हामीले पहिले रिपोर्ट गरेका थियौं कि कलेजो फाइब्रोसिस भएका बिरामीहरूमा आन्द्राबाट व्युत्पन्न ट्रिप्टोफान मेटाबोलाइट इन्डोल-३-प्रोपियोनिक एसिड (IPA) को सीरम स्तर कम हुन्छ। यस अध्ययनमा, हामीले सीरम IPA स्तरहरूको सम्बन्धमा मोटो कलेजोमा ट्रान्सक्रिप्टोम र DNA मिथाइलमको अनुसन्धान गर्यौं, साथै भिट्रोमा हेपाटिक स्टेलेट कोशिकाहरू (HSCs) को फेनोटाइपिक निष्क्रियता प्रेरित गर्न IPA को भूमिकाको पनि अनुसन्धान गर्यौं।
यस अध्ययनमा टाइप २ मधुमेह मेलिटस (T2DM) बिनाका ११६ मोटा बिरामीहरू (उमेर ४६.८ ± ९.३ वर्ष; BMI: ४२.७ ± ५.० kg/m²) समावेश थिए जसले कुओपियो बेरियाट्रिक सर्जरी सेन्टर (KOBS) मा बेरियाट्रिक सर्जरी गराएका थिए। सर्कुलेटिंग IPA स्तरहरू तरल क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS) द्वारा मापन गरिएको थियो, कलेजो ट्रान्सक्रिप्टोम विश्लेषण कुल RNA अनुक्रमण द्वारा गरिएको थियो, र DNA मेथिलेसन विश्लेषण Infinium HumanMethylation450 BeadChip प्रयोग गरेर गरिएको थियो। इन भिट्रो प्रयोगहरूको लागि मानव हेपाटिक स्टेलेट कोशिकाहरू (LX-2) प्रयोग गरिएको थियो।
कलेजोमा एपोप्टोटिक, माइटोफेजिक र दीर्घायु मार्गहरूमा संलग्न जीनको अभिव्यक्तिसँग सीरम IPA स्तरहरू सम्बन्धित थिए। AKT सेरिन/थ्रेओनिन काइनेज १ (AKT1) जीन कलेजो ट्रान्सक्रिप्ट र DNA मिथाइलेशन प्रोफाइलहरूमा सबैभन्दा प्रचुर मात्रामा र प्रभावशाली अन्तरक्रिया गर्ने जीन थियो। IPA उपचारले एपोप्टोसिसलाई प्रेरित गर्‍यो, माइटोकोन्ड्रियल श्वसन घट्यो, र LX-2 कोशिकाहरूको फाइब्रोसिस, एपोप्टोसिस र अस्तित्वलाई नियमन गर्न ज्ञात जीनको अभिव्यक्तिलाई परिमार्जन गरेर कोशिका आकारविज्ञान र माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलता परिवर्तन गर्‍यो।
एकसाथ लिँदा, यी तथ्याङ्कहरूले IPA मा सम्भावित चिकित्सीय प्रभावहरू छन् र यसले एपोप्टोसिसलाई उत्प्रेरित गर्न सक्छ र HSC फेनोटाइपलाई निष्क्रिय अवस्थामा सार्न सक्छ, जसले गर्दा HSC सक्रियता र माइटोकोन्ड्रियल मेटाबोलिज्ममा हस्तक्षेप गरेर कलेजो फाइब्रोसिसलाई रोक्ने सम्भावना बढ्छ भन्ने कुरालाई समर्थन गर्दछ।
मोटोपना र मेटाबोलिक सिन्ड्रोमको प्रचलन मेटाबोलिक रूपमा सम्बन्धित फ्याटी लिभर रोग (MASLD) को बढ्दो घटनासँग सम्बन्धित छ; यो रोगले सामान्य जनसंख्याको २५% देखि ३०% लाई असर गर्छ [१]। MASLD एटियोलोजीको मुख्य परिणाम कलेजो फाइब्रोसिस हो, एक गतिशील प्रक्रिया जुन फाइब्रस एक्स्ट्रासेलुलर म्याट्रिक्स (ECM) को निरन्तर संचय द्वारा विशेषता हो [२]। कलेजो फाइब्रोसिसमा संलग्न मुख्य कोषहरू हेपाटिक स्टेलेट कोषहरू (HSCs) हुन्, जसले चार ज्ञात फेनोटाइपहरू प्रदर्शन गर्दछ: शान्त, सक्रिय, निष्क्रिय, र सेन्सेन्ट [३, ४]। HSC हरूलाई सक्रिय गर्न सकिन्छ र α-स्मूथ मांसपेशी एक्टिन (α-SMA) र टाइप I कोलाजेन (Col-I) [५, ६] को अभिव्यक्ति बढ्दै जाँदा उच्च ऊर्जा माग भएका प्रोलिफेरेटिभ फाइब्रोब्लास्ट-जस्तो कोषहरूमा शान्त रूपबाट रूपान्तरण गर्न सकिन्छ। कलेजो फाइब्रोसिस रिभर्सलको समयमा, सक्रिय HSC हरू एपोप्टोसिस वा निष्क्रियता मार्फत हटाइन्छ। यी प्रक्रियाहरूमा फाइब्रोजेनिक जीनको डाउनरेगुलेसन र प्रोसर्भाइभल जीनको मोड्युलेसन (जस्तै NF-κB र PI3K/Akt सिग्नलिङ मार्गहरू) [7, 8], साथै माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलता र प्रकार्यमा परिवर्तनहरू [9] समावेश छन्।
आन्द्रामा उत्पादन हुने ट्रिप्टोफान मेटाबोलाइट इन्डोल-३-प्रोपियोनिक एसिड (IPA) को सीरम स्तर, MASLD [10-13] सहित मानव चयापचय रोगहरूमा घटेको पाइएको छ। IPA आहार फाइबर सेवनसँग सम्बन्धित छ, यसको एन्टिअक्सिडेन्ट र एन्टी-इन्फ्लेमेटरी प्रभावहरूको लागि परिचित छ, र भिभो र इन भिट्रोमा आहार-प्रेरित गैर-अल्कोहोलिक स्टेटोहेपाटाइटिस (NASH) फेनोटाइपलाई कम गर्छ [11-14]। केही प्रमाणहरू हाम्रो अघिल्लो अध्ययनबाट आएका छन्, जसले कुओपियो बेरियाट्रिक सर्जरी अध्ययन (KOBS) मा कलेजो फाइब्रोसिस नभएका मोटोपना भएका बिरामीहरूको तुलनामा कलेजो फाइब्रोसिस भएका बिरामीहरूमा सीरम IPA स्तर कम रहेको देखाएको थियो। यसबाहेक, हामीले देखाएका छौं कि IPA उपचारले मानव हेपाटिक स्टेलेट सेल (LX-2) मोडेलमा कोशिका आसंजन, कोशिका माइग्रेसन र हेमाटोपोएटिक स्टेम सेल सक्रियताको शास्त्रीय मार्करहरू भएका जीनहरूको अभिव्यक्तिलाई कम गर्न सक्छ र एक सम्भावित हेपाटोप्रोटेक्टिभ मेटाबोलाइट हो [15]। यद्यपि, यो स्पष्ट छैन कि IPA ले HSC एपोप्टोसिस र माइटोकोन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स सक्रिय गरेर कलेजो फाइब्रोसिस रिग्रेसनलाई कसरी प्रेरित गर्छ।
यहाँ, हामी देखाउँछौं कि सीरम IPA मोटो तर गैर-टाइप २ मधुमेह (KOBS) व्यक्तिहरूको कलेजोमा एपोप्टोसिस, माइटोफेगी, र दीर्घायु मार्गहरूमा समृद्ध जीनको अभिव्यक्तिसँग सम्बन्धित छ। यसबाहेक, हामीले पत्ता लगायौं कि IPA ले निष्क्रियता मार्ग मार्फत सक्रिय हेमेटोपोएटिक स्टेम सेलहरू (HSCs) को क्लियरेन्स र डिग्रेडेसनलाई प्रेरित गर्न सक्छ। यी परिणामहरूले IPA को लागि एक नवीन भूमिका प्रकट गर्दछ, जसले यसलाई कलेजो फाइब्रोसिस रिग्रेसनलाई प्रवर्द्धन गर्न सम्भावित चिकित्सीय लक्ष्य बनाउँछ।
KOBS समूहमा गरिएको अघिल्लो अध्ययनले कलेजो फाइब्रोसिस भएका बिरामीहरूमा कलेजो फाइब्रोसिस नभएका बिरामीहरूको तुलनामा कम परिसंचरण हुने IPA स्तरहरू देखाएको थियो [15]। टाइप २ मधुमेहको सम्भावित भ्रामक प्रभावलाई बहिष्कार गर्न, हामीले टाइप २ मधुमेह नभएका ११६ मोटोपना भएका बिरामीहरूलाई (औसत उमेर ± SD: ४६.८ ± ९.३ वर्ष; BMI: ४२.७ ± ५.० kg/m2) (तालिका १) अध्ययन जनसंख्या [16] को रूपमा चलिरहेको KOBS अध्ययनबाट भर्ना गर्यौं। सबै सहभागीहरूले लिखित सूचित सहमति दिए र हेलसिंकीको घोषणा (५४/२००५, १०४/२००८ र २७/२०१०) अनुसार उत्तरी साभो काउन्टी अस्पतालको नैतिकता समितिद्वारा अध्ययन प्रोटोकललाई अनुमोदन गरिएको थियो।
कलेजो बायोप्सी नमूनाहरू बेरियाट्रिक शल्यक्रियाको क्रममा प्राप्त गरिएको थियो र पहिले वर्णन गरिएको मापदण्ड [17, 18] अनुसार अनुभवी रोग विशेषज्ञहरूद्वारा हिस्टोलोजिकली मूल्याङ्कन गरिएको थियो। मूल्याङ्कन मापदण्डहरू पूरक तालिका S1 मा संक्षेप गरिएको छ र पहिले वर्णन गरिएको छ [19]।
मेटाबोलोमिक्स विश्लेषणको लागि अलक्ष्यित तरल क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS) द्वारा फास्टिङ सीरम नमूनाहरूको विश्लेषण गरिएको थियो (n = ११६)। पहिले वर्णन गरिए अनुसार UHPLC-qTOF-MS प्रणाली (१२९० LC, ६५४० qTOF-MS, एजिलेन्ट टेक्नोलोजीज, वाल्डब्रोन, कार्लस्रुहे, जर्मनी) प्रयोग गरेर नमूनाहरूको विश्लेषण गरिएको थियो। आइसोप्रोपाइल अल्कोहल (IPA) को पहिचान अवधारण समय र शुद्ध मापदण्डहरूसँग MS/MS स्पेक्ट्रमको तुलनामा आधारित थियो। थप सबै विश्लेषणहरूमा IPA संकेत तीव्रता (शिखर क्षेत्र) विचार गरिएको थियो [20]।
सम्पूर्ण कलेजोको आरएनए अनुक्रमण इलुमिना हाईसेक २५०० प्रयोग गरेर गरिएको थियो र पहिले वर्णन गरिए अनुसार डेटा पूर्व-प्रशोधन गरिएको थियो [१९, २१, २२]। हामीले मिटोमाइनर ४.० डाटाबेसबाट चयन गरिएका १९५७ जीनहरू प्रयोग गरेर माइटोकोन्ड्रियल प्रकार्य/बायोजेनेसिसलाई असर गर्ने ट्रान्सक्रिप्टहरूको लक्षित भिन्न अभिव्यक्ति विश्लेषण गर्यौं [२३]। कलेजोको डीएनए मिथाइलेशन विश्लेषण पहिले वर्णन गरिए जस्तै विधि प्रयोग गरेर इन्फिनियम ह्युमनमेथिलेसन४५० बीडचिप (इलुमिना, सान डिएगो, सीए, संयुक्त राज्य अमेरिका) प्रयोग गरेर गरिएको थियो [२४, २५]।
मानव हेपाटिक स्टेलेट कोषहरू (LX-2) प्रो. स्टेफानो रोमियोले दयालुपूर्वक प्रदान गरेका थिए र DMEM/F12 माध्यम (बायोवेस्ट, L0093-500, 1% पेन/स्ट्रेप; लोन्जा, DE17-602E, 2% FBS; गिब्को, 10270-106) मा कल्चर र मर्मत गरिएको थियो। IPA को काम गर्ने खुराक चयन गर्न, LX-2 कोषहरूलाई DMEM/F12 माध्यममा 24 घण्टाको लागि IPA को विभिन्न सांद्रता (10 μM, 100 μM र 1 mM; सिग्मा, 220027) सँग उपचार गरिएको थियो। यसबाहेक, HSC हरूलाई निष्क्रिय पार्न IPA को क्षमताको अनुसन्धान गर्न, LX-2 कोषहरूलाई 5 ng/ml TGF-β1 (R&D प्रणालीहरू, 240-B-002/CF) र 1 mM IPA सँग 24 घण्टाको लागि सीरम-मुक्त माध्यममा सह-उपचार गरिएको थियो। सम्बन्धित सवारी साधन नियन्त्रणहरूको लागि, TGF-β1 उपचारको लागि ०.१% BSA भएको ४ nM HCL प्रयोग गरिएको थियो र IPA उपचारको लागि ०.०५% DMSO प्रयोग गरिएको थियो, र दुवै संयोजन उपचारको लागि सँगै प्रयोग गरिएको थियो।
निर्माताको निर्देशन अनुसार ७-AAD (बायोलेजेन्ड, सान डिएगो, CA, USA, Cat# 640922) भएको FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit प्रयोग गरेर Apoptosis को मूल्याङ्कन गरिएको थियो। संक्षेपमा, LX-2 (१ × १०५ कोष/कुवा) लाई १२-कुवा प्लेटहरूमा रातभर कल्चर गरिएको थियो र त्यसपछि IPA वा IPA र TGF-β1 को धेरै खुराकहरूद्वारा उपचार गरिएको थियो। भोलिपल्ट, तैरिरहेका र अनुयायी कोषहरू सङ्कलन गरियो, ट्रिप्सिनाइज गरियो, PBS ले धोइयो, Annexin V बाइन्डिङ बफरमा पुन: निलम्बित गरियो, र १५ मिनेटको लागि FITC-Annexin V र 7-AAD सँग इन्क्युबेट गरिएको थियो।
जीवित कोषहरूमा माइटोकोन्ड्रियालाई Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (थर्मो फिशर साइन्टिफिक, कार्ल्सब्याड, CA) प्रयोग गरेर अक्सिडेटिभ गतिविधिको लागि दाग लगाइएको थियो। MTR परीक्षणहरूको लागि, LX-2 कोषहरूलाई IPA र TGF-β1 सँग समान घनत्वमा इन्क्युबेट गरिएको थियो। २४ घण्टा पछि, जीवित कोषहरूलाई ट्रिप्सिनाइज गरिएको थियो, PBS ले धोइएको थियो, र त्यसपछि पहिले वर्णन गरिए अनुसार २० मिनेटको लागि ३७ °C मा सीरम-मुक्त माध्यममा १०० μM MTR सँग इन्क्युबेट गरिएको थियो [26]। जीवित कोष आकार विज्ञान विश्लेषणको लागि, क्रमशः फर्वार्ड स्क्याटर (FSC) र साइड स्क्याटर (SSC) प्यारामिटरहरू प्रयोग गरेर कोष आकार र साइटोप्लाज्मिक जटिलताको विश्लेषण गरिएको थियो।
सबै डेटा (३०,००० घटनाहरू) NovoCyte Quanteon (Agilent) प्रयोग गरेर प्राप्त गरिएको थियो र NovoExpress® १.४.१ वा FlowJo V.10 सफ्टवेयर प्रयोग गरेर विश्लेषण गरिएको थियो।
निर्माताको निर्देशन अनुसार सीहर्स एक्सएफ सेल मिटो स्ट्रेसले सुसज्जित सीहर्स एक्स्ट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर (एजिलेन्ट टेक्नोलोजीज, सान्ता क्लारा, क्यालिफोर्निया) प्रयोग गरेर अक्सिजन खपत दर (ओसीआर) र एक्स्ट्रासेलुलर एसिडिफिकेशन दर (ईसीएआर) वास्तविक समयमा मापन गरिएको थियो। छोटकरीमा, २ × १०४ एलएक्स-२ कोषहरू/कुवाहरू XF96 सेल कल्चर प्लेटहरूमा राखिएका थिए। रातभर इन्क्युबेशन पछि, कोषहरूलाई आइसोप्रोपानोल (आईपीए) र TGF-β1 (पूरक विधिहरू १) ले उपचार गरिएको थियो। सीहर्स एक्सएफ वेभ सफ्टवेयर प्रयोग गरेर डेटा विश्लेषण गरिएको थियो, जसमा सीहर्स एक्सएफ सेल एनर्जी फेनोटाइप टेस्ट रिपोर्ट जेनरेटर समावेश छ। यसबाट, बायोएनर्जेटिक हेल्थ इन्डेक्स (BHI) गणना गरिएको थियो [27]।
कुल RNA लाई cDNA मा ट्रान्सक्राइब गरिएको थियो। विशिष्ट विधिहरूको लागि, सन्दर्भ हेर्नुहोस् [15]। मानव 60S राइबोसोमल एसिडिक प्रोटीन P0 (RPLP0) र साइक्लोफिलिन A1 (PPIA) mRNA स्तरहरू संवैधानिक जीन नियन्त्रणको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो। क्वान्टस्टुडियो 6 प्रो रियल-टाइम PCR प्रणाली (थर्मो फिशर, ल्यान्डस्मीर, द नेदरल्याण्ड्स) TaqMan™ फास्ट एडभान्स्ड मास्टर मिक्स किट (एप्लाइड बायोसिस्टम) वा सेन्सिफास्ट SYBR Lo-ROX किट (बायोलाइन, BIO 94050) सँग प्रयोग गरिएको थियो, र तुलनात्मक Ct मान साइकल चलाउने प्यारामिटरहरू (ΔΔCt) र ∆∆Ct विधि प्रयोग गरेर सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति तह गणना गरिएको थियो। प्राइमरहरूको विवरण पूरक तालिका S2 र S3 मा प्रदान गरिएको छ।
पहिले वर्णन गरिए अनुसार DNeasy रगत र तन्तु किट (Qiagen) प्रयोग गरेर न्यूक्लियर DNA (ncDNA) र माइटोकोन्ड्रियल DNA (mtDNA) निकालिएको थियो [28]। पूरक विधिहरू २ मा विस्तृत रूपमा वर्णन गरिए अनुसार, प्रत्येक लक्षित mtDNA क्षेत्रको तीन आणविक DNA क्षेत्रहरू (mtDNA/ncDNA) को ज्यामितीय माध्यसँग अनुपात गणना गरेर mtDNA को सापेक्षिक मात्रा गणना गरिएको थियो। mtDNA र ncDNA को लागि प्राइमरहरूको विवरण पूरक तालिका S4 मा प्रदान गरिएको छ।
जीवित कोषहरूलाई Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (थर्मो फिशर साइन्टिफिक, कार्ल्सबाड, CA) ले रंगाइएको थियो जसले गर्दा अन्तरकोशिकीय र अन्तरकोशिकीय माइटोकोन्ड्रियल नेटवर्कहरू कल्पना गर्न सकियोस्। LX-2 कोषहरू (१ × १०४ कोषहरू/कुवा) का साथ गिलास स्लाइडहरूमा सम्बन्धित गिलास-तल भएको कल्चर प्लेटहरू (Ibidi GmbH, Martinsried, जर्मनी) मा कल्चर गरिएको थियो। २४ घण्टा पछि, जीवित LX-2 कोषहरूलाई ३७ डिग्री सेल्सियसमा २० मिनेटको लागि १०० μM MTR सँग इन्क्युबेट गरिएको थियो र सेल न्यूक्लीहरूलाई पहिले वर्णन गरिए अनुसार DAPI (१ μg/ml, Sigma-Aldrich) ले रंगाइएको थियो [29]। Mitochondrial नेटवर्कहरूलाई Zeiss Axio Observer inverted microscope (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany) प्रयोग गरेर भिजुअलाइज गरिएको थियो जुन Zeiss LSM 800 confocal मोड्युलले सुसज्जित छ जुन ३७ डिग्री सेल्सियसमा ५% CO2 भएको आर्द्र वातावरणमा ६३×NA १.३ उद्देश्य प्रयोग गरेर देखाइएको थियो। हामीले प्रत्येक नमूना प्रकारको लागि दशवटा Z-श्रृङ्खलाका छविहरू प्राप्त गर्यौं। प्रत्येक Z-श्रृङ्खलामा ३० खण्डहरू छन्, प्रत्येकको मोटाई ९.८६ μm छ। प्रत्येक नमूनाको लागि, ZEN २००९ सफ्टवेयर (कार्ल जेइस माइक्रोइमेजिङ GmbH, जेना, जर्मनी) प्रयोग गरेर दस फरक दृश्य क्षेत्रका छविहरू प्राप्त गरिएको थियो, र पूरक विधिहरू ३ मा विस्तृत प्यारामिटरहरू अनुसार ImageJ सफ्टवेयर (v1.54d) [30, 31] प्रयोग गरेर माइटोकोन्ड्रियल मोर्फोलोजी विश्लेषण गरिएको थियो।
कोषहरूलाई ०.१ एम फस्फेट बफरमा २% ग्लुटाराल्डिहाइडले फिक्स गरिएको थियो, त्यसपछि १% ओस्मियम टेट्रोक्साइड घोल (सिग्मा एल्ड्रिच, एमओ, संयुक्त राज्य अमेरिका) सँग फिक्स गरिएको थियो, बिस्तारै एसीटोन (मर्क, डार्मस्ट्याड, जर्मनी) ले डिहाइड्रेट गरिएको थियो, र अन्तमा इपोक्सी रेजिनमा इम्बेड गरिएको थियो। अल्ट्राथिन सेक्सनहरू तयार पारिएका थिए र १% युरेनिल एसीटेट (मर्क, डार्मस्ट्याड, जर्मनी) र १% लिड साइट्रेट (मर्क, डार्मस्ट्याड, जर्मनी) ले रंगाइएको थियो। अल्ट्रास्ट्रक्चरल छविहरू ८० केभीको द्रुत भोल्टेजमा JEM २१००F EXII ट्रान्समिशन इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोप (JEOL लिमिटेड, टोकियो, जापान) प्रयोग गरेर प्राप्त गरिएको थियो।
Zeiss इन्भर्टेड लाइट माइक्रोस्कोप (Zeiss Axio Vert.A1 र AxioCam MRm, जेना, जर्मनी) प्रयोग गरेर ५०x म्याग्निफिकेसनमा चरण-कन्ट्रास्ट माइक्रोस्कोपीद्वारा २४ घण्टासम्म IPA मार्फत उपचार गरिएका LX-2 कोषहरूको आकारविज्ञानको विश्लेषण गरिएको थियो।
क्लिनिकल डेटालाई औसत ± मानक विचलन वा मध्य (अन्तरचतुर्थक दायरा: IQR) को रूपमा व्यक्त गरिएको थियो। तीन अध्ययन समूहहरू बीचको भिन्नताहरूको तुलना गर्न भिन्नता (निरन्तर चर) वा χ² परीक्षण (वर्गीकृत चर) को एक-तर्फी विश्लेषण प्रयोग गरिएको थियो। धेरै परीक्षणहरूको लागि सच्याउन गलत सकारात्मक दर (FDR) प्रयोग गरिएको थियो, र FDR < ०.०५ भएका जीनहरूलाई तथ्याङ्कीय रूपमा महत्त्वपूर्ण मानिएको थियो। CpG DNA मेथिलेसनलाई IPA संकेत तीव्रतासँग सहसम्बन्ध गर्न स्पियरम्यान सहसम्बन्ध विश्लेषण प्रयोग गरिएको थियो, जसमा नाममात्र p मानहरू (p < ०.०५) रिपोर्ट गरिएको थियो।
३०९३ कलेजो ट्रान्सक्रिप्टहरू मध्ये २६८ ट्रान्सक्रिप्टहरू (नाममात्र p < ०.०१), ११९ माइटोकोन्ड्रिया-सम्बद्ध ट्रान्सक्रिप्टहरू (नाममात्र p < ०.०५), र ४३५० CpGs को लागि वेब-आधारित जीन सेट विश्लेषण उपकरण (वेबगेस्टाल्ट) प्रयोग गरेर मार्ग विश्लेषण गरिएको थियो जुन परिसंचरण सीरम IPA स्तरहरूसँग सम्बन्धित थिए। स्वतन्त्र रूपमा उपलब्ध भेनी DB (संस्करण २.१.०) उपकरण ओभरल्यापिङ जीनहरू फेला पार्न प्रयोग गरिएको थियो, र स्ट्रिङDB (संस्करण ११.५) प्रोटीन-प्रोटिन अन्तरक्रियाहरू कल्पना गर्न प्रयोग गरिएको थियो।
LX-2 प्रयोगको लागि, D'Agostino-Pearson परीक्षण प्रयोग गरेर सामान्यताको लागि नमूनाहरूको परीक्षण गरिएको थियो। डेटा कम्तिमा तीन जैविक प्रतिकृतिहरूबाट प्राप्त गरिएको थियो र Bonferroni पोस्ट हक परीक्षणको साथ एक-तर्फी ANOVA को अधीनमा राखिएको थियो। ०.०५ भन्दा कमको p-मानलाई सांख्यिकीय रूपमा महत्त्वपूर्ण मानिएको थियो। डेटालाई औसत ± SD को रूपमा प्रस्तुत गरिएको छ, र प्रत्येक चित्रमा प्रयोगहरूको संख्या संकेत गरिएको छ। सबै विश्लेषण र ग्राफहरू Windows को लागि GraphPad Prism 8 सांख्यिकीय सफ्टवेयर (GraphPad Software Inc., संस्करण 8.4.3, San Diego, USA) प्रयोग गरेर गरिएको थियो।
पहिले, हामीले कलेजो, सम्पूर्ण शरीर, र माइटोकोन्ड्रियल ट्रान्सक्रिप्टहरूसँग सीरम IPA स्तरहरूको सम्बन्धको अनुसन्धान गर्यौं। कुल ट्रान्सक्रिप्ट प्रोफाइलमा, सीरम IPA स्तरहरूसँग सम्बन्धित सबैभन्दा बलियो जीन MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन काइनेज-सक्रिय प्रोटीन काइनेज 3) थियो; माइटोकोन्ड्रियल-सम्बन्धित ट्रान्सक्रिप्ट प्रोफाइलमा, सबैभन्दा बलियो सम्बन्धित जीन AKT1 (FDR = 0.7621; AKT सेरिन/थ्रेओनिन काइनेज 1) (अतिरिक्त फाइल 1 र अतिरिक्त फाइल 2) थियो।
त्यसपछि हामीले विश्वव्यापी ट्रान्सक्रिप्टहरू (n = 268; p < 0.01) र माइटोकोन्ड्रिया-सम्बद्ध ट्रान्सक्रिप्टहरू (n = 119; p < 0.05) विश्लेषण गर्यौं, अन्ततः एपोप्टोसिसलाई सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण क्यानोनिकल मार्ग (p = 0.0089) को रूपमा पहिचान गर्यौं। सीरम IPA स्तरहरूसँग सम्बन्धित माइटोकोन्ड्रियल ट्रान्सक्रिप्टहरूको लागि, हामीले एपोप्टोसिस (FDR = 0.00001), माइटोफेगी (FDR = 0.00029), र TNF संकेत मार्गहरू (FDR = 0.000006) मा ध्यान केन्द्रित गर्यौं (चित्र 1A, तालिका 2, र पूरक चित्रहरू 1A-B)।
सीरम IPA स्तरहरूसँग सम्बन्धित विश्वव्यापी, माइटोकोन्ड्रिया-सम्बद्ध ट्रान्सक्रिप्टहरू, र मानव कलेजोमा DNA मिथाइलेशनको ओभरल्यापिङ विश्लेषण। A ले २६८ विश्वव्यापी ट्रान्सक्रिप्टहरू, ११९ माइटोकोन्ड्रिया-सम्बद्ध ट्रान्सक्रिप्टहरू, र DNA मिथाइलेटेड ट्रान्सक्रिप्टहरू प्रतिनिधित्व गर्दछ जुन सीरम IPA स्तरहरूसँग सम्बन्धित ३०९२ CpG साइटहरूमा म्याप गरिएका छन् (ग्लोबल ट्रान्सक्रिप्टहरू र DNA मिथाइलेटेडको लागि p मानहरू < ०.०१, र माइटोकोन्ड्रियाल ट्रान्सक्रिप्टहरूको लागि p मानहरू < ०.०५)। प्रमुख ओभरल्यापिङ ट्रान्सक्रिप्टहरू बीचमा देखाइएका छन् (AKT1 र YKT6)। B अन्य जीनहरूसँग उच्चतम अन्तरक्रिया स्कोर (०.९००) भएका १३ जीनहरूको अन्तरक्रिया नक्सा ५६ ओभरल्यापिङ जीनहरू (कालो रेखा क्षेत्र) बाट निर्माण गरिएको थियो जुन अनलाइन उपकरण StringDB प्रयोग गरेर सीरम IPA स्तरहरूसँग उल्लेखनीय रूपमा सम्बन्धित थिए। हरियो: जीन ओन्टोलजी (GO) सेलुलर घटकमा म्याप गरिएका जीनहरू: माइटोकोन्ड्रिया (GO:0005739)। AKT1 डेटाको आधारमा (टेक्स्ट माइनिङ, प्रयोग, डाटाबेस र सह-अभिव्यक्तिमा आधारित) अन्य प्रोटिनहरूसँग अन्तरक्रियाको लागि उच्चतम स्कोर (०.९००) भएको प्रोटिन हो। नेटवर्क नोडहरूले प्रोटिनहरू प्रतिनिधित्व गर्छन्, र किनारहरूले प्रोटिनहरू बीचको जडानहरू प्रतिनिधित्व गर्छन्।
पेटको माइक्रोबायोटा मेटाबोलाइटहरूले DNA मिथाइलेशन [32] मार्फत एपिजेनेटिक संरचनालाई नियमन गर्न सक्ने भएकोले, हामीले अनुसन्धान गर्यौं कि सीरम IPA स्तरहरू कलेजो DNA मिथाइलेशनसँग सम्बन्धित छन् कि छैनन्। हामीले पत्ता लगायौं कि सीरम IPA स्तरहरूसँग सम्बन्धित दुई प्रमुख मिथाइलेशन साइटहरू प्रोलाइन-सेरिन-समृद्ध क्षेत्र 3 (C19orf55) र गर्मी झट्का प्रोटीन परिवार B (सानो) सदस्य 6 (HSPB6) (अतिरिक्त फाइल 3) नजिक थिए। 4350 CpG (p < 0.01) को DNA मिथाइलेशन सीरम IPA स्तरहरूसँग सम्बन्धित थियो र दीर्घायु नियामक मार्गहरू (p = 0.006) (चित्र 1A, तालिका 2, र पूरक चित्र 1C) मा समृद्ध थियो।
मानव कलेजोमा सीरम IPA स्तरहरू, विश्वव्यापी ट्रान्सक्रिप्टहरू, माइटोकोन्ड्रिया-सम्बद्ध ट्रान्सक्रिप्टहरू, र DNA मिथाइलेशन बीचको सम्बन्धलाई बुझ्नको लागि, हामीले अघिल्लो मार्ग विश्लेषण (चित्र 1A) मा पहिचान गरिएका जीनहरूको ओभरल्याप विश्लेषण गर्यौं। चित्र 1A मा कालो रेखा भित्र 56 ओभरल्यापिङ जीनहरूको मार्ग संवर्धन विश्लेषणको नतिजाले देखाएको छ कि एपोप्टोसिस मार्ग (p = 0.00029) ले तीन विश्लेषणहरूमा सामान्य दुई जीनहरू हाइलाइट गर्दछ: AKT1 र YKT6 (YKT6 v-SNARE homolog), भेन रेखाचित्र (पूरक चित्र 2 र चित्र 1A) मा देखाइए अनुसार। चाखलाग्दो कुरा के छ भने, हामीले AKT1 (cg19831386) र YKT6 (cg24161647) सीरम IPA स्तरहरूसँग सकारात्मक रूपमा सहसम्बन्धित भएको पायौं (अतिरिक्त फाइल 3)। जीन उत्पादनहरू बीच सम्भावित प्रोटीन अन्तरक्रियाहरू पहिचान गर्न, हामीले इनपुटको रूपमा 56 ओभरल्यापिङ जीनहरू मध्ये उच्चतम सामान्य क्षेत्र स्कोर (0.900) भएका 13 जीनहरू चयन गर्यौं र अन्तरक्रिया नक्सा निर्माण गर्यौं। आत्मविश्वास स्तर (सीमान्त आत्मविश्वास) अनुसार, उच्चतम स्कोर (०.९००) भएको AKT1 जीन शीर्षमा थियो (चित्र १B)।
मार्ग विश्लेषणको आधारमा, हामीले पत्ता लगायौं कि एपोप्टोसिस प्रमुख मार्ग थियो, त्यसैले हामीले IPA उपचारले इन भिट्रो HSCs को एपोप्टोसिसलाई असर गर्छ कि गर्दैन भनेर अनुसन्धान गर्यौं। हामीले पहिले प्रदर्शन गर्यौं कि IPA को विभिन्न खुराकहरू (१० μM, १०० μM, र १ mM) LX-२ कोशिकाहरूको लागि गैर-विषाक्त थिए [१५]। यो अध्ययनले देखाएको छ कि १० μM र १०० μM मा IPA उपचारले व्यवहार्य र नेक्रोटिक कोशिकाहरूको संख्या बढायो। यद्यपि, नियन्त्रण समूहको तुलनामा, कोशिका व्यवहार्यता १ mM IPA एकाग्रतामा घट्यो, जबकि कोशिका नेक्रोसिस दर अपरिवर्तित रह्यो (चित्र २A, B)। अर्को, LX-२ कोशिकाहरूमा एपोप्टोसिस प्रेरित गर्न इष्टतम सांद्रता फेला पार्न, हामीले २४ घण्टाको लागि १० μM, १०० μM, र १ mM IPA परीक्षण गर्यौं (चित्र २A-E र पूरक चित्र ३A-B)। रोचक कुरा के छ भने, IPA १० μM र १०० μM ले एपोप्टोसिस दर (%) घटायो, यद्यपि, IPA १ mM ले नियन्त्रणको तुलनामा ढिलो एपोप्टोसिस र एपोप्टोसिस दर (%) बढायो र त्यसैले थप प्रयोगहरूको लागि छनोट गरियो (चित्र २A–D)।
IPA ले LX-2 कोषहरूको एपोप्टोसिसलाई प्रेरित गर्छ। फ्लो साइटोमेट्रीद्वारा एपोप्टोटिक दर र कोष आकारविज्ञानको मात्रा निर्धारण गर्न Annexin V र 7-AAD डबल स्टेनिङ विधि प्रयोग गरिएको थियो। BA कोषहरूलाई २४ घण्टाको लागि १० μM, १०० μM र १ mM IPA वा २४ घण्टाको लागि F–H TGF-β1 (५ ng/ml) र १ mM IPA सँग सीरम-मुक्त माध्यममा इन्क्युबेट गरिएको थियो। A: जीवित कोषहरू (Annexin V -/ 7AAD-); B: नेक्रोटिक कोषहरू (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: प्रारम्भिक (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: ढिलो (Annexin V+/7AAD.+); E, H: एपोपोटिक दर (%) मा कुल प्रारम्भिक र ढिलो एपोपोटिक कोषहरूको प्रतिशत। डेटा औसत ± SD, n = ३ स्वतन्त्र प्रयोगहरूको रूपमा व्यक्त गरिएको छ। तथ्याङ्कीय तुलनाहरू बोनफेरोनी पोस्ट हक परीक्षणको साथ एकतर्फी ANOVA प्रयोग गरेर गरिएको थियो। *p < ०.०५; ****p < ०.०००१
हामीले पहिले देखाइसकेका छौं, ५ ng/ml TGF-β1 ले क्लासिकल मार्कर जीनको अभिव्यक्ति बढाएर HSC सक्रियतालाई प्रेरित गर्न सक्छ [15]। LX-2 कोषहरूलाई ५ ng/ml TGF-β1 र १ mM IPA संयोजनमा उपचार गरिएको थियो (चित्र २E–H)। TGF-β1 उपचारले एपोप्टोसिस दर परिवर्तन गरेन, यद्यपि, IPA सह-उपचारले TGF-β1 उपचारको तुलनामा ढिलो एपोप्टोसिस र एपोप्टोसिस दर (%) बढायो (चित्र २E–H)। यी नतिजाहरूले संकेत गर्छन् कि १ mM IPA ले TGF-β1 प्रेरणबाट स्वतन्त्र रूपमा LX-2 कोषहरूमा एपोप्टोसिसलाई बढावा दिन सक्छ।
हामीले LX-2 कोषहरूमा माइटोकोन्ड्रियल श्वसनमा IPA को प्रभावको थप अनुसन्धान गर्यौं। नतिजाहरूले देखाए कि १ mM IPA ले अक्सिजन खपत दर (OCR) प्यारामिटरहरू घटायो: नियन्त्रण समूहको तुलनामा गैर-माइटोकोन्ड्रियल श्वसन, बेसल र अधिकतम श्वसन, प्रोटोन चुहावट र ATP उत्पादन (चित्र ३A, B), जबकि बायोएनर्जेटिक स्वास्थ्य सूचकांक (BHI) परिवर्तन भएन।
IPA ले LX-2 कोषहरूमा माइटोकोन्ड्रियल श्वासप्रश्वास घटाउँछ। माइटोकोन्ड्रियल श्वसन कर्भ (OCR) लाई माइटोकोन्ड्रियल श्वसन प्यारामिटरहरू (गैर-माइटोकोन्ड्रियल श्वसन, बेसल श्वसन, अधिकतम श्वसन, प्रोटोन चुहावट, ATP उत्पादन, SRC र BHI) को रूपमा प्रस्तुत गरिएको छ। कोषहरू A र B लाई क्रमशः २४ घण्टाको लागि १० μM, १०० μM र १ mM IPA इन्क्युबेट गरिएको थियो। कोषहरू C र D लाई क्रमशः २४ घण्टाको लागि सीरम-मुक्त माध्यममा TGF-β1 (५ ng/ml) र १ mM IPA इन्क्युबेट गरिएको थियो। सबै मापनहरू CyQuant किट प्रयोग गरेर DNA सामग्रीमा सामान्यीकृत गरिएको थियो। BHI: बायोएनर्जेटिक स्वास्थ्य सूचकांक; SRC: श्वासप्रश्वास आरक्षित क्षमता; OCR: अक्सिजन खपत दर। डेटा औसत ± मानक विचलन (SD), n = ५ स्वतन्त्र प्रयोगहरूको रूपमा प्रस्तुत गरिएको छ। एकतर्फी ANOVA र Bonferroni पोस्ट हक परीक्षण प्रयोग गरेर तथ्याङ्कीय तुलनाहरू गरिएको थियो। *p < ०.०५; **p < ०.०१; र ***p < ०.००१
TGF-β1-सक्रिय LX-2 कोषहरूको बायोएनर्जेटिक प्रोफाइलमा IPA को प्रभावको बारेमा थप व्यापक बुझाइ प्राप्त गर्न, हामीले OCR द्वारा माइटोकोन्ड्रियल अक्सिडेटिभ फास्फोरिलेसनको विश्लेषण गर्यौं (चित्र 3C,D)। नतिजाहरूले देखाए कि TGF-β1 उपचारले नियन्त्रण समूहको तुलनामा अधिकतम श्वासप्रश्वास, श्वासप्रश्वास आरक्षित क्षमता (SRC) र BHI घटाउन सक्छ (चित्र 3C,D)। थप रूपमा, संयोजन उपचारले बेसल श्वसन, प्रोटोन चुहावट र ATP उत्पादन घटायो, तर SRC र BHI TGF-β1 (चित्र 3C,D) सँग उपचार गरिएको भन्दा उल्लेखनीय रूपमा उच्च थिए।
हामीले Seahorse सफ्टवेयर (पूरक चित्र ४A–D) द्वारा प्रदान गरिएको "कोशिकीय ऊर्जा फेनोटाइप परीक्षण" पनि गर्यौं। पूरक चित्र ३B मा देखाइए अनुसार, TGF-β1 उपचार पछि OCR र ECAR दुवै मेटाबोलिक क्षमता घट्यो, यद्यपि, नियन्त्रण समूहको तुलनामा संयोजन र IPA उपचार समूहहरूमा कुनै भिन्नता देखिएन। यसबाहेक, नियन्त्रण समूहको तुलनामा संयोजन र IPA उपचार पछि OCR को बेसल र तनाव स्तर दुवै घट्यो (पूरक चित्र ४C)। चाखलाग्दो कुरा के छ भने, संयोजन थेरापीको साथ समान ढाँचा अवलोकन गरिएको थियो, जहाँ TGF-β1 उपचारको तुलनामा ECAR को बेसल र तनाव स्तरमा कुनै परिवर्तन देखिएन (पूरक चित्र ४C)। HSC मा, माइटोकोन्ड्रियल अक्सिडेटिभ फास्फोरिलेसनमा कमी र TGF-β1 उपचारको सम्पर्क पछि SCR र BHI पुनर्स्थापित गर्न संयोजन उपचारको क्षमताले मेटाबोलिक क्षमता (OCR र ECAR) लाई परिवर्तन गरेन। एकसाथ लिँदा, यी नतिजाहरूले संकेत गर्छन् कि IPA ले HSC मा बायोएनर्जेटिक्स घटाउन सक्छ, जसले सुझाव दिन्छ कि IPA ले कम ऊर्जावान प्रोफाइललाई प्रेरित गर्न सक्छ जसले HSC फेनोटाइपलाई निष्क्रियता तर्फ सार्छ (पूरक चित्र 4D)।
माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलतामा IPA को प्रभावको अनुसन्धान माइटोकोन्ड्रियल आकारविज्ञान र नेटवर्क जडानहरूको त्रि-आयामी परिमाणीकरण साथै MTR स्टेनिङ (चित्र ४ र पूरक चित्र ५) प्रयोग गरेर गरिएको थियो। चित्र ४ ले देखाउँछ कि नियन्त्रण समूहको तुलनामा, TGF-β1 उपचारले औसत सतह क्षेत्रफल, शाखा संख्या, कुल शाखा लम्बाइ, र शाखा जंक्शन नम्बर (चित्र ४A र B) घटायो र माइटोकोन्ड्रियाको अनुपात गोलाकारबाट मध्यवर्ती आकारविज्ञान (चित्र ४C) मा परिवर्तन गर्‍यो। केवल IPA उपचारले मात्र औसत माइटोकोन्ड्रियल भोल्युम घटायो र नियन्त्रण समूह (चित्र ४A) को तुलनामा माइटोकोन्ड्रियलको अनुपात गोलाकारबाट मध्यवर्ती आकारविज्ञानमा परिवर्तन गर्‍यो। यसको विपरित, माइटोकोन्ड्रियल झिल्ली सम्भाव्यता-निर्भर MTR (चित्र ४A र E) द्वारा मूल्याङ्कन गरिएको गोलाकारता, औसत शाखा लम्बाइ, र माइटोकोन्ड्रियल गतिविधि अपरिवर्तित रह्यो र यी प्यारामिटरहरू समूहहरू बीच फरक भएनन्। एकसाथ लिँदा, यी परिणामहरूले सुझाव दिन्छ कि TGF-β1 र IPA उपचारले जीवित LX-2 कोशिकाहरूमा माइटोकोन्ड्रियल आकार र आकार साथै नेटवर्क जटिलतालाई परिमार्जन गर्दछ।
IPA ले LX-2 कोषहरूमा माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलता र माइटोकोन्ड्रियल DNA प्रशस्ततालाई परिवर्तन गर्छ। A. TGF-β1 (5 ng/ml) र 1 mM IPA ले २४ घण्टाको लागि सीरम-मुक्त माध्यममा इन्क्युबेट गरिएको प्रत्यक्ष LX-2 कोषहरूको प्रतिनिधि कन्फोकल छविहरू Mitotracker™ रातो CMXRos र DAPI सँग नीलो रंगको न्यूक्ली दाग ​​भएको माइटोकोन्ड्रियल नेटवर्कहरू देखाउँछन्। सबै डेटामा प्रति समूह कम्तिमा १५ छविहरू थिए। हामीले प्रत्येक नमूना प्रकारको लागि १० Z-स्ट्याक छविहरू प्राप्त गर्यौं। प्रत्येक Z-अक्ष अनुक्रममा ३० स्लाइसहरू थिए, प्रत्येकको मोटाई ९.८६ μm थियो। स्केल बार: १० μm। B. छविमा अनुकूली थ्रेसहोल्डिङ लागू गरेर पहिचान गरिएको प्रतिनिधि वस्तुहरू (माइटोकोन्ड्रियल मात्र)। प्रत्येक समूहका सबै कोषहरूको लागि माइटोकोन्ड्रियल मोर्फोलॉजिकल नेटवर्क जडानहरूको मात्रात्मक विश्लेषण र तुलना गरिएको थियो। C. माइटोकोन्ड्रियल आकार अनुपातको आवृत्ति। ० नजिकको मानहरूले गोलाकार आकारहरू संकेत गर्दछ, र १ नजिकको मानहरूले फिलामेन्टस आकारहरू संकेत गर्दछ। D माइटोकन्ड्रियल डीएनए (mtDNA) सामग्री सामग्री र विधिहरूमा वर्णन गरिए अनुसार निर्धारण गरिएको थियो। E Mitotracker™ Red CMXRos विश्लेषण सामग्री र विधिहरूमा वर्णन गरिए अनुसार प्रवाह साइटोमेट्री (३०,००० घटनाहरू) द्वारा गरिएको थियो। डेटा औसत ± SD, n = ३ स्वतन्त्र प्रयोगहरूको रूपमा प्रस्तुत गरिएको छ। एकतर्फी ANOVA र Bonferroni पोस्ट हक परीक्षण प्रयोग गरेर तथ्याङ्कीय तुलनाहरू गरिएको थियो। *p < ०.०५; **p < ०.०१; ***p < ०.००१; ****p < ०.०००१
त्यसपछि हामीले LX-2 कोषहरूमा mtDNA सामग्रीलाई माइटोकोन्ड्रियल संख्याको सूचकको रूपमा विश्लेषण गर्यौं। नियन्त्रण समूहको तुलनामा, TGF-β1-उपचार गरिएको समूहमा mtDNA सामग्री बढाइएको थियो (चित्र 4D)। TGF-β1-उपचार गरिएको समूहको तुलनामा, संयोजन उपचार समूह (चित्र 4D) मा mtDNA सामग्री घटाइएको थियो, जसले सुझाव दिन्छ कि IPA ले mtDNA सामग्री र सम्भवतः माइटोकोन्ड्रियल संख्या साथै माइटोकोन्ड्रियल श्वसन (चित्र 3C) घटाउन सक्छ। यसबाहेक, IPA ले संयोजन उपचारमा mtDNA सामग्री घटाएको देखिन्थ्यो तर MTR-मध्यस्थता गरिएको माइटोकोन्ड्रियल गतिविधिलाई असर गरेन (चित्र 4A-C)।
हामीले LX-2 कोषहरूमा फाइब्रोसिस, एपोप्टोसिस, बाँच्ने क्षमता, र माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलतासँग सम्बन्धित जीनको mRNA स्तरहरूसँग IPA को सम्बन्धको अनुसन्धान गर्यौं (चित्र 5A–D)। नियन्त्रण समूहको तुलनामा, TGF-β1-उपचार गरिएको समूहले कोलाजेन प्रकार I α2 चेन (COL1A2), α-स्मूथ मांसपेशी एक्टिन (αSMA), म्याट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेज 2 (MMP2), मेटालोप्रोटीनेज 1 (TIMP1) को टिस्यु इन्हिबिटर, र डायनामिन 1-जस्तो जीन (DRP1) जस्ता जीनको अभिव्यक्तिमा वृद्धि देखायो, जसले फाइब्रोसिस र सक्रियता बढेको संकेत गर्दछ। यसबाहेक, नियन्त्रण समूहको तुलनामा, TGF-β1 उपचारले न्यूक्लियर प्रेग्नेन X रिसेप्टर (PXR), क्यास्पेस 8 (CASP8), MAPKAPK3, B-सेल α को इन्हिबिटर, न्यूक्लियर फ्याक्टर κ जीन लाइट पेप्टाइड (NFκB1A) को इन्हायडर, र न्यूक्लियर फ्याक्टर κB किनेज सबयुनिट β (IKBKB) को इन्हिबिटर (चित्र 5A–D) को mRNA स्तर घटायो। TGF-β1 उपचारको तुलनामा, TGF-β1 र IPA सँगको संयोजन उपचारले COL1A2 र MMP2 को अभिव्यक्ति घटायो, तर PXR, TIMP1, B-सेल लिम्फोमा-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, र IKBKB को mRNA स्तर बढायो। IPA उपचारले MMP2, Bcl-2-सम्बद्ध प्रोटीन X (BAX), AKT1, अप्टिक एट्रोफी प्रोटीन 1 (OPA1), र माइटोकोन्ड्रियल फ्युजन प्रोटीन 2 (MFN2) को अभिव्यक्तिलाई उल्लेखनीय रूपमा घटायो, जबकि CASP8, NFκB1A, NFκB1B, र IKBKB को अभिव्यक्ति नियन्त्रण समूहको तुलनामा बढेको थियो। यद्यपि, क्यास्पेस-3 (CASP3), एपोप्टोटिक पेप्टिडेज सक्रिय गर्ने कारक 1 (APAF1), माइटोकोन्ड्रियल फ्युजन प्रोटीन 1 (MFN1), र फिसन प्रोटीन 1 (FIS1) को अभिव्यक्तिमा कुनै भिन्नता भेटिएन। सामूहिक रूपमा, यी नतिजाहरूले सुझाव दिन्छ कि IPA उपचारले फाइब्रोसिस, एपोप्टोसिस, बाँच्ने क्षमता, र माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलतासँग सम्बन्धित जीनको अभिव्यक्तिलाई परिमार्जन गर्दछ। हाम्रो डेटाले सुझाव दिन्छ कि IPA उपचारले LX-2 कोशिकाहरूमा फाइब्रोसिस कम गर्छ; एकै समयमा, यसले फेनोटाइपलाई निष्क्रियता तर्फ सारेर बाँच्नको लागि उत्तेजित गर्दछ।
IPA ले LX-2 कोषहरूमा फाइब्रोब्लास्ट, एपोप्टोटिक, व्यवहार्यता, र माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलता जीनको अभिव्यक्तिलाई मोड्युलेट गर्दछ। LX-2 कोषहरूलाई २४ घण्टाको लागि सीरम-मुक्त माध्यममा TGF-β1 र IPA सँग प्रेरित गरिएपछि हिस्टोग्रामहरूले अन्तर्जात नियन्त्रण (RPLP0 वा PPIA) को सापेक्ष mRNA अभिव्यक्ति प्रदर्शन गर्दछ। A ले फाइब्रोब्लास्टहरूलाई संकेत गर्दछ, B ले एपोप्टोटिक कोषहरूलाई संकेत गर्दछ, C ले जीवित कोषहरूलाई संकेत गर्दछ, र D ले माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलता जीन अभिव्यक्तिलाई संकेत गर्दछ। डेटा औसत ± मानक विचलन (SD), n = 3 स्वतन्त्र प्रयोगहरूको रूपमा प्रस्तुत गरिन्छ। एक-तर्फी ANOVA र Bonferroni पोस्ट हक परीक्षण प्रयोग गरेर तथ्याङ्कीय तुलनाहरू गरिएको थियो। *p < ०.०५; **p < ०.०१; ***p < ०.००१; ****p < ०.०००१
त्यसपछि, कोषको आकार (FSC-H) र साइटोप्लाज्मिक जटिलता (SSC-H) मा परिवर्तनहरू फ्लो साइटोमेट्री (चित्र 6A,B) द्वारा मूल्याङ्कन गरियो, र IPA उपचार पछि कोषको आकार विज्ञानमा परिवर्तनहरू ट्रान्समिशन इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोपी (TEM) र फेज कन्ट्रास्ट माइक्रोस्कोपी (पूरक चित्र 6A-B) द्वारा मूल्याङ्कन गरियो। अपेक्षा गरिए अनुसार, TGF-β1-उपचार गरिएको समूहमा कोषहरू नियन्त्रण समूह (चित्र 6A,B) को तुलनामा आकारमा बढे, जसले रफ एन्डोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ER*) र फागोलिसोसोम (P) को क्लासिक विस्तार देखाउँछ, जसले हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल (HSC) सक्रियता (पूरक चित्र 6A) लाई संकेत गर्दछ। यद्यपि, TGF-β1-उपचार गरिएको समूहको तुलनामा, TGF-β1 र IPA संयोजन उपचार समूह (पूरक चित्र 6A) मा कोषको आकार, साइटोप्लाज्मिक जटिलता (चित्र 6A,B), र ER* सामग्री घटाइएको थियो। यसबाहेक, IPA उपचारले नियन्त्रण समूहको तुलनामा कोषको आकार, साइटोप्लाज्मिक जटिलता (चित्र 6A,B), P र ER* सामग्री (पूरक चित्र 6A) घटायो। यसको अतिरिक्त, नियन्त्रण समूहको तुलनामा IPA उपचारको 24 घण्टा पछि एपोपटोटिक कोषहरूको सामग्री बढ्यो (सेतो तीर, पूरक चित्र 6B)। सामूहिक रूपमा, यी परिणामहरूले सुझाव दिन्छ कि 1 mM IPA ले HSC एपोप्टोसिसलाई उत्तेजित गर्न सक्छ र TGF-β1 द्वारा प्रेरित कोषको आकारात्मक प्यारामिटरहरूमा परिवर्तनहरूलाई उल्टाउन सक्छ, जसले गर्दा कोषको आकार र जटिलतालाई नियमन गर्न सकिन्छ, जुन HSC निष्क्रियतासँग सम्बन्धित हुन सक्छ।
IPA ले LX-2 कोषहरूमा कोषको आकार र साइटोप्लाज्मिक जटिलता परिवर्तन गर्दछ। प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषणका प्रतिनिधि छविहरू। विश्लेषणले LX-2 कोषहरूको लागि विशिष्ट गेटिङ रणनीति प्रयोग गर्‍यो: कोष जनसंख्या परिभाषित गर्न SSC-A/FSC-A, डबल्ट्स पहिचान गर्न FSC-H/FSC-A, र कोषको आकार र जटिलता विश्लेषणको लागि SSC-H/FSC-H। कोषहरूलाई २४ घण्टाको लागि सीरम-मुक्त माध्यममा TGF-β1 (5 ng/ml) र 1 mM IPA ले इन्क्युबेट गरिएको थियो। LX-2 कोषहरूलाई तल्लो बायाँ चतुर्थांश (SSC-H-/FSC-H-), माथिल्लो बायाँ चतुर्थांश (SSC-H+/FSC-H-), तल्लो दायाँ चतुर्थांश (SSC-H-/FSC-H+), र माथिल्लो दायाँ चतुर्थांश (SSC-H+/FSC-H+) मा सेल आकार र साइटोप्लाज्मिक जटिलता विश्लेषणको लागि वितरण गरिएको थियो। B. FSC-H (फर्वार्ड स्क्याटर, सेल साइज) र SSC-H (साइड स्क्याटर, साइटोप्लाज्मिक जटिलता) (३०,००० घटनाहरू) प्रयोग गरेर फ्लो साइटोमेट्रीद्वारा कोष आकारविज्ञानको विश्लेषण गरिएको थियो। डेटालाई औसत ± SD, n = ३ स्वतन्त्र प्रयोगहरूको रूपमा प्रस्तुत गरिएको छ। एकतर्फी ANOVA र Bonferroni पोस्ट हक परीक्षण प्रयोग गरेर तथ्याङ्कीय तुलनाहरू गरिएको थियो। *p < ०.०५; **p < ०.०१; ***p < ०.००१ र ****p < ०.०००१
IPA जस्ता आन्द्राका मेटाबोलाइटहरू अनुसन्धानको तातो विषय बनेका छन्, जसले सुझाव दिन्छ कि आन्द्राको माइक्रोबायोटामा नयाँ लक्ष्यहरू पत्ता लगाउन सकिन्छ। त्यसैले यो रोचक छ कि IPA, हामीले मानवमा कलेजो फाइब्रोसिससँग जोडेको मेटाबोलाइट [15], पशु मोडेलहरूमा सम्भावित एन्टी-फाइब्रोटिक यौगिकको रूपमा देखाइएको छ [13, 14]। यहाँ, हामी पहिलो पटक टाइप 2 मधुमेह (T2D) बिना मोटो व्यक्तिहरूमा सीरम IPA र ग्लोबल लिभर ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स र DNA मेथिलेसन बीचको सम्बन्ध प्रदर्शन गर्छौं, एपोप्टोसिस, माइटोफेगी र दीर्घायुलाई हाइलाइट गर्दै, साथै कलेजोको होमियोस्टेसिसलाई नियमन गर्ने सम्भावित उम्मेदवार जीन AKT1। हाम्रो अध्ययनको अर्को नवीनता यो हो कि हामीले LX-2 कोशिकाहरूमा एपोप्टोसिस, सेल मोर्फोलोजी, माइटोकोन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स र गतिशीलतासँग IPA उपचारको अन्तरक्रिया प्रदर्शन गर्यौं, जसले HSC फेनोटाइपलाई निष्क्रियता तर्फ सार्ने कम ऊर्जा स्पेक्ट्रमलाई संकेत गर्दछ, IPA लाई कलेजो फाइब्रोसिस सुधार गर्न सम्भावित उम्मेदवार बनाउँछ।
हामीले पत्ता लगायौं कि एपोप्टोसिस, माइटोफेजी र दीर्घायु परिसंचरण सीरम IPA सँग सम्बन्धित कलेजो जीनहरूमा समृद्ध सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण क्यानोनिकल मार्गहरू थिए। माइटोकोन्ड्रियल गुणस्तर नियन्त्रण (MQC) प्रणालीको अवरोधले माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शन, माइटोफेजी र एपोप्टोसिस निम्त्याउन सक्छ, जसले गर्दा MASLD [33, 34] को घटनालाई बढावा दिन्छ। त्यसकारण, हामी अनुमान गर्न सक्छौं कि IPA कलेजोमा एपोप्टोसिस, माइटोफेजी र दीर्घायु मार्फत कोशिका गतिशीलता र माइटोकोन्ड्रियल अखण्डता कायम राख्न संलग्न हुन सक्छ। हाम्रो डेटाले देखाएको छ कि तीनवटा परीक्षणहरूमा दुई जीनहरू सामान्य थिए: YKT6 र AKT1। यो ध्यान दिन लायक छ कि YKT6 कोशिका झिल्ली फ्युजनको प्रक्रियामा संलग्न SNARE प्रोटीन हो। यसले अटोफेगोसोममा STX17 र SNAP29 सँग एक इनिसिएशन कम्प्लेक्स बनाएर अटोफेगी र माइटोफेजीमा भूमिका खेल्छ, जसले गर्दा अटोफेगोसोम र लाइसोसोमको फ्युजनलाई बढावा दिन्छ [35]। यसबाहेक, YKT6 प्रकार्यको क्षतिले बिग्रिएको माइटोफेजी [36] मा परिणाम दिन्छ, जबकि YKT6 को अपरेगुलेसन हेपाटोसेलुलर कार्सिनोमा (HCC) को प्रगतिसँग सम्बन्धित छ, जसले कोशिकाको अस्तित्व बढेको देखाउँछ [37]। अर्कोतर्फ, AKT1 सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण अन्तरक्रिया गर्ने जीन हो र PI3K/AKT सिग्नलिंग मार्ग, कोशिका चक्र, कोशिका माइग्रेसन, प्रसार, फोकल आसंजन, माइटोकोन्ड्रियल प्रकार्य, र कोलाजेन स्राव [38-40] सहित कलेजो रोगहरूमा महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छ। सक्रिय PI3K/AKT सिग्नलिंग मार्गले हेमेटोपोएटिक स्टेम सेलहरू (HSCs) सक्रिय गर्न सक्छ, जुन एक्स्ट्रासेलुलर म्याट्रिक्स (ECM) को उत्पादनको लागि जिम्मेवार कोशिकाहरू हुन्, र यसको डिसरेगुलेसनले कलेजो फाइब्रोसिसको घटना र प्रगतिमा योगदान पुर्‍याउन सक्छ [40]। थप रूपमा, AKT प्रमुख कोशिकाको अस्तित्व कारकहरू मध्ये एक हो जसले p53-निर्भर कोशिका एपोप्टोसिसलाई रोक्छ, र AKT सक्रियता कलेजो कोशिका एपोप्टोसिसको अवरोधसँग सम्बन्धित हुन सक्छ [41, 42]। प्राप्त नतिजाहरूले सुझाव दिन्छ कि IPA कलेजोको माइटोकोन्ड्रिया-सम्बन्धित एपोप्टोसिसमा संलग्न हुन सक्छ, एपोप्टोसिसमा प्रवेश गर्ने वा बाँच्ने बीचको हेपाटोसाइट्सको निर्णयलाई असर गरेर। यी प्रभावहरू AKT र/वा YKT6 उम्मेदवार जीनहरू द्वारा नियमन गर्न सकिन्छ, जुन कलेजोको होमियोस्टेसिसको लागि महत्त्वपूर्ण छन्।
हाम्रो नतिजाले देखाएको छ कि १ एमएम आईपीएले एपोप्टोसिसलाई प्रेरित गर्‍यो र TGF-β1 उपचारबाट स्वतन्त्र LX-2 कोषहरूमा माइटोकोन्ड्रियल श्वासप्रश्वास घटायो। यो उल्लेखनीय छ कि एपोप्टोसिस फाइब्रोसिस रिजोल्युसन र हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल (HSC) सक्रियताको लागि एक प्रमुख मार्ग हो, र कलेजो फाइब्रोसिसको उल्टाउन सकिने शारीरिक प्रतिक्रियामा पनि एक प्रमुख घटना हो [4, 43]। यसबाहेक, संयोजन उपचार पछि LX-2 कोषहरूमा BHI को पुनर्स्थापनाले माइटोकोन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्सको नियमनमा IPA को सम्भावित भूमिकामा नयाँ अन्तर्दृष्टि प्रदान गर्‍यो। आराम गर्ने र निष्क्रिय अवस्थाहरूमा, हेमेटोपोएटिक कोषहरूले सामान्यतया एटीपी उत्पादन गर्न माइटोकोन्ड्रियल अक्सिडेटिभ फास्फोरिलेसन प्रयोग गर्छन् र कम मेटाबोलिक गतिविधि हुन्छ। अर्कोतर्फ, एचएससी सक्रियताले ग्लाइकोलाइटिक अवस्थामा प्रवेश गर्ने ऊर्जा मागहरूको क्षतिपूर्ति गर्न माइटोकोन्ड्रियल श्वसन र जैव संश्लेषणलाई बढाउँछ [44]। आईपीएले मेटाबोलिक क्षमता र ECAR लाई असर नगरेको तथ्यले ग्लाइकोलाइटिक मार्गलाई कम प्राथमिकता दिइएको सुझाव दिन्छ। त्यस्तै गरी, अर्को अध्ययनले देखाएको छ कि १ एमएम आईपीएले कार्डियोमायोसाइट्स, मानव हेपाटोसाइट सेल लाइन (Huh7) र मानव नाभी नसा एन्डोथेलियल कोशिकाहरू (HUVEC) मा माइटोकोन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला गतिविधिलाई परिमार्जन गर्न सक्षम थियो; यद्यपि, कार्डियोमायोसाइट्समा ग्लाइकोलिसिसमा आईपीएको कुनै प्रभाव फेला परेन, जसले सुझाव दिन्छ कि आईपीएले अन्य कोशिका प्रकारहरूको बायोएनर्जेटिक्सलाई असर गर्न सक्छ [45]। त्यसकारण, हामी अनुमान गर्छौं कि १ एमएम आईपीएले हल्का रासायनिक अनकप्लरको रूपमा काम गर्न सक्छ, किनकि यसले mtDNA को मात्रा परिवर्तन नगरी फाइब्रोजेनिक जीन अभिव्यक्ति, कोशिका आकारविज्ञान र माइटोकोन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्सलाई उल्लेखनीय रूपमा कम गर्न सक्छ [46]। माइटोकोन्ड्रियल अनकप्लरहरूले संस्कृति-प्रेरित फाइब्रोसिस र एचएससी सक्रियतालाई रोक्न सक्छन् [47] र अनकप्लिंग प्रोटीन (UCP) वा एडेनिन न्यूक्लियोटाइड ट्रान्सलोकेस (ANT) जस्ता निश्चित प्रोटीनहरू द्वारा नियमन वा प्रेरित माइटोकोन्ड्रियल एटीपी उत्पादनलाई कम गर्न सक्छन्। कोशिका प्रकारमा निर्भर गर्दै, यो घटनाले कोशिकाहरूलाई एपोप्टोसिसबाट बचाउन सक्छ र/वा एपोप्टोसिसलाई बढावा दिन सक्छ [46]। यद्यपि, हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल निष्क्रियतामा माइटोकोन्ड्रियल अनकप्लरको रूपमा IPA को भूमिका स्पष्ट गर्न थप अध्ययनहरू आवश्यक छ।
त्यसपछि हामीले जीवित LX-2 कोषहरूमा माइटोकोन्ड्रियल मोर्फोलजीमा माइटोकोन्ड्रियल श्वासप्रश्वासमा हुने परिवर्तनहरू प्रतिबिम्बित हुन्छन् कि हुँदैनन् भनेर अनुसन्धान गर्यौं। चाखलाग्दो कुरा के छ भने, TGF-β1 उपचारले माइटोकोन्ड्रियल अनुपातलाई गोलाकारबाट मध्यवर्तीमा परिवर्तन गर्छ, माइटोकोन्ड्रियल शाखामा कमी र DRP1 को अभिव्यक्ति बढ्छ, जुन माइटोकोन्ड्रियल विखंडनमा एक प्रमुख कारक हो [48]। यसबाहेक, माइटोकोन्ड्रियल विखंडन समग्र नेटवर्क जटिलतासँग सम्बन्धित छ, र फ्युजनबाट विखंडनमा संक्रमण हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल (HSC) सक्रियताको लागि महत्त्वपूर्ण छ, जबकि माइटोकोन्ड्रियल विखंडनको अवरोधले HSC एपोप्टोसिस [49] निम्त्याउँछ। यसरी, हाम्रो नतिजाहरूले संकेत गर्दछ कि TGF-β1 उपचारले कम शाखाको साथ माइटोकोन्ड्रियल नेटवर्क जटिलतामा कमी ल्याउन सक्छ, जुन सक्रिय हेमेटोपोएटिक स्टेम सेलहरू (HSCs) सँग सम्बन्धित माइटोकोन्ड्रियल विखंडनमा बढी सामान्य छ। यसबाहेक, हाम्रो डेटाले देखाएको छ कि IPA ले माइटोकोन्ड्रियलको अनुपातलाई गोलाकारबाट मध्यवर्ती आकारमा परिवर्तन गर्न सक्छ, जसले गर्दा OPA1 र MFN2 को अभिव्यक्ति घट्छ। अध्ययनहरूले देखाएको छ कि OPA1 को डाउनरेगुलेसनले माइटोकोन्ड्रियल झिल्ली क्षमतामा कमी ल्याउन सक्छ र सेल एपोप्टोसिस ट्रिगर गर्न सक्छ [50]। MFN2 लाई माइटोकोन्ड्रियल फ्युजन र एपोप्टोसिस [51] को मध्यस्थता गर्न जानिन्छ। प्राप्त परिणामहरूले सुझाव दिन्छ कि TGF-β1 र/वा IPA द्वारा LX-2 कोशिकाहरूको प्रेरणले माइटोकोन्ड्रियल आकार र आकार, साथै सक्रियता अवस्था र नेटवर्क जटिलतालाई परिमार्जन गर्दछ।
हाम्रो नतिजाले संकेत गर्छ कि TGFβ-1 र IPA को संयोजन उपचारले एपोप्टोसिस-बेवास्ता गर्ने कोशिकाहरूमा फाइब्रोसिस, एपोप्टोसिस र बाँच्न-सम्बन्धित जीनहरूको mRNA अभिव्यक्तिलाई नियमन गरेर mtDNA र कोशिका मोर्फोलॉजिकल प्यारामिटरहरूलाई कम गर्न सक्छ। वास्तवमा, IPA ले AKT1 को mRNA अभिव्यक्ति स्तर र COL1A2 र MMP2 जस्ता महत्त्वपूर्ण फाइब्रोसिस जीनहरूलाई घटायो, तर CASP8 को अभिव्यक्ति स्तर बढायो, जुन एपोप्टोसिससँग सम्बन्धित छ। हाम्रो नतिजाले देखायो कि IPA उपचार पछि, BAX अभिव्यक्ति घट्यो र TIMP1 परिवार उपयुनिटहरू, BCL-2 र NF-κB को mRNA अभिव्यक्ति बढ्यो, जसले सुझाव दिन्छ कि IPA ले एपोप्टोसिसबाट बच्ने हेमेटोपोएटिक स्टेम सेलहरू (HSCs) मा बाँच्नको संकेतहरूलाई उत्तेजित गर्न सक्छ। यी अणुहरूले सक्रिय हेमेटोपोएटिक स्टेम सेलहरूमा बाँच्नको लागि समर्थक संकेतहरूको रूपमा काम गर्न सक्छन्, जुन एन्टी-एपोप्टोटिक प्रोटीनहरू (जस्तै Bcl-2) को बढ्दो अभिव्यक्ति, प्रो-एपोप्टोटिक BAX को अभिव्यक्ति घटेको, र TIMP र NF-κB बीचको जटिल अन्तरक्रियासँग सम्बन्धित हुन सक्छ [5, 7]। IPA ले PXR मार्फत यसको प्रभाव पार्छ, र हामीले पत्ता लगायौं कि TGF-β1 र IPA सँगको संयोजन उपचारले PXR mRNA अभिव्यक्ति स्तर बढायो, जसले HSC सक्रियताको दमनलाई संकेत गर्दछ। सक्रिय PXR सिग्नलिंगले भिभो र इन भिट्रो दुवैमा HSC सक्रियतालाई रोक्न जानिन्छ [52, 53]। हाम्रा नतिजाहरूले संकेत गर्दछ कि IPA ले एपोप्टोसिसलाई बढावा दिएर, फाइब्रोसिस र माइटोकोन्ड्रियल मेटाबोलिज्म घटाएर, र बाँच्ने संकेतहरू बढाएर सक्रिय HSC को क्लियरेन्समा भाग लिन सक्छ, जुन विशिष्ट प्रक्रियाहरू हुन् जसले सक्रिय HSC फेनोटाइपलाई निष्क्रियमा रूपान्तरण गर्दछ। एपोप्टोसिसमा IPA को सम्भावित संयन्त्र र भूमिकाको लागि अर्को सम्भावित व्याख्या यो हो कि यसले मुख्यतया माइटोफेगी (आन्तरिक मार्ग) र बाह्य TNF संकेतन मार्ग (तालिका 1) मार्फत निष्क्रिय माइटोकोन्ड्रियालाई सफा गर्छ, जुन NF-κB अस्तित्व संकेतन मार्ग (पूरक चित्र 7) सँग प्रत्यक्ष रूपमा जोडिएको छ। चाखलाग्दो कुरा के छ भने, IPA-सम्बन्धित समृद्ध जीनहरूले एपोपोटिक मार्गमा प्रो-एपोप्टोटिक र प्रो-बाँच्ने संकेतहरू प्रेरित गर्न सक्षम छन् [54], जसले सुझाव दिन्छ कि IPA ले यी जीनहरूसँग अन्तरक्रिया गरेर एपोपोटिक मार्ग वा बाँच्न प्रेरित गर्न सक्छ। यद्यपि, HSC सक्रियताको समयमा IPA ले कसरी एपोप्टोसिस वा बाँच्न प्रेरित गर्छ र यसको यान्त्रिक मार्गहरू अस्पष्ट रहन्छन्।
IPA भनेको आन्द्राको माइक्रोबायोटा मार्फत आहार ट्रिप्टोफानबाट बनेको माइक्रोबियल मेटाबोलाइट हो। अध्ययनहरूले देखाएको छ कि यसमा आन्द्राको वातावरणमा एन्टी-इन्फ्लेमेटरी, एन्टिअक्सिडेन्ट र एपिजेनेटिक नियामक गुणहरू छन्।[55] अध्ययनहरूले देखाएको छ कि IPA ले आन्द्राको अवरोध कार्यलाई परिमार्जन गर्न सक्छ र अक्सिडेटिभ तनाव कम गर्न सक्छ, जसले यसको स्थानीय शारीरिक प्रभावहरूमा योगदान पुर्‍याउन सक्छ।[56] वास्तवमा, IPA लाई रक्तसञ्चार मार्फत लक्षित अंगहरूमा ढुवानी गरिन्छ, र IPA ले ट्रिप्टोफान, सेरोटोनिन र इन्डोल डेरिभेटिभहरूसँग समान प्रमुख मेटाबोलाइट संरचना साझा गरेको हुनाले, IPA ले प्रतिस्पर्धी मेटाबोलिक भाग्यहरूको परिणामस्वरूप मेटाबोलिक कार्यहरू गर्दछ।[52] IPA ले इन्जाइमहरू वा रिसेप्टरहरूमा बाइन्डिङ साइटहरूको लागि ट्रिप्टोफान-व्युत्पन्न मेटाबोलाइटहरूसँग प्रतिस्पर्धा गर्न सक्छ, सम्भावित रूपमा सामान्य मेटाबोलिक मार्गहरूमा बाधा पुर्‍याउँछ। यसले यसको चिकित्सीय विन्डोलाई राम्रोसँग बुझ्नको लागि यसको फार्माकोकाइनेटिक्स र फार्माकोडायनामिक्समा थप अध्ययनहरूको आवश्यकतालाई हाइलाइट गर्दछ।[57] यो हेमेटोपोएटिक स्टेम सेलहरू (HSCs) मा पनि हुन सक्छ कि भनेर हेर्न बाँकी छ।
हामी स्वीकार गर्छौं कि हाम्रो अध्ययनमा केही सीमितताहरू छन्। विशेष गरी IPA सँग सम्बन्धित सम्बन्धहरूको जाँच गर्न, हामीले टाइप २ मधुमेह मेलिटस (T2DM) भएका बिरामीहरूलाई बहिष्कार गर्यौं। हामी स्वीकार गर्छौं कि यसले टाइप २ मधुमेह मेलिटस र उन्नत कलेजो रोग भएका बिरामीहरूमा हाम्रो निष्कर्षहरूको व्यापक प्रयोज्यतालाई सीमित गर्दछ। यद्यपि मानव सीरममा IPA को शारीरिक सांद्रता १-१० μM [११, २०] छ, १ mM IPA को एकाग्रता उच्चतम गैर-विषाक्त सांद्रता [१५] र एपोप्टोसिसको उच्चतम दरको आधारमा छनोट गरिएको थियो, नेक्रोटिक कोशिका जनसंख्याको प्रतिशतमा कुनै भिन्नता नभएको। यद्यपि यस अध्ययनमा IPA को सुप्राफिजियोलोजिकल स्तरहरू प्रयोग गरिएको थियो, IPA को प्रभावकारी खुराकको बारेमा हाल कुनै सहमति छैन [५२]। यद्यपि हाम्रा नतिजाहरू महत्त्वपूर्ण छन्, IPA को फराकिलो मेटाबोलिक भाग्य अनुसन्धानको सक्रिय क्षेत्र बनेको छ। यसबाहेक, सीरम IPA स्तरहरू र कलेजो ट्रान्सक्रिप्टहरूको DNA मेथिलेसन बीचको सम्बन्धमा हाम्रा निष्कर्षहरू हेमेटोपोएटिक स्टेम सेलहरू (HSCs) बाट मात्र नभई कलेजोको तन्तुहरूबाट पनि प्राप्त गरिएको थियो। हामीले ट्रान्सक्रिप्टोम विश्लेषणबाट प्राप्त हाम्रो अघिल्लो निष्कर्षहरूको आधारमा मानव LX-2 कोशिकाहरू प्रयोग गर्ने छनौट गर्यौं जुन IPA हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल (HSC) सक्रियतासँग सम्बन्धित छ [15], र HSC हरू कलेजो फाइब्रोसिसको प्रगतिमा संलग्न प्रमुख कोशिकाहरू हुन्। कलेजो धेरै कोशिका प्रकारहरू मिलेर बनेको हुन्छ, त्यसैले अन्य कोशिका मोडेलहरू जस्तै हेपाटोसाइट-HSC-प्रतिरक्षा कोशिका सह-संस्कृति प्रणाली क्यास्पेस सक्रियता र DNA विखंडनका साथसाथै प्रोटीन स्तर सहित कार्यको संयन्त्रलाई IPA को भूमिका र अन्य कलेजो कोशिका प्रकारहरूसँग यसको अन्तरक्रियाको अध्ययन गर्न विचार गर्नुपर्छ।