरिपरि C26 सेरामाइडको संचय हुन्छ, यसले औंलाहरू मार्फत उत्पन्न हुने प्रोटिन एकत्रीकरण र झिल्ली वक्रतालाई बढावा दिन सक्छ (41), जसले GPI-AP लाई ERES सँग जोडिएको अलग क्षेत्रहरूमा अलग गर्न सक्छ, जसले ER झिल्लीको अत्यधिक वक्र क्षेत्रहरूलाई पनि समर्थन गर्दछ (42)। अघिल्ला रिपोर्टहरूले प्रस्तावित संयन्त्रलाई समर्थन गर्‍यो (43, 44)। प्लाज्मा झिल्लीमा ओलिगोलेक्टिन, रोगजनक वा एन्टिबडीहरूको सेरामाइड-आधारित ग्लाइकोस्फिंगोलिपिड्स (GSL) मा बहुभ्यालेन्ट बाइन्डिङले ठूलो GSL एकत्रीकरणलाई ट्रिगर गर्छ, चरण विभाजन बढाउँछ र झिल्ली विकृति र आन्तरिकीकरण निम्त्याउँछ (44)। इवाबुची आदि (४३) यो पत्ता लाग्यो कि लामो (C24) तर छोटो नभएको (C16) एसाइल चेनको उपस्थितिमा, GSL ल्याक्टोसिलसेरामाइडमा बाँधिएको बहुभ्यालेन्ट लिगान्डले ठूला क्लस्टरहरू र झिल्लीको आगमनको गठनलाई प्रेरित गर्‍यो, र लिफलेटहरूमा साइटोप्लाज्म लिन-मध्यस्थता सिग्नल ट्रान्सडक्सन जोडिएको न्यूट्रोफिलहरूमा एसाइल चेनहरूद्वारा अन्तर्निर्देशित हुन्छ।
स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकला कोषहरूमा, एपिकल प्लाज्मा झिल्लीको स्तरमा एन्टी-गोल्गी नेटवर्क (TGN) को एकाग्रताले GPI-AP को पृथकीकरण र क्रमबद्धता नियन्त्रण गर्दछ (१०, ४५)। यो एकत्रीकरण GPI-AP ओलिगोमेराइजेसन (३६) द्वारा संचालित हुन्छ, तर यो हामीले खमीरमा फेला पार्ने सेरामाइड चेन लम्बाइमा पनि निर्भर हुन सक्छ। यद्यपि स्तनधारी GPI-AP मा ईथर लिपिड-आधारित एंकर छ, र यसको रासायनिक संरचना धेरै लामो एसिल चेन सेरामाइड भन्दा धेरै फरक छ, हालैको एक अध्ययनले पत्ता लगायो कि दुबै लिपिडहरूमा विकासवादी रूपमा समान भौतिक र रासायनिक गुणहरू र कार्यहरू छन् (४०)। त्यसकारण, स्तनधारी कोषहरूमा ईथर लिपिड भाग खमीरमा C26 सेरामाइड जस्तै हुन सक्छ, र यसको भूमिका GPI-AP एकत्रीकरण र क्रमबद्धतालाई बढावा दिन झिल्लीमा लामो-श्रृंखला सेरामाइडसँग सम्बद्ध हुनु हो। यद्यपि यो सम्भावनालाई अझै पनि प्रत्यक्ष रूपमा परीक्षण गर्न आवश्यक छ, अघिल्ला खोजहरूले समर्थन गर्दछ कि गोलगी शरीरमा लामो एसाइल चेन सेरामाइडको ढुवानी साइटोप्लाज्मिक ट्रान्सफर प्रोटीनहरूद्वारा गरिन्छ, तर खमीर जस्ता GPI एङ्करहरूको संश्लेषणमा निर्भर गर्दछ। त्यसकारण, विकासवादी रूढिवादी संयन्त्रले धेरै लामो एसाइल चेन सेरामाइड र GPI-AP (१३, १६, २०, ४६, ४७) लाई एउटै यातायात भेसिकलमा छनौट रूपमा सह-ट्रान्सपोर्ट गर्न सक्षम देखिन्छ।
खमीर र स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकला कोशिका प्रणालीहरूमा, GPI-AP एकत्रीकरण र अन्य प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीनहरूबाट पृथक्करण सबै कोशिका सतहमा पुग्नु अघि हुन्छ। पलाडिनो एट अल। (४८) ले पत्ता लगाए कि स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकला कोशिकाहरूको TGN मा, GPI-AP क्लस्टरिङ केवल GPI-APs को एपिकल प्लाज्मा झिल्लीमा चयनात्मक वर्गीकरणको लागि आवश्यक छैन, तर GPI-APs को क्लस्टरिङ संगठन र यसको जैविक गतिविधिलाई पनि नियमन गर्दछ। कोशिका सतह। खमीरमा, यो अध्ययनले देखाएको छ कि ER मा C26 सेरामाइड-निर्भर GPI-AP क्लस्टरले प्लाज्मा झिल्लीमा GPI-AP को क्लस्टर संगठन र कार्यात्मक गतिविधिलाई नियमन गर्न सक्छ (२४, ४९)। यस मोडेलसँग मिल्दोजुल्दो, GhLag1 कोशिकाहरूलाई GPI अवरोधकहरू वा कोशिका भित्ता अखण्डतालाई असर गर्ने औषधिहरूबाट एलर्जी हुन्छ (२८), र खमीर कोशिकाहरूको मिलनमा प्रक्षेपित टिप सेरामाइडको कार्यात्मक Gas1-GFP क्लस्टरहरू (४९) को आवश्यकताले hLag1 कोशिकाहरूको G​​सम्भावित शारीरिक परिणामहरूलाई संकेत गर्दछ। GPI-AP त्रुटि। यद्यपि, लिपिड लम्बाइको आधारमा क्रमबद्ध विधिद्वारा कोषको सतहको कार्यात्मक संगठन ER बाट प्रोग्राम गरिएको छ कि छैन भनेर थप परीक्षण गर्नु हाम्रो भविष्यको अनुसन्धानको विषय हुनेछ।
यस काममा प्रयोग गरिएका Saccharomyces cerevisiae स्ट्रेनहरू तालिका S1 मा सूचीबद्ध छन्। लाइभ सेल इमेजिङको लागि SCLIM को MMY1583 र MMY1635 स्ट्रेनहरू W303 को पृष्ठभूमिमा निर्माण गरिएका थिए। फ्लोरोसेन्ट प्रोटीन ट्यागको साथ Sec13-mCherry व्यक्त गर्ने यी स्ट्रेनहरू pFA6a प्लाज्मिडलाई टेम्प्लेटको रूपमा पोलिमरेज चेन रियाक्सन (PCR)-आधारित विधि प्रयोग गरेर निर्माण गरिएको थियो (23)। GAL1 प्रमोटरको नियन्त्रणमा फ्लोरोसेन्ट प्रोटीनको साथ लेबल गरिएको Mid2-iRFP व्यक्त गर्ने स्ट्रेन निम्नानुसार निर्माण गरिएको थियो। pKTiRFP-KAN भेक्टरबाट iRFP-KanMx अनुक्रमको PCR प्रवर्धन (E. O'Shea को उपहार, Addgene plasmid नम्बर 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; अनुसन्धान स्रोत पहिचानकर्ता (RRID): Addgene_64687) र endogenous Mid2 को C-टर्मिनसमा सम्मिलित गरियो। Mid2-iRFP जीनोम अनुक्रमलाई GAL1 प्रमोटरमा प्रवर्द्धन र क्लोन गरिसकेपछि, यसलाई एकीकरण प्लाज्मिड pRS306 को Not I-Sac I साइटमा एकीकृत गरियो। परिणामस्वरूप प्लाज्मिड pRGS7 लाई URA3 लोकसमा एकीकृत गर्न Pst I सँग रेखीय बनाइएको थियो।
Gas1-GFP फ्युजन जीनलाई सेन्ट्रोमेयर (CEN) प्लाज्मिडमा GAL1 प्रमोटरको नियन्त्रणमा व्यक्त गरिन्छ, जुन निम्नानुसार निर्माण गरिएको छ। Gas1-GFP अनुक्रमलाई pRS416-GAS1-GFP प्लाज्मिड (24) (L. Popolo को उपहार) बाट PCR द्वारा प्रवर्द्धन गरिएको थियो र CEN प्लाज्मिड pBEVY-GL LEU2 (C को उपहार) को Xma I–Xho I साइटमा क्लोन गरिएको थियो। मिलर; एड्जीन प्लाज्मिड नम्बर 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225)। परिणामस्वरूप प्लाज्मिडलाई pRGS6 नाम दिइएको थियो। Axl2-GFP फ्युजन जीनलाई pBEVY-GL LEU2 भेक्टरको GAL1 प्रमोटरको नियन्त्रणमा पनि व्यक्त गरिएको छ, र यसको निर्माण निम्नानुसार छ। Axl2-GFP अनुक्रमलाई PCR द्वारा pRS304-p2HSE-Axl2-GFP प्लाज्मिड (23) बाट प्रवर्द्धन गरिएको थियो, र pBEVY-GL LEU2 भेक्टरको Bam HI-Pst I साइटमा क्लोन गरिएको थियो। परिणामस्वरूप प्लाज्मिडलाई pRGS12 नाम दिइएको थियो। यस अध्ययनमा प्रयोग गरिएका ओलिगोन्यूक्लियोटाइडहरूको अनुक्रम तालिका S2 मा सूचीबद्ध गरिएको छ।
यस स्ट्रेनलाई ०.२% एडेनिन र २% ग्लुकोज [YP-डेक्स्ट्रोज (YPD)], २% राफिनोज [YP-राफिनोज] रिच खमीर अर्क प्रोटीन p (YP) माध्यम (१% खमीर अर्क र २% प्रोटीन ept)। (YPR)] वा २% ग्यालेक्टोज [YP-ग्यालेक्टोज (YPG)] कार्बन स्रोतको रूपमा, वा सिंथेटिक न्यूनतम माध्यम (०.१५% खमीर नाइट्रोजन आधार र ०.५% अमोनियम सल्फेट) मा पोषणको लागि आवश्यक उपयुक्त एमिनो एसिड र आधारहरूको पूरकको रूपमा पूरक गरिएको थियो, र २% ग्लुकोज (सिंथेटिक ग्लुकोज न्यूनतम माध्यम) वा २% ग्यालेक्टोज (सिंथेटिक ग्यालेक्टोज न्यूनतम माध्यम) कार्बन स्रोतको रूपमा समावेश गरिएको थियो।
वास्तविक-समय इमेजिङको लागि, GAL1 प्रमोटर अन्तर्गत निर्माण व्यक्त गर्ने तापमान-संवेदनशील sec31-1 उत्परिवर्ती कोषहरूलाई YPR माध्यममा रातभरि २४°C मा मध्य-लग चरणमा हुर्काइएको थियो। YPG मा २४°C मा १ घण्टाको लागि इन्डक्सन गरेपछि, कोषहरूलाई SG मा ३७°C मा ३० मिनेटको लागि इन्क्युबेट गरिएको थियो, र त्यसपछि स्राव ब्लकबाट रिलिज गर्न २४°C मा स्थानान्तरण गरिएको थियो। कन्कानाभालिन A कोषहरूलाई गिलास स्लाइडमा फिक्स गर्न प्रयोग गरिएको थियो र SCLIM द्वारा छवि गरिएको थियो। SCLIM भनेको Olympus IX-71 इन्भर्टेड फ्लोरोसेन्स माइक्रोस्कोप र UPlanSApo १००×१.४ संख्यात्मक एपर्चर तेल लेन्स (ओलम्पस), उच्च-गति र उच्च-सिग्नल-टु-नोइज अनुपात घुमाउने डिस्क कन्फोकल स्क्यानर (योकोगावा इलेक्ट्रिक), कस्टम स्पेक्ट्रोमिटर, र कस्टम कूलिङको संयोजन हो। प्रणालीको छवि तीव्रता (हामामात्सु फोटोनिक्स) ले ×२६६.७ को अन्तिम म्याग्निफिकेसन र इलेक्ट्रोनहरूलाई गुणन गर्ने चार्ज-कपल्ड उपकरण क्यामेरा (२१) सहितको म्याग्निफाइङ लेन्स प्रणाली प्रदान गर्न सक्छ। छवि अधिग्रहण कस्टम सफ्टवेयर (योकोगावा इलेक्ट्रिक) द्वारा गरिन्छ। ३D छविहरूको लागि, हामीले वस्तुगत लेन्सलाई ठाडो रूपमा कम्पन गर्न कस्टम-निर्मित पिजोइलेक्ट्रिक एक्चुएटर प्रयोग गर्यौं, र १०० nm टाढा अप्टिकल भागहरू स्ट्याकमा सङ्कलन गर्यौं। Z-स्ट्याक छविलाई ३D भोक्सेल डेटामा रूपान्तरण गरिएको छ, र घुम्ने डिस्क कन्फोकल माइक्रोस्कोपको लागि प्रयोग गरिएको सैद्धान्तिक बिन्दु स्प्रेड प्रकार्य भोलोसिटी सफ्टवेयर (पर्किनएल्मर) द्वारा डिकन्भोलुसन प्रशोधनको लागि प्रयोग गरिन्छ। सह-स्थान विश्लेषणको लागि स्वचालित रूपमा थ्रेसहोल्ड गर्न भोलोसिटी सफ्टवेयर प्रयोग गरेर, कार्गो सहित ERES मापन गरिएको थियो। लाइन स्क्यान विश्लेषण मेटामोर्फ सफ्टवेयर (आणविक उपकरणहरू) प्रयोग गरेर गरिएको थियो।
तथ्याङ्कीय महत्व निर्धारण गर्न ग्राफप्याड प्रिज्म सफ्टवेयर प्रयोग गर्नुहोस्। दुई-पुच्छर विद्यार्थीको t-परीक्षण र भिन्नताको साधारण एक-तर्फी विश्लेषण (ANOVA) परीक्षणको लागि, समूहहरू बीचको भिन्नताले P <0.05 (*) मा महत्त्वपूर्ण प्रभाव पार्छ भन्ने मानिन्छ।
Gas1-GFP को फ्लोरोसेन्स माइक्रोस्कोपीको लागि, लग फेज कोषहरू YPD मा रातभर बढाइयो र सेन्ट्रीफ्यूगेशनद्वारा सङ्कलन गरियो, फस्फेट बफर गरिएको सलाइनले दुई पटक धोइयो, र कम्तिमा १५ मिनेटको लागि बरफमा इन्क्युबेट गरियो, र त्यसपछि पहिले वर्णन गरिए अनुसार माइक्रोस्कोप मुनि अगाडि बढाइयो। जाँच गर्नुहोस् (24)। वस्तुनिष्ठ लेन्स, L5 (GFP) फिल्टर, हमामात्सु क्यामेरा र एप्लिकेसन सुइट X (LAS X) सफ्टवेयरले सुसज्जित Leica DMi8 माइक्रोस्कोप (HCX PL APO 1003/1.40 तेल PH3 CS) अधिग्रहणको लागि प्रयोग गरिएको थियो। ।
नमूनाहरूलाई SDS नमुना बफरले ६५°C मा १० मिनेटको लागि विकृत गरिएको थियो, र त्यसपछि SDS-पोलियाएक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (PAGE) द्वारा अलग गरिएको थियो। इम्युनोब्लोटिंग विश्लेषणको लागि, प्रति लेन १० μl नमूना लोड गरिएको थियो। प्राथमिक एन्टिबडी: १:३००० को पातलोपनमा खरायो पोलिक्लोनल एन्टी-ग्यास१, १:५०० को पातलोपनमा खरायो पोलिक्लोनल एन्टी-एम्प२४, र १:३००० को पातलोपनमा खरायो पोलिक्लोनल एन्टी-GFP (H. Riezman बाट उपहार) प्रयोग गर्नुहोस्। माउस मोनोक्लोनल एन्टी-Pgk1 एन्टिबडी १:५००० को पातलोपनमा प्रयोग गरिएको थियो (J. de la Cruz बाट उपहार)। माध्यमिक एन्टिबडी: हर्सराडिश पेरोक्सिडेज (HRP) संयुग्मित बाख्रा एन्टी-खरगोश इम्युनोग्लोबुलिन G (IgG) १:३००० (पियर्स) को पातलोपनमा प्रयोग गरिएको थियो। HRP-संयुग्मित बाख्राको मुसा विरोधी IgG १:३००० (पियर्स) को पातलोपनमा प्रयोग गरिएको थियो। सुपरसिग्नल वेस्ट पिको अभिकर्मक (थर्मो फिशर साइन्टिफिक) को केमिल्युमिनेसेन्स विधिद्वारा प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया क्षेत्र अवलोकन गरिएको थियो।
(३१) मा वर्णन गरिए अनुसार, समृद्ध ER अंशमा प्राकृतिक इम्युनोप्रिसिपिटेशन प्रयोग गरिएको थियो। छोटकरीमा, १०० अप्टिकल घनत्वमा ६०० एनएम (OD600) मा TNE बफर [५० एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच ७.५), १५० एमएम NaCl, ५ एमएम EDTA, १ एमएम फेनिलमेथिलसल्फोनिल फ्लोराइड र प्रोटीज इनहिबिटर मिश्रण) ले खमीर कोषहरूलाई दुई पटक धुनुहोस्। यसलाई गिलासको मोतीले भाँचिएको थियो, र त्यसपछि सेलको मलबे र गिलासको मोतीहरू सेन्ट्रीफ्यूगेशनद्वारा हटाइयो। त्यसपछि सुपरनेटेन्टलाई १७,००० ग्राममा ४°C मा १५ मिनेटको लागि सेन्ट्रीफ्यूज गरिएको थियो। गोलीलाई TNE मा पुन: निलम्बन गरिएको थियो र डिजिटलिस स्यापोनिनलाई १% को अन्तिम सांद्रतामा थपिएको थियो। निलम्बनलाई ४°C मा घुमाएर १ घण्टाको लागि इन्क्युबेट गरिएको थियो, र त्यसपछि अघुलनशील घटकहरूलाई १३,००० ग्राममा ४°C मा ६० मिनेटको लागि सेन्ट्रीफ्यूगेशनद्वारा हटाइयो। Gas1-GFP इम्युनोप्रेसिपिटेशनको लागि, पहिले नमूनालाई ४°C मा १ घण्टाको लागि खाली एगारोज मोती (ChromoTek) संग पूर्व-इन्क्युबेट गर्नुहोस्, र त्यसपछि ४°C मा GFP-Trap_A (ChromoTek) संग ३ घण्टाको लागि इन्क्युबेट गर्नुहोस्। इम्युनोप्रेसिपिटेटेड मोतीहरूलाई ०.२% डिगोक्सिजेनिन भएको TNE ले पाँच पटक धोइयो, SDS नमूना बफरले एल्युट गरियो, SDS-PAGE मा छुट्याइयो, र इम्युनोब्लोटिंग द्वारा विश्लेषण गरियो।
(३१) मा वर्णन गरिए अनुसार, समृद्ध ER अंशमा क्रस-लिङ्किङ निर्धारण गरिएको थियो। संक्षेपमा, समृद्ध ER अंशलाई ०.५ मिमी डिथियोबिस (सुसिनिमिडिल प्रोपियोनेट) (पियर्स, थर्मो फिशर साइन्टिफिक, रकफोर्ड, IL, USA; २०°C, २० मिनेट) ले इन्क्युबेट गरिएको थियो। ग्लाइसिन (५० मिमी अन्तिम सांद्रता, ५ मिनेट, २०°C) थपेर क्रसलिङ्किङ प्रतिक्रियालाई शान्त पारिएको थियो।
पहिले वर्णन गरिएझैं (५०), जंगली-प्रकार र GhLag1 स्ट्रेनहरूमा सेरामाइडको MS विश्लेषण गरिएको थियो। छोटकरीमा, कोषहरूलाई YPD मा ३०°C मा घातांकीय चरण (३ देखि ४ OD600 युनिट/मिली) मा बढाइएको थियो, र २५×१०७ कोषहरू काटिएका थिए। तिनीहरूको चयापचय ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिडले शान्त पारिएको छ। निकासी विलायक [इथेनॉल, पानी, ईथर, पाइरिडिन र ४.२ N अमोनियम हाइड्रोक्साइड (१५:१५:५:१:०.०१८ v/v)] र आन्तरिक मानक C17 सेरामाइड (८६०५१७, अवन्ती ध्रुवीय लिपिड) गुणस्तरको १.२ nmol प्रयोग गर्नुहोस्। निकासीको हल्का क्षारीय हाइड्रोलिसिस गर्न मोनोमेथाइलमाइन अभिकर्मक [मिथेनॉल, पानी, n-बुटानोल र मेथिलामाइन घोल (४:३:१:५ v/v)] प्रयोग गर्नुहोस्, र त्यसपछि डिसल्ट गर्न पानी-संतृप्त n-बुटानोल प्रयोग गर्नुहोस्। अन्तमा, अर्कलाई सकारात्मक मोड विलायक [क्लोरोफर्म/मिथेनोल/पानी (२:७:१) + ५ एमएम अमोनियम एसीटेट] मा पुन: निलम्बन गरियो र मास स्पेक्ट्रोमिटरमा इन्जेक्सन गरियो। स्फिंगोलिपिड अणुहरूको पहिचान र परिमाण निर्धारणको लागि बहु-प्रतिक्रिया अनुगमन (MRM) गरिएको थियो। TSQ भ्यान्टेज तृतीयक क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमिटर (थर्मो फिशर साइन्टिफिक) लिपिड विश्लेषणको लागि रोबोटिक न्यानोफ्लो आयन स्रोत नानोमेट HD (एडभियन बायोसाइन्सेस, इथाका, NY) ले सुसज्जित छ। प्रत्येक सेरामाइड श्रेणीको लागि टक्कर ऊर्जा अनुकूलित गरिएको छ। MS डेटा सकारात्मक मोडमा प्राप्त गरिएको थियो। प्रत्येक जैविक प्रतिकृतिको लागि, लिपिड संकेत तीन स्वतन्त्र मापनको मध्यस्थ हो।
(३१) मा वर्णन गरिए अनुसार, Gas1-GFP व्यक्त गर्ने कोषहरू (८००×१०७) प्राकृतिक इम्युनोप्रिसिपिटेशनको अधीनमा थिए। शुद्ध गरिएको Gas1-GFP लाई SDS-PAGE द्वारा अलग गरिएको थियो र पोलिभिनिलिडेन फ्लोराइड (PVDF) झिल्लीमा स्थानान्तरण गरिएको थियो। प्रोटिनलाई PVDF लाई एमाइड ब्ल्याकले दाग लगाएर दृश्यात्मक रूपमा देखाइएको थियो। Gas1-GFP ब्यान्डलाई PVDF बाट काटिएको थियो र मिथेनोलले ५ पटक र तरल क्रोमेटोग्राफी-MS (LC-MS) ग्रेड पानीले एक पटक धोइएको थियो। झिल्ली स्ट्रिपलाई ५००μl ०.३ M NaOAc (pH ४.०), बफर र ५००μl ताजा घुलनशील १ M सोडियम नाइट्राइट मिश्रणले ३७°C मा ३ घण्टाको लागि इन्क्युबेट गरेर, लिपिड अंश Gas1-GFP बाट निस्कन्छ र ग्लुकोसामाइन र इनोसिटोल (५१) बीच इनोसिन फस्फेट सेरामाइडको रिलीज हुन्छ। त्यसपछि, झिल्ली स्ट्रिपलाई LC-MS ग्रेड पानीले चार पटक धोइयो, कोठाको तापक्रममा सुकाइयो, र विश्लेषण नभएसम्म -80°C मा नाइट्रोजन वायुमण्डलमा भण्डारण गरियो। नियन्त्रणको रूपमा, प्रत्येक प्रयोगको लागि PVDF झिल्लीको खाली नमूना प्रयोग गरियो। Gas1-GFP बाट निकालिएको लिपिडलाई वर्णन गरिए अनुसार MS द्वारा विश्लेषण गरिएको थियो (50)। छोटकरीमा, GPI-लिपिड भएको PVDF स्ट्रिपहरूलाई 75μl नकारात्मक मोल्ड विलायक [क्लोरोफर्म/मिथेनोल (1:2) + 5 mM अमोनियम एसीटेट] मा पुन: निलम्बन गरियो र स्फिंगोलिपिड प्रजातिहरूको इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ESI)-MRM/MS विश्लेषण (TSQ Vantage) पारित गरियो। यस अवस्थामा, MS डेटा नकारात्मक आयन मोडमा प्राप्त गरिएको थियो।
पहिले उल्लेख गरिएझैं, GPI एंकरको लिपिड भाग [3H]-इनोसिटोल-लेबल गरिएको GPI-AP (16) बाट अलग गरिएको थियो। लिपिडहरूलाई विलायक प्रणाली (55:45:10 क्लोरोफर्म-मेथानोल-0.25% KCl) प्रयोग गरेर पातलो-तह क्रोमेटोग्राफीद्वारा अलग गरिएको थियो र FLA-7000 (Fujifilm) प्रयोग गरेर दृश्यीकरण गरिएको थियो।
Gas1-GFP (600×107) व्यक्त गर्ने कोषहरूलाई TNE बफरले TNE बफरले दुई पटक धोइयो, र काँचको मोतीले भाँचियो, र त्यसपछि कोषको मलबे र काँचको मोती हटाउन सेन्ट्रीफ्यूज गरियो। त्यसपछि सुपरनेट्यान्टलाई ४°C मा १ घण्टाको लागि १७,००० ग्राममा सेन्ट्रीफ्यूज गरियो। गोलीलाई TNE मा धोइयो र ३७°C मा १ घण्टाको लागि ०.२% डिजिटलिस स्यापोनिन भएको TNE मा १ U PI-PLC (Invitrogen) ले इन्क्युबेट गरियो। इन्जाइम उपचार पछि, झिल्लीलाई १७,००० ग्राममा ४°C मा १ घण्टाको लागि सेन्ट्रीफ्यूजेशनद्वारा हटाइयो। Gas1-GFP लाई इम्युनोप्रिसिपिटेट गर्न, सुपरनेट्यान्टलाई ४°C मा GFP-Trap_A (ChromoTek) ले रातभरि इन्क्युबेट गरियो। SDS-PAGE द्वारा छुट्याइएको शुद्ध Gas1-GFP लाई Coomassie शानदार नीलोले दाग लगाइएको थियो। Gas1-GFP स्टेनिङ ब्यान्डलाई जलवायु वरिपरिको खैरो रंगबाट काटिएको थियो, र त्यसपछि आयोडोएसिटामाइडको साथ अल्किलेसन र डिथियोथ्रेइटोलको साथ रिडक्सन पछि, ट्रिप्सिनको साथ इन-जेल पाचन गरिएको थियो। GPI-ग्लाइकन्सको साथ ट्रिप्टिक पेप्टाइडहरू र पेप्टाइडहरू निकाल्नुहोस् र सुकाउनुहोस्। सुकेको पेप्टाइडलाई २० μl पानीमा घुलाइएको थियो। LC मा एक भाग (८μl) इन्जेक्ट गर्नुहोस्। विशिष्ट ग्रेडियन्ट अवस्थाहरूमा पेप्टाइडहरू अलग गर्न अक्टाडेसिल्सिलेन (ODS) स्तम्भ (Develosil 300ODS-HG-5; भित्री व्यास १५० मिमी × १.० मिमी; नोमुरा केमिकल, आइची प्रिफेक्चर, जापान) प्रयोग गरिएको थियो। मोबाइल चरण विलायक A (०.०८% फर्मिक एसिड) र विलायक B (८०% एसिटोनिट्राइलमा ०.१५% फर्मिक एसिड) हो। ५० μl मिनेट-१ को प्रवाह दरमा ५५ मिनेट भित्र विलायक A ले स्तम्भलाई ५ मिनेट भित्र एल्युट गर्न एकेला HPLC प्रणाली (थर्मो फिशर साइन्टिफिक, बोस्टन, म्यासाचुसेट्स) प्रयोग गरिएको थियो, र त्यसपछि विलायक B को सांद्रता ४०% मा बढाइएको थियो। , संयुक्त राज्य अमेरिका)। एल्युएटलाई ESI आयन स्रोतमा निरन्तर रूपमा परिचय गराइएको थियो, र GPI-ग्लाइकन्स भएका ट्रिप्टिक पेप्टाइडहरू र पेप्टाइडहरू LTQ Orbitrap XL (हाइब्रिड रेखीय आयन ट्र्याप-अर्बिट्राप मास स्पेक्ट्रोमिटर; थर्मो फिशर साइन्टिफिक) द्वारा विश्लेषण गरिएको थियो। MS सेटअपमा, केशिका स्रोतको भोल्टेज ४.५ kV मा सेट गरिएको थियो, र स्थानान्तरण केशिकाको तापक्रम ३००°C मा राखिएको थियो। केशिका भोल्टेज र ट्यूब लेन्स भोल्टेज क्रमशः १५ V र ५० V मा सेट गरिएको थियो। MS डेटा ३००/m/z द्रव्यमान/चार्ज अनुपात (m/z) ३००० को द्रव्यमान दायरामा सकारात्मक आयन मोड (६०,००० को रिजोल्युसन; प्रति मिलियन १० भागको द्रव्यमान शुद्धता) मा प्राप्त गरिएको थियो। MS/MS डेटा LTQ Orbitrap XL [पहिलो ३ अंक जसमा डेटा निर्भर गर्दछ, टक्कर प्रेरित पृथक्करण (CID)] मा आयन ट्र्याप मार्फत प्राप्त गरिन्छ।
MD सिमुलेशनहरू GROMACS (52) सफ्टवेयर र MARTINI 2 फोर्स फिल्ड (53-55) प्रयोग गरेर प्रदर्शन गरिएको थियो। त्यसपछि CHARMM GUI मेम्ब्रेन बिल्डर (56, 57) लाई डायोलियोइलफोस्फेटिडाइलकोलिन (DOPC) र Cer C18 वा DOPC र Cer C26 भएको द्विस्तरीय तह निर्माण गर्न प्रयोग गरिएको थियो। Cer C26 को टोपोलोजी र निर्देशांकहरू स्फिंगोसिन पुच्छरबाट अतिरिक्त मोतीहरू हटाएर DXCE बाट लिइएको हो। डबल तहलाई सन्तुलनमा राख्न र यसलाई चलाउन तल वर्णन गरिएको प्रक्रिया प्रयोग गर्नुहोस्, त्यसपछि Emp24 भएको प्रणाली निर्माण गर्न प्रणालीको अन्तिम निर्देशांकहरू प्रयोग गर्नुहोस्। यीस्ट Emp24 (अवशेषहरू 173 देखि 193) को ट्रान्समेम्ब्रेन डोमेनलाई दृश्य MD (VMD) उपकरण आणविक संरचना (58) प्रयोग गरेर α-हेलिक्सको रूपमा निर्माण गरिएको थियो। त्यसपछि, ओभरल्यापिङ लिपिडहरू हटाएपछि, प्रोटीनलाई मोटो रूपमा दानेदार बनाइएको थियो र CHARMM GUI प्रयोग गरेर द्विस्तरीय तहमा घुसाइएको थियो। अन्तिम प्रणालीमा १२०२ DOPC र ३०२ Cer C26 वा ११९७ DOPC र २९५ Cer C18 र Emp24 समावेश छन्। प्रणालीलाई ०.१५०M को सांद्रतामा आयोनाइज गर्नुहोस्। दुई द्विस्तरीय रचनाहरूको लागि चार स्वतन्त्र प्रतिकृतिहरू बनाइयो।
लिपिड बाइलेयरलाई CHARMM GUI प्रक्रिया प्रयोग गरेर सन्तुलित गरिन्छ, जसमा ४०५,००० चरणहरूलाई न्यूनतम गर्ने र त्यसपछि सन्तुलन गर्ने समावेश छ, जहाँ स्थिति अवरोधहरू बिस्तारै घटाइन्छ र हटाइन्छ, र समय चरण ०.००५ ps बाट ०.०२ ps मा बढाइन्छ। सन्तुलन पछि, यसले ०.०२ ps को समय चरणको साथ ६ µs उत्पादन गर्दछ। Emp24 सम्मिलित गरेपछि, प्रणालीलाई न्यूनतम र सन्तुलन गर्न उही CHARMM GUI प्रक्रिया प्रयोग गर्नुहोस्, र त्यसपछि उत्पादनमा ८ सेकेन्डसम्म चलाउनुहोस्।
सबै प्रणालीहरूको लागि, सन्तुलन प्रक्रियाको क्रममा, दबाब बेरेन्डसेन ब्यारोस्ट्याट (५९) द्वारा नियन्त्रण गरिन्छ, र उत्पादन प्रक्रियाको क्रममा, दबाब पारिनेलो-रहमान ब्यारोस्ट्याट (६०) द्वारा नियन्त्रण गरिन्छ। सबै अवस्थामा, औसत दबाब १ बार हुन्छ र अर्ध-आइसोट्रोपिक दबाब युग्मन योजना प्रयोग गरिन्छ। सन्तुलन र उत्पादन प्रक्रियामा, गति पुन: क्यालिब्रेसन भएको थर्मोस्टेट (६१) क्रमशः प्रोटीन, लिपिड र विलायक कणहरूको तापक्रम जोड्न प्रयोग गरिन्छ। सम्पूर्ण सञ्चालनको क्रममा, लक्ष्य तापक्रम ३१० किलोमिटर हुन्छ। ०.००५ बफर सहिष्णुताको साथ भरलेट योजना प्रयोग गरेर जोडी सूची उत्पन्न गरेर गैर-बन्धन अन्तरक्रिया गणना गरिन्छ। कुलम्ब शब्द प्रतिक्रिया क्षेत्र र १.१ एनएमको कट-अफ दूरी प्रयोग गरेर गणना गरिन्छ। भ्यान्डर वाल्स शब्दले १.१ एनएमको कट-अफ दूरी भएको कट-अफ योजना प्रयोग गर्दछ, र भरलेट कट-अफ योजना सम्भावित बहावको लागि प्रयोग गरिन्छ (६२)।
VMD प्रयोग गरेर, DOPC फस्फेट मोती वा सेरामाइड AM1 मोती र प्रोटीन बीचको कटअफ तरंगदैर्ध्य ०.७ nm हुन्छ, र प्रोटीनसँग अन्तरक्रिया गर्ने लिपिडहरूको संख्या गणना गरिन्छ। निम्न सूत्र अनुसार, (६३) मा उल्लेख गरिए अनुसार डिप्लेशन-एनरिचमेन्ट (DE) कारक गणना गर्नुहोस्: DE कारक = (प्रोटीनमा कुल लिपिडहरूको मात्रा ०.७) प्रोटीनमा (कुल लिपिडहरूमा Cer को मात्रा)
रिपोर्ट गरिएको मान औसतको रूपमा प्राप्त गरिन्छ, र त्रुटि बारहरू SE का चार स्वतन्त्र प्रतिलिपिहरू हुन्। DE कारकको सांख्यिकीय महत्त्व t परीक्षण [(averageDE-factor-1)/SE] द्वारा गणना गरिन्छ। एक-पुच्छर वितरणबाट P मान गणना गर्नुहोस्।
GROMACS उपकरण ट्रेसको अन्तिम २५० ns भित्र Emp24 भएको प्रणालीको २D पार्श्व घनत्व नक्सा गणना गर्न प्रयोग गरिएको थियो। सेरामाइडको संवर्धन/क्षय नक्सा प्राप्त गर्न, Cer को घनत्व नक्सालाई Cer र DOPC को नक्साको योगफलले भाग गरिन्छ, र त्यसपछि शरीरमा Cer को सांद्रताले भाग गरिन्छ। उही रङ नक्सा स्केल प्रयोग गरिन्छ।
यस लेखको लागि पूरक सामग्रीहरूको लागि, कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 हेर्नुहोस्।
यो क्रिएटिभ कमन्स एट्रिब्युसन-गैर-वाणिज्यिक इजाजतपत्रको सर्तहरू अन्तर्गत वितरित खुला पहुँच लेख हो, जसले कुनै पनि माध्यममा प्रयोग, वितरण र पुनरुत्पादनलाई अनुमति दिन्छ, जबसम्म अन्तिम प्रयोग व्यावसायिक लाभको लागि होइन र आधार यो हो कि मूल काम सही छ। सन्दर्भ।
नोट: हामी तपाईंलाई आफ्नो इमेल ठेगाना प्रदान गर्न अनुरोध गर्छौं ताकि तपाईंले पृष्ठमा सिफारिस गर्नुभएको व्यक्तिलाई थाहा होस् कि तपाईं उनीहरूले इमेल देखून् र यो स्प्याम होइन। हामी कुनै पनि इमेल ठेगानाहरू कैद गर्ने छैनौं।
यो प्रश्न तपाईं आगन्तुक हुनुहुन्छ कि हुनुहुन्न भनेर परीक्षण गर्न र स्वचालित स्पाम सबमिशन रोक्न प्रयोग गरिन्छ।
सोफिया रोड्रिग्वेज-गैलार्डो, काजुओ कुरोकावा, सुसाना साबिडो-बोजो, अलेजान्ड्रो कोर्टेज · गोमेज (एलेजान्ड्रो कोर्टेस-गोमेज), अत्सुको इकेडा (आत्सुको इकेडा), भलेरिया जोनी (भलेरिया जोनी), अक्सिलिएडोरा अगुइलेरा-रोमेरो, एनालोजी सेरोजी, एनालोजी, एना पेरोजी, एना लोपेज), मिहो वागा (मिहो वागा), मिसाको अरमान (मिसाको अरमान), मियाको रिमान (मियाको रिमान), प्रो अकिरा, स्टेफानो फनी, अकिहिको नाकानो, म्यानुअल मुनिज
थ्रीडी हाई-रिजोल्युसन रियल-टाइम इमेजिङले छनौट आउटपुट साइटहरूमा प्रोटीन क्रमबद्ध गर्न सेरामाइड चेन लम्बाइको महत्त्व प्रकट गर्दछ।
सोफिया रोड्रिग्वेज-गैलार्डो, काजुओ कुरोकावा, सुसाना साबिडो-बोजो, अलेजान्ड्रो कोर्टेज · गोमेज (एलेजान्ड्रो कोर्टेस-गोमेज), अत्सुको इकेडा (आत्सुको इकेडा), भलेरिया जोनी (भलेरिया जोनी), अक्सिलिएडोरा अगुइलेरा-रोमेरो, एनालोजी सेरोजी, एनालोजी, एना पेरोजी, एना लोपेज), मिहो वागा (मिहो वागा), मिसाको अरमान (मिसाको अरमान), मियाको रिमान (मियाको रिमान), प्रो अकिरा, स्टेफानो फनी, अकिहिको नाकानो, म्यानुअल मुनिज
थ्रीडी हाई-रिजोल्युसन रियल-टाइम इमेजिङले छनौट आउटपुट साइटहरूमा प्रोटीन क्रमबद्ध गर्न सेरामाइड चेन लम्बाइको महत्त्व प्रकट गर्दछ।
© २०२० अमेरिकन एसोसिएशन फर द एडभान्समेन्ट अफ साइन्स। सबै अधिकार सुरक्षित। AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef र COUNTER को साझेदार हो। ScienceAdvances ISSN 2375-2548।