यो लेख "रोगजनक र कीराहरू विरुद्ध गेडागुडीको प्रतिरोध क्षमता सुधार गर्ने" अनुसन्धान विषयको अंश हो, सबै ५ लेखहरू हेर्नुहोस्।
फंगल बिरुवा रोग नेक्रोसिस स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम (लिब.) डे ब्यारीको कारक एजेन्टले विभिन्न होस्ट बिरुवाहरूलाई संक्रमित गर्न बहु-स्तरीय रणनीति प्रयोग गर्दछ। यस अध्ययनले स्यूडोमोनास स्क्लेरोटिओरमको कारणले हुने सेतो ढुसीप्रति फेसोलस भल्गारिस एल. को आणविक, शारीरिक र जैव रासायनिक प्रतिक्रियाहरू बढाउन वैकल्पिक व्यवस्थापन रणनीतिको रूपमा डायमाइन एल-ओर्निथिनको प्रयोग प्रस्ताव गर्दछ। इन भिट्रो प्रयोगहरूले देखाए कि एल-ओर्निथिनले खुराक-निर्भर तरिकाले एस. पाइरेनोइडोसाको माइसेलियल वृद्धिलाई उल्लेखनीय रूपमा रोकेको थियो। यसबाहेक, यसले हरितगृह अवस्थाहरूमा सेतो ढुसीलाई उल्लेखनीय रूपमा कम गर्न सक्छ। यसबाहेक, एल-ओर्निथिनले उपचार गरिएका बिरुवाहरूको वृद्धिलाई उत्तेजित गर्‍यो, जसले संकेत गर्दछ कि एल-ओर्निथिनको परीक्षण गरिएको सांद्रता उपचार गरिएका बिरुवाहरूको लागि फाइटोटोक्सिक थिएन। यसको अतिरिक्त, L-ornithine ले गैर-enzymatic antioxidants (पूर्ण घुलनशील phenolics र flavonoids) र enzymatic antioxidants (catalase (CAT), peroxidase (POX), र polyphenol oxidase (PPO)) को अभिव्यक्ति बढायो, र तीन antioxidant-सम्बन्धित जीनहरू (PvCAT1, PvSOD, र PvGR) को अभिव्यक्ति बढायो। यसबाहेक, सिलिको विश्लेषणमा S. sclerotiorum जीनोममा पुटेटिभ oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) प्रोटीनको उपस्थिति प्रकट भयो, जुन कार्यात्मक विश्लेषण, संरक्षित डोमेनहरू, र टोपोलोजीको सन्दर्भमा Aspergillus fijiensis (AfOAH) र Penicillium sp. (PlOAH) को oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) प्रोटीनसँग धेरै मिल्दोजुल्दो थियो। चाखलाग्दो कुरा के छ भने, आलु डेक्सट्रोज ब्रोथ (PDB) माध्यममा L-ornithine थप्दा S. sclerotiorum mycelia मा SsOAH जीनको अभिव्यक्तिमा उल्लेखनीय कमी आयो। त्यस्तै गरी, उपचार गरिएका बिरुवाहरूबाट सङ्कलन गरिएको फंगल माइसेलियामा L-ornithine को बाह्य प्रयोगले SsOAH जीनको अभिव्यक्तिलाई उल्लेखनीय रूपमा कम गर्‍यो। अन्तमा, L-ornithine प्रयोगले PDB मध्यम र संक्रमित पातहरू दुवैमा अक्सालिक एसिड स्रावलाई उल्लेखनीय रूपमा कम गर्‍यो। निष्कर्षमा, L-ornithine ले रेडक्स स्थिति कायम राख्नुका साथै संक्रमित बिरुवाहरूको प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया बढाउनमा महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छ। यस अध्ययनको नतिजाले सेतो ढुसी नियन्त्रण गर्न र सिमी उत्पादन र अन्य बालीहरूमा यसको प्रभावलाई कम गर्न नवीन, वातावरणमैत्री विधिहरू विकास गर्न मद्दत गर्न सक्छ।
सेतो ढुसी, नेक्रोट्रोफिक फंगस स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम (लिब.) डे ब्यारीबाट हुने, एक विनाशकारी, उत्पादन घटाउने रोग हो जसले विश्वव्यापी सिमी (फेजोलस भल्गारिस एल.) उत्पादनको लागि गम्भीर खतरा निम्त्याउँछ (बोल्टन एट अल., २००६)। स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम माटोबाट हुने फंगल बिरुवा रोगजनकहरू मध्ये एक हो जसमा ६०० भन्दा बढी बिरुवा प्रजातिहरूको विस्तृत होस्ट दायरा र गैर-विशिष्ट तरिकाले होस्ट तन्तुहरूलाई द्रुत रूपमा म्यासेरेट गर्ने क्षमता हुन्छ (लियाङ र रोलिन्स, २०१८)। प्रतिकूल परिस्थितिहरूमा, यो आफ्नो जीवन चक्रको एक महत्वपूर्ण चरणबाट गुज्रन्छ, लामो समयसम्म माटोमा 'स्क्लेरोटिआ' भनिने कालो, कडा, बीउ जस्तो संरचनाको रूपमा वा संक्रमित बिरुवाहरूको माइसेलियम वा डाँठको पिथमा सेतो, फुल्ने वृद्धिको रूपमा निष्क्रिय रहन्छ (स्वार्ट्ज एट अल., २००५)। एस. स्क्लेरोटियोरम स्क्लेरोटिया बनाउन सक्षम छ, जसले गर्दा यो संक्रमित खेतहरूमा लामो समयसम्म बाँच्न सक्छ र रोगको समयमा पनि टिक्न सक्छ (श्वार्ट्ज एट अल।, २००५)। स्क्लेरोटिया पोषक तत्वहरूले भरिपूर्ण हुन्छ, लामो समयसम्म माटोमा रहन सक्छ, र पछिल्ला संक्रमणहरूको लागि प्राथमिक इनोकुलमको रूपमा काम गर्दछ (श्वार्ट्ज एट अल।, २००५)। अनुकूल परिस्थितिहरूमा, स्क्लेरोटिया अंकुरण हुन्छ र हावामा उड्ने बीजाणुहरू उत्पादन गर्दछ जसले बोटको माथिल्लो सबै भागहरूलाई संक्रमित गर्न सक्छ, जसमा फूल, डाँठ वा कोसाहरू समावेश छन् तर सीमित छैनन् (श्वार्ट्ज एट अल।, २००५)।
स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटियोरमले आफ्नो होस्ट बिरुवाहरूलाई संक्रमित गर्न बहु-स्तरीय रणनीति प्रयोग गर्दछ, जसमा स्क्लेरोटियल अंकुरणदेखि लक्षण विकाससम्मका समन्वित घटनाहरूको श्रृंखला समावेश हुन्छ। सुरुमा, एस. स्क्लेरोटियोरमले एपोथेसिया भनिने च्याउ जस्तो संरचनाबाट निलम्बित बीजाणुहरू (एस्कोस्पोर भनिन्छ) उत्पादन गर्दछ, जुन हावामा परिणत हुन्छ र संक्रमित बिरुवाको मलबेमा गैर-गतिशील स्क्लेरोटियामा विकसित हुन्छ (बोल्टन एट अल।, २००६)। त्यसपछि फंगसले बिरुवाको कोशिका भित्ताको pH नियन्त्रण गर्न, इन्जाइम्याटिक डिग्रेडेसन र टिस्यु आक्रमणलाई बढावा दिन (हेगेडस र रिमर, २००५) र होस्ट बिरुवाको अक्सिडेटिभ फटलाई दबाउन अक्सालिक एसिड, एक विषाणु कारक स्राव गर्छ। यो एसिडिफिकेशन प्रक्रियाले बिरुवाको कोशिका भित्तालाई कमजोर बनाउँछ, फंगल कोशिका भित्ता डिग्रेडिङ इन्जाइमहरू (CWDEs) को सामान्य र कुशल सञ्चालनको लागि अनुकूल वातावरण प्रदान गर्दछ, जसले रोगजनकलाई भौतिक अवरोध पार गर्न र होस्ट टिस्युहरूमा प्रवेश गर्न अनुमति दिन्छ (मार्सियानो एट अल।, १९८३)। एक पटक प्रवेश गरेपछि, S. sclerotiorum ले धेरै CWDEs स्रावित गर्दछ, जस्तै polygalacturonase र cellulase, जसले संक्रमित तन्तुहरूमा यसको प्रसारलाई सहज बनाउँछ र तन्तु नेक्रोसिस निम्त्याउँछ। घाउ र हाइफल म्याटहरूको प्रगतिले सेतो ढुसीका विशेषता लक्षणहरू निम्त्याउँछ (हेगेडस र रिमर, २००५)। यसैबीच, होस्ट बिरुवाहरूले ढाँचा पहिचान रिसेप्टरहरू (PRRs) मार्फत रोगजनक-सम्बद्ध आणविक ढाँचाहरू (PAMPs) पहिचान गर्छन्, जसले अन्ततः रक्षा प्रतिक्रियाहरू सक्रिय गर्ने संकेतात्मक घटनाहरूको श्रृंखला ट्रिगर गर्दछ।
दशकौंदेखि रोग नियन्त्रण प्रयासहरूको बावजुद, रोगजनकको प्रतिरोध, अस्तित्व र अनुकूलन क्षमताको कारणले गर्दा, अन्य व्यावसायिक बालीहरूमा जस्तै सिमीमा पनि पर्याप्त प्रतिरोधी जर्मप्लाज्मको अभाव रहेको छ। त्यसैले रोग व्यवस्थापन अत्यन्तै चुनौतीपूर्ण छ र यसलाई सांस्कृतिक अभ्यासहरू, जैविक नियन्त्रण, र रासायनिक फङ्गिसाइडहरूको संयोजन समावेश गर्ने एकीकृत, बहुआयामिक रणनीति आवश्यक छ (ओ'सुलिभान एट अल।, २०२१)। सेतो ढुसी नियन्त्रण सबैभन्दा प्रभावकारी छ किनभने फङ्गिसाइडहरू, सही समयमा र सही रूपमा प्रयोग गर्दा, प्रभावकारी रूपमा रोगको फैलावट नियन्त्रण गर्न, संक्रमणको गम्भीरता कम गर्न र उत्पादन क्षति कम गर्न सक्छ। यद्यपि, फङ्गिसाइडहरूमा अत्यधिक प्रयोग र अत्यधिक निर्भरताले एस. स्क्लेरोटियोरमको प्रतिरोधी स्ट्रेनहरूको उदय निम्त्याउन सक्छ र गैर-लक्षित जीवहरू, माटोको स्वास्थ्य र पानीको गुणस्तरमा नकारात्मक असर पार्न सक्छ (ले कोइन्टे एट अल।, २०१६; सेरेसिनी एट अल।, २०२४)। त्यसकारण, वातावरणमैत्री विकल्पहरू खोज्नु शीर्ष प्राथमिकता बनेको छ।
पोलिमाइनहरू (PAs), जस्तै पुट्रेसिन, स्पर्मिडाइन, स्पर्माइन, र क्याडाभेरिन, माटोबाट हुने बिरुवा रोगजनकहरू विरुद्ध आशाजनक विकल्पको रूपमा काम गर्न सक्छन्, जसले गर्दा खतरनाक रासायनिक फङ्गिसाइडहरूको प्रयोग पूर्ण वा आंशिक रूपमा कम हुन्छ (नेहेला एट अल।, २०२४; यी एट अल।, २०२४)। उच्च बिरुवाहरूमा, PAs धेरै शारीरिक प्रक्रियाहरूमा संलग्न हुन्छन् जसमा कोशिका विभाजन, भिन्नता, र अजैविक र जैविक तनावहरूको प्रतिक्रिया समावेश छ तर सीमित छैन (किलिनी र नेहेला, २०२०)। तिनीहरूले एन्टिअक्सिडेन्टको रूपमा काम गर्न सक्छन्, प्रतिक्रियाशील अक्सिजन प्रजातिहरू (ROS) लाई सफा गर्न मद्दत गर्छन्, रेडक्स होमियोस्टेसिस कायम राख्छन् (नेहेला र किलिनी, २०२३), प्रतिरक्षा-सम्बन्धित जीनहरू प्रेरित गर्छन् (रोमेरो एट अल।, २०१८), विभिन्न चयापचय मार्गहरू (नेहेला र किलिनी, २०२३), अन्तर्जात फाइटोहर्मोनहरू (नेहेला र किलिनी, २०१९), प्रणालीगत प्राप्त प्रतिरोध (SAR) स्थापना गर्छन्, र बिरुवा-रोगजनक अन्तरक्रियाहरू (नेहेला र किलिनी, २०२०; असिजा एट अल।, २०२२; सेरवोनिक, २०२२) लाई नियमन गर्छन्। यो ध्यान दिन लायक छ कि बिरुवा रक्षामा PAs को विशिष्ट संयन्त्र र भूमिकाहरू बिरुवा प्रजातिहरू, रोगजनकहरू, र वातावरणीय अवस्थाहरूमा निर्भर गर्दछ। बिरुवाहरूमा सबैभन्दा प्रचुर मात्रामा PA आवश्यक पोलिमाइन L-ornithine (किलिनी र नेहेला, २०२०) बाट जैव संश्लेषित हुन्छ।
एल-ओर्निथिनले बिरुवाको वृद्धि र विकासमा धेरै भूमिका खेल्छ। उदाहरणका लागि, अघिल्ला अध्ययनहरूले देखाएका छन् कि धानमा (ओरिजा सेटिभा), ओर्निथिन नाइट्रोजन रिसाइक्लिंग (लिउ एट अल।, २०१८), धानको उत्पादन, गुणस्तर र सुगन्ध (लु एट अल।, २०२०), र पानीको तनाव प्रतिक्रिया (याङ एट अल।, २०००) सँग सम्बन्धित हुन सक्छ। यसबाहेक, एल-ओर्निथिनको बाह्य प्रयोगले चिनी चुकन्दर (बिटा भल्गारिस) (हुसेन एट अल।, २०१९) मा खडेरी सहनशीलतालाई उल्लेखनीय रूपमा बढायो र प्याज (एलियम सेपा) (काभुसोउलु र काभुसोउलु, २०२१) र काजू (एनाकार्डियम ओक्सिडेन्टेल) बिरुवाहरूमा नुनको तनाव कम गर्‍यो (दा रोचा एट अल।, २०१२)। अजैविक तनाव प्रतिरक्षामा एल-ओर्निथिनको सम्भावित भूमिका उपचार गरिएका बिरुवाहरूमा प्रोलाइन संचयमा यसको संलग्नताको कारण हुन सक्छ। उदाहरणका लागि, प्रोलाइन मेटाबोलिज्मसँग सम्बन्धित जीनहरू, जस्तै ओर्निथिन डेल्टा एमिनोट्रान्सफेरेज (डेल्टा-ओएटी) र प्रोलाइन डिहाइड्रोजनेज (प्रोडीएच१ र प्रोडीएच२) जीनहरू, पहिले नै गैर-होस्ट स्यूडोमोनास सिरिन्गे स्ट्रेनहरू (सेन्थिल-कुमार र मैसूर, २०१२) विरुद्ध निकोटियाना बेन्थामियाना र एराबिडोप्सिस थालियानाको रक्षामा संलग्न भएको रिपोर्ट गरिएको छ। अर्कोतर्फ, रोगजनक वृद्धिको लागि फंगल ओर्निथिन डेकार्बोक्सिलेज (ओडीसी) आवश्यक छ (सिंह एट अल।, २०२०)। होस्ट-प्रेरित जीन साइलेन्सिङ (HIGS) मार्फत फ्युसारियम अक्सिस्पोरम एफ। एसपी। लाइकोपर्सिसीको ODC लाई लक्षित गर्नाले फ्युसारियम विल्ट (सिंह एट अल।, २०२०) को प्रतिरोधमा गोलभेडाको बोटबिरुवाको प्रतिरोधलाई उल्लेखनीय रूपमा बढायो। यद्यपि, फाइटोपैथोजेन्स जस्ता जैविक तनावहरू विरुद्ध एक्सोजेनस ओर्निथिन अनुप्रयोगको सम्भावित भूमिकाको राम्रोसँग अध्ययन गरिएको छैन। अझ महत्त्वपूर्ण कुरा, रोग प्रतिरोध क्षमतामा ओर्निथिनको प्रभाव र यससँग सम्बन्धित जैव रासायनिक र शारीरिक घटनाहरू धेरै हदसम्म अनपेक्षित छन्।
प्रभावकारी नियन्त्रण रणनीतिहरूको विकासको लागि गेडागुडीहरूमा S. sclerotiorum संक्रमणको जटिलता बुझ्नु महत्त्वपूर्ण छ। यस अध्ययनमा, हामीले स्क्लेरोटिनिया गेडागुडी संक्रमणको लागि गेडागुडी बिरुवाहरूको प्रतिरक्षा संयन्त्र र प्रतिरोध बढाउन डायमाइन L-ornithine को सम्भावित भूमिका पहिचान गर्ने लक्ष्य राखेका थियौं। हामी अनुमान गर्छौं कि, संक्रमित बिरुवाहरूको प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाहरू बढाउनुको साथै, L-ornithine ले रेडक्स स्थिति कायम राख्न पनि महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छ। हामी प्रस्ताव गर्छौं कि L-ornithine को सम्भावित प्रभावहरू इन्जाइम्याटिक र गैर-एन्जाइमेटिक एन्टिअक्सिडेन्ट प्रतिरक्षा संयन्त्रहरूको नियमन र फंगल रोगजनकता/भाइरुलेन्स कारकहरू र सम्बन्धित प्रोटीनहरूसँग हस्तक्षेपसँग सम्बन्धित छन्। L-ornithine को यो दोहोरो कार्यक्षमताले यसलाई सेतो ढुसीलाई कम गर्न र यस शक्तिशाली फंगल रोगजनकको लागि सामान्य गेडागुडी बालीहरूको प्रतिरोध बढाउन दिगो रणनीतिको लागि एक आशाजनक उम्मेदवार बनाउँछ। वर्तमान अध्ययनको नतिजाले सेतो ढुसीलाई नियन्त्रण गर्न र गेडागुडी उत्पादनमा यसको प्रभावलाई कम गर्न नवीन, वातावरणमैत्री विधिहरूको विकासमा मद्दत गर्न सक्छ।
यस अध्ययनमा, सामान्य बीनको एक संवेदनशील व्यावसायिक प्रजाति, गिजा ३ (फेजोलस भल्गारिस एल. सीभी. गिजा ३), प्रयोगात्मक सामग्रीको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो। स्वस्थ बीउहरू इजिप्टको क्षेत्र बाली अनुसन्धान संस्थान (FCRI), कृषि अनुसन्धान केन्द्र (ARC) ले दयालु रूपमा प्रदान गरेको थियो। पाँचवटा बीउहरू प्लास्टिकको भाँडामा (भित्री व्यास ३५ सेमी, गहिराइ ५० सेमी) S. स्क्लेरोटियोरम-संक्रमित माटोले भरिएको हरितगृह अवस्था (२५ ± २ डिग्री सेल्सियस, सापेक्षिक आर्द्रता ७५ ± १%, ८ घण्टा हल्का/१६ घण्टा अँध्यारो) रोपिएको थियो। रोपेको ७-१० दिनमा (DPS) बिरुवाहरूलाई पातलो पारिएको थियो जसले गर्दा प्रत्येक भाँडोमा एकरूप वृद्धि भएका दुईवटा बिरुवाहरू र तीनवटा पूर्ण रूपमा फैलिएका पातहरू मात्र बाँकी थिए। सबै गमलामा राखिएका बिरुवाहरूलाई प्रत्येक दुई हप्तामा एक पटक पानी हालिएको थियो र दिइएको जातको लागि सिफारिस गरिएको दरमा मासिक रूपमा मल हालिएको थियो।
L-ornithinediamine (जसलाई (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic acid; Sigma-Aldrich, Darmstadt, जर्मनी पनि भनिन्छ) को ५०० mg/L सांद्रता तयार गर्न, ५० mg पहिले १०० mL बाँझ आसुत पानीमा घोलिएको थियो। त्यसपछि स्टक घोललाई पातलो पारियो र पछिल्ला प्रयोगहरूमा प्रयोग गरियो। संक्षेपमा, L-ornithine सांद्रताको छ श्रृंखला (१२.५, २५, ५०, ७५, १००, र १२५ mg/L) इन भिट्रो परीक्षण गरिएको थियो। यसको अतिरिक्त, बाँझ आसुत पानीलाई नकारात्मक नियन्त्रण (मक) को रूपमा प्रयोग गरिएको थियो र व्यावसायिक फङ्गिसाइड "Rizolex-T" ५०% भिजेको पाउडर (टोक्लोफोस-मिथाइल २०% + थिराम ३०%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Egypt) लाई सकारात्मक नियन्त्रणको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो। व्यावसायिक ढुसीनाशक "Rizolex-T" लाई पाँच सांद्रता (२, ४, ६, ८ र १० मिलीग्राम/लिटर) मा इन भिट्रोमा परीक्षण गरिएको थियो।
सेतो ढुसीका विशिष्ट लक्षणहरू देखाउने सामान्य सिमीको डाँठ र कोसाका नमूनाहरू (प्रभाव दर: १०-३०%) व्यावसायिक फार्महरूबाट सङ्कलन गरिएको थियो। यद्यपि धेरैजसो संक्रमित बिरुवा सामग्रीहरू प्रजाति/प्रजाति (संवेदनशील व्यावसायिक विविधता गिजा ३) द्वारा पहिचान गरिएको थियो, अन्य, विशेष गरी स्थानीय बजारबाट प्राप्त गरिएका, अज्ञात प्रजातिका थिए। सङ्कलन गरिएका संक्रमित सामग्रीहरूलाई पहिले ३ मिनेटको लागि ०.५% सोडियम हाइपोक्लोराइट घोलले सतहमा कीटाणुरहित गरिएको थियो, त्यसपछि धेरै पटक बाँझ डिस्टिल्ड पानीले पखालिएको थियो र अतिरिक्त पानी हटाउन बाँझ फिल्टर पेपरले सुकाइएको थियो। त्यसपछि संक्रमित अंगहरूलाई बीचको तन्तु (स्वस्थ र संक्रमित तन्तुहरू बीच) बाट साना टुक्राहरूमा काटियो, आलु डेक्सट्रोज अगर (PDA) माध्यममा कल्चर गरियो र स्क्लेरोटिया गठनलाई उत्तेजित गर्न २५ ± २ डिग्री सेल्सियसमा १२ घण्टा प्रकाश/१२ घण्टा अँध्यारो चक्रको साथ ५ दिनको लागि इन्क्युबेट गरियो। मिश्रित वा दूषित कल्चरहरूबाट फंगल आइसोलेटहरू शुद्ध गर्न माइसेलियल टिप विधि पनि प्रयोग गरिएको थियो। शुद्ध फंगल आइसोलेट पहिले यसको सांस्कृतिक रूपात्मक विशेषताहरूको आधारमा पहिचान गरिएको थियो र त्यसपछि सूक्ष्म विशेषताहरूको आधारमा एस. स्क्लेरोटियोरम भएको पुष्टि गरिएको थियो। अन्तमा, सबै शुद्ध आइसोलेटहरूलाई कोचको धारणाहरू पूरा गर्न संवेदनशील सामान्य बीन खेती गिजा ३ मा रोगजनकताको लागि परीक्षण गरिएको थियो।
यसको अतिरिक्त, सबैभन्दा आक्रामक S. sclerotiorum isolate (isolate #3) लाई ह्वाइट एट अल., १९९०; Baturo-Ciesniewska एट अल., २०१७ द्वारा वर्णन गरिएको आन्तरिक ट्रान्सक्राइब्ड स्पेसर (ITS) अनुक्रमणको आधारमा थप पुष्टि गरिएको थियो। संक्षेपमा, आइसोलेटहरूलाई आलु डेक्सट्रोज ब्रोथ (PDB) मा कल्चर गरिएको थियो र २५ ± २ °C मा ५-७ दिनको लागि इन्क्युबेट गरिएको थियो। त्यसपछि फंगल माइसेलियम सङ्कलन गरिएको थियो, चीजक्लोथ मार्फत फिल्टर गरिएको थियो, बाँझ पानीले दुई पटक धोइएको थियो, र बाँझ फिल्टर पेपरले सुकाइएको थियो। Quick-DNA™ फंगल/ब्याक्टेरियल मिनिप्रेप किट (Kuramae-Izioka, १९९७; Atallah et al., २०२२, २०२४) प्रयोग गरेर जीनोमिक DNA लाई अलग गरिएको थियो। त्यसपछि ITS rDNA क्षेत्रलाई विशिष्ट प्राइमर जोडी ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; अपेक्षित आकार: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017) प्रयोग गरेर प्रवर्द्धन गरिएको थियो। शुद्ध PCR उत्पादनहरू अनुक्रमणको लागि पेश गरिएको थियो (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.)। ITS rDNA अनुक्रमहरू Sanger अनुक्रमण विधि प्रयोग गरेर द्विदिशात्मक रूपमा अनुक्रमित गरिएको थियो। त्यसपछि भेला गरिएका क्वेरी अनुक्रमहरूलाई BLASTn सफ्टवेयर प्रयोग गरेर GenBank र राष्ट्रिय जैव प्रौद्योगिकी सूचना केन्द्र (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) मा नवीनतम डेटासँग तुलना गरिएको थियो। क्वेरी अनुक्रमलाई आणविक विकासात्मक आनुवंशिकी विश्लेषण प्याकेज (MEGA-11; संस्करण 11) (कुमार एट अल., 2024) मा ClustalW प्रयोग गरेर NCBI GenBank (पूरक तालिका S1) मा नवीनतम डेटाबाट प्राप्त गरिएका २० अन्य S. sclerotiorum strains/isolates सँग तुलना गरिएको थियो। विकासवादी विश्लेषण अधिकतम सम्भावना विधि र सामान्य समय-उल्टाउन सकिने न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन मोडेल (नेई र कुमार, २०००) प्रयोग गरेर गरिएको थियो। उच्चतम लग-सम्भावना भएको रूख देखाइएको छ। छिमेकी-जोड्ने (एनजे) रूख (कुमार एट अल।, २०२४) र अधिकतम पार्सिमनी (एमपी) रूख बीचको उच्च लग-सम्भावना भएको रूख छनौट गरेर ह्युरिस्टिक खोजको लागि प्रारम्भिक रूख चयन गरिन्छ। एनजे रूख सामान्य समय-उल्टाउन सकिने मोडेल (नेई र कुमार, २०००) प्रयोग गरेर गणना गरिएको जोडीवार दूरी म्याट्रिक्स प्रयोग गरेर निर्माण गरिएको थियो।
एल-ओर्निथिन र ब्याक्टेरिसाइड "रिजोलेक्स-टी" को जीवाणुरोधी गतिविधि आगर प्रसार विधिद्वारा इन भिट्रोमा निर्धारण गरिएको थियो। विधि: एल-ओर्निथिनको स्टक घोल (५०० मिलीग्राम/लिटर) को उचित मात्रा लिनुहोस् र यसलाई क्रमशः १२.५, २५, ५०, ७५, १०० र १२५ मिलीग्राम/लिटरको अन्तिम सांद्रता भएको घोल तयार गर्न १० मिलीलीटर PDA पोषक तत्व माध्यमसँग राम्ररी मिसाउनुहोस्। नियन्त्रणको रूपमा "रिजोलेक्स-टी" को पाँच सांद्रता (२, ४, ६, ८ र १० मिलीग्राम/लिटर) र बाँझ डिस्टिल्ड पानी प्रयोग गरिएको थियो। माध्यम ठोस भएपछि, ४ मिमी व्यासको स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटियोरम कल्चरको ताजा तयार गरिएको माइसेलियल प्लगलाई पेट्री डिशको केन्द्रमा स्थानान्तरण गरियो र २५±२°C मा माइसेलियमले सम्पूर्ण नियन्त्रण पेट्री डिश ढाकिएसम्म कल्चर गरियो, त्यसपछि फंगल वृद्धि रेकर्ड गरियो। समीकरण १ प्रयोग गरेर S. sclerotiorum को रेडियल वृद्धिको प्रतिशत अवरोध गणना गर्नुहोस्:
प्रयोग दुई पटक दोहोर्याइएको थियो, प्रत्येक नियन्त्रण/प्रयोगात्मक समूहको लागि छ जैविक प्रतिकृतिहरू र प्रत्येक जैविक प्रतिकृतिको लागि पाँचवटा गमलाहरू (प्रति गमला दुई बिरुवाहरू) सहित। प्रयोगात्मक परिणामहरूको शुद्धता, विश्वसनीयता र पुनरुत्पादन क्षमता सुनिश्चित गर्न प्रत्येक जैविक प्रतिकृति दुई पटक (दुई प्राविधिक प्रतिकृतिहरू) विश्लेषण गरिएको थियो। थप रूपमा, आधा-अधिकतम निरोधात्मक सांद्रता (IC50) र IC99 (प्रेन्टिस, १९७६) गणना गर्न प्रोबिट रिग्रेसन विश्लेषण प्रयोग गरिएको थियो।
हरितगृह अवस्थामा एल-ओर्निथिनको सम्भाव्यता मूल्याङ्कन गर्न, लगातार दुईवटा गमला प्रयोगहरू गरियो। संक्षेपमा, गमलाहरूलाई बाँझ पारिएको माटो-बालुवा माटो (३:१) ले भरियो र S. sclerotiorum को ताजा तयार गरिएको कल्चरले खोप लगाइयो। पहिले, S. sclerotiorum (आइसोलेट #३) को सबैभन्दा आक्रामक आइसोलेटलाई एउटा स्क्लेरोटियमलाई आधा काटेर, PDA मा अनुहार तल राखेर र माइसेलियल वृद्धिलाई उत्तेजित गर्न ४ दिनको लागि निरन्तर अँध्यारो (२४ घण्टा) मा २५°C मा इन्क्युबेट गरेर कल्चर गरियो। त्यसपछि चारवटा ५ मिमी व्यासका अगर प्लगहरू अग्रणी किनारबाट लिइयो र १०० ग्राम गहुँ र चामलको चोकरको बाँझ मिश्रण (१:१, v/v) ले खोप लगाइयो र सबै फ्लास्कहरूलाई स्क्लेरोटिया गठनलाई उत्तेजित गर्न १२ घण्टा प्रकाश/१२ घण्टा अँध्यारो चक्र अन्तर्गत २५ ± २ °C मा ५ दिनको लागि इन्क्युबेट गरियो। माटो थप्नु अघि एकरूपता सुनिश्चित गर्न सबै फ्लास्कहरूको सामग्रीहरू राम्ररी मिसाइयो। त्यसपछि, रोगजनकहरूको निरन्तर सांद्रता सुनिश्चित गर्न प्रत्येक भाँडोमा १०० ग्राम कोलोनाइजिङ ब्रान मिश्रण थपियो। फंगल वृद्धि सक्रिय गर्न खोप लगाइएका भाँडोहरूलाई पानी हालियो र ७ दिनको लागि हरितगृह अवस्थामा राखियो।
त्यसपछि प्रत्येक गमलामा गिजा ३ जातका पाँचवटा बीउ रोपियो। एल-ओर्निथिन र फङ्गिसाइड रिजोलेक्स-टीले उपचार गरिएका गमलाहरूका लागि, जीवाणुमुक्त बीउहरूलाई पहिले दुई यौगिकहरूको जलीय घोलमा क्रमशः लगभग २५० मिलीग्राम/लिटर र ५० मिलीग्राम/लिटरको अन्तिम IC99 सांद्रता भएको दुई घण्टाको लागि भिजाइयो, र त्यसपछि रोप्नु अघि एक घण्टाको लागि हावामा सुकाइयो। अर्कोतर्फ, नकारात्मक नियन्त्रणको रूपमा बीउहरूलाई जीवाणुमुक्त आसुत पानीमा भिजाइयो। १० दिन पछि, पहिलो पानी हाल्नु अघि, बिरुवाहरूलाई पातलो पारियो, प्रत्येक गमलामा दुईवटा सफा बिरुवाहरू मात्र छोडियो। थप रूपमा, एस. स्क्लेरोटियोरमको संक्रमण सुनिश्चित गर्न, एउटै विकास चरण (१० दिन) मा सिमीको बोटको डाँठहरूलाई जीवाणुमुक्त स्केलपेल प्रयोग गरेर दुई फरक स्थानहरूमा काटियो र प्रत्येक घाउमा लगभग ०.५ ग्राम कोलोनाइजिङ ब्रान मिश्रण राखियो, त्यसपछि उच्च आर्द्रता सबै खोप लगाइएका बिरुवाहरूमा संक्रमण र रोगको विकासलाई उत्तेजित गर्न प्रयोग गरियो। नियन्त्रण बिरुवाहरूलाई पनि त्यस्तै गरी घाइते बनाइएको थियो र बराबर मात्रामा (०.५ ग्राम) बाँझ, उपनिवेश नभएको चोकर मिश्रण घाउमा राखिएको थियो र रोगको विकासको लागि वातावरण अनुकरण गर्न र उपचार समूहहरू बीच स्थिरता सुनिश्चित गर्न उच्च आर्द्रतामा राखिएको थियो।
उपचार विधि: सिमीका बिरुवाहरूलाई माटोमा सिँचाइ गरेर ५०० मिलीलीटर एल-ओर्निथिन (२५० मिलीग्राम/लिटर) वा फङ्गिसाइड रिजोलेक्स-टी (५० मिलीग्राम/लिटर) को जलीय घोलले पानी हालियो, त्यसपछि १० दिनको अन्तरालमा तीन पटक उपचार दोहोर्याइयो। प्लेसिबो-उपचार गरिएका नियन्त्रणहरूलाई ५०० मिलीलीटर बाँझ डिस्टिल्ड पानीले सिँचाइ गरियो। सबै उपचारहरू हरितगृह अवस्था (२५ ± २° सेल्सियस, ७५ ± १% सापेक्षिक आर्द्रता, र ८ घण्टा प्रकाश/१६ घण्टा अँध्यारोको फोटोपिरियड) अन्तर्गत गरिएको थियो। सबै गमलाहरूलाई पन्ध्र दिनमा पानी हालियो र मासिक रूपमा सन्तुलित NPK मल (२०-२०-२०, ३.६% सल्फर र TE सूक्ष्म तत्वहरू सहित; जैन सिड, इजिप्ट) ले ३-४ ग्राम/लिटरको सांद्रतामा विशेष जातको लागि सिफारिसहरू र निर्माताको निर्देशन अनुसार पातहरू छर्केर प्रशोधन गरियो। अन्यथा भनिएको बाहेक, पूर्ण रूपमा विस्तारित परिपक्व पातहरू (माथिबाट दोस्रो र तेस्रो पातहरू) प्रत्येक जैविक प्रतिकृतिबाट ७२ घण्टा पोस्ट-ट्रीटमेन्ट (hpt) मा सङ्कलन गरिएको थियो, एकरूप बनाइएको थियो, जम्मा गरिएको थियो र -८० डिग्री सेल्सियसमा भण्डारण गरिएको थियो जसमा थप विश्लेषणहरू समावेश छन्, जसमा अक्सिडेटिभ तनाव सूचकहरूको इन सिटु हिस्टोकेमिकल स्थानीयकरण, लिपिड पेरोक्सिडेशन, इन्जाइमेटिक र गैर-इन्जाइमेटिक एन्टिअक्सिडेन्टहरू र जीन अभिव्यक्ति समावेश छन् तर सीमित छैनन्।
टेरान एट अल (२००६) द्वारा परिमार्जित पेटजोल्ड्ट र डिक्सन स्केल (१९९६) को आधारमा १-९ (पूरक तालिका S2) को स्केल प्रयोग गरेर सेतो ढुसी संक्रमणको तीव्रता हप्तामा २१ दिनको टीकाकरण पछि (dpi) मूल्याङ्कन गरिएको थियो। संक्षेपमा, इन्टरनोड र नोडहरूमा घाउहरूको प्रगति पछ्याउन टीकाकरणको बिन्दुबाट सुरु गरेर बीन बिरुवाहरूको डाँठ र हाँगाहरूको जाँच गरिएको थियो। त्यसपछि टीकाकरणको बिन्दुबाट डाँठ वा हाँगासँगै सबैभन्दा टाढाको बिन्दुसम्म घाउको दूरी मापन गरिएको थियो र घाउको स्थानको आधारमा १-९ को स्कोर तोकिएको थियो, जहाँ (१) टीकाकरणको बिन्दु नजिक कुनै देखिने संक्रमण नभएको संकेत गरिएको थियो र (२-९) ले नोडहरू/इन्टर्नोडहरूसँगै घाउको आकार र प्रगतिमा क्रमिक वृद्धि भएको संकेत गरिएको थियो (पूरक तालिका S2)। त्यसपछि सेतो ढुसी संक्रमणको तीव्रता सूत्र २ प्रयोग गरेर प्रतिशतमा रूपान्तरण गरिएको थियो:
यसको अतिरिक्त, रोग प्रगति वक्र (AUDPC) अन्तर्गतको क्षेत्रफल सूत्र (Shaner and Finney, 1977) प्रयोग गरेर गणना गरिएको थियो, जुन हालै समीकरण ३ प्रयोग गरेर साधारण सिमीको सेतो कुहिएको (Chauhan et al., 2020) को लागि अनुकूलित गरिएको थियो:
जहाँ Yi = ti समयमा रोगको गम्भीरता, Yi+1 = अर्को समयमा रोगको गम्भीरता ti+1, ti = पहिलो मापनको समय (दिनहरूमा), ti+1 = अर्को मापनको समय (दिनहरूमा), n = समय बिन्दु वा अवलोकन बिन्दुहरूको कुल संख्या। सबै जैविक प्रतिकृतिहरूमा बिरुवाको उचाइ (सेमी), प्रति बिरुवा हाँगाहरूको संख्या, र प्रति बिरुवा पातहरूको संख्या सहित सिमी बिरुवाको वृद्धि प्यारामिटरहरू साप्ताहिक रूपमा २१ दिनको लागि रेकर्ड गरिएको थियो।
प्रत्येक जैविक प्रतिकृतिमा, उपचार पछि ४५ औं दिनमा (अन्तिम उपचार पछि १५ दिन) पातका नमूनाहरू (माथिबाट दोस्रो र तेस्रो पूर्ण रूपमा विकसित पातहरू) सङ्कलन गरिएको थियो। प्रत्येक जैविक प्रतिकृतिमा पाँचवटा भाँडाहरू (प्रति भाँडामा दुईवटा बिरुवाहरू) थिए। अँध्यारोमा ४ डिग्री सेल्सियसमा ८०% एसीटोन प्रयोग गरेर प्रकाशसंश्लेषक पिग्मेन्टहरू (क्लोरोफिल ए, क्लोरोफिल बी र क्यारोटिनोइडहरू) निकासीको लागि लगभग ५०० मिलीग्राम कुचिएको तन्तु प्रयोग गरिएको थियो। २४ घण्टा पछि, नमूनाहरूलाई सेन्ट्रीफ्यूज गरिएको थियो र तीन फरक तरंगदैर्ध्य (A470, A646 र A663 nm) मा अवशोषण मापन गरेर (Lichtenthaler, 1987) विधि अनुसार UV-160A स्पेक्ट्रोफोटोमिटर (Shimadzu Corporation, Japan) प्रयोग गरेर रंगीन रूपमा क्लोरोफिल ए, क्लोरोफिल बी र क्यारोटिनोइड सामग्रीहरूको निर्धारणको लागि सुपरनेटेन्ट सङ्कलन गरिएको थियो। अन्तमा, प्रकाशसंश्लेषक पिग्मेन्टहरूको सामग्री Lichtenthaler (1987) द्वारा वर्णन गरिएको निम्न सूत्रहरू ४-६ प्रयोग गरेर गणना गरिएको थियो।
७२ घण्टा पछि उपचार (hpt) मा, हाइड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2) र सुपरअक्साइड आयन (O2•−) को इन सिटु हिस्टोकेमिकल स्थानीयकरणको लागि प्रत्येक जैविक प्रतिकृतिबाट पातहरू (माथिबाट दोस्रो र तेस्रो पूर्ण रूपमा विकसित पातहरू) सङ्कलन गरियो। प्रत्येक जैविक प्रतिकृतिमा पाँचवटा भाँडाहरू (प्रति भाँडा दुई बिरुवाहरू) थिए। विधिको शुद्धता, विश्वसनीयता र पुनरुत्पादन क्षमता सुनिश्चित गर्न प्रत्येक जैविक प्रतिकृतिलाई डुप्लिकेट (दुई प्राविधिक प्रतिकृतिहरू) मा विश्लेषण गरिएको थियो। H2O2 र O2•− क्रमशः ०.१% ३,३′-डायमिनोबेन्जिडाइन (DAB; सिग्मा-एल्ड्रिच, डार्मस्ट्याड, जर्मनी) वा नाइट्रोब्लू टेट्राजोलियम (NBT; सिग्मा-एल्ड्रिच, डार्मस्ट्याड, जर्मनी) प्रयोग गरेर निर्धारण गरिएको थियो, रोमेरो-पुर्टास एट अल (२००४) र एडम एट अल (१९८९) द्वारा वर्णन गरिएका विधिहरू क्रमशः सामान्य परिमार्जनहरू सहित। H2O2 को हिस्टोकेमिकल स्थानीयकरणको लागि, पर्चाहरूलाई १० एमएम ट्रिस बफर (पीएच ७.८) मा ०.१% DAB सहित भ्याकुम घुसाइएको थियो र त्यसपछि कोठाको तापक्रममा प्रकाशमा ६० मिनेटको लागि इन्क्युबेट गरिएको थियो। पर्चाहरूलाई ४:१ (भा/भा) इथेनॉल:क्लोरोफर्म (अल-गोमहोरिया फार्मास्युटिकल्स एण्ड मेडिकल सप्लाईज, कायरो, इजिप्ट) मा ०.१५% (भा/भा) TCA मा ब्लीच गरिएको थियो र त्यसपछि अँध्यारो नभएसम्म प्रकाशमा राखिएको थियो। त्यसैगरी, भल्भहरूलाई १० एमएम पोटासियम फस्फेट बफर (पीएच ७.८) सहित भ्याकुम घुसाइएको थियो जसमा ०.१ w/भा % HBT रहेको थियो जसमा O2•− स्थितिमा हिस्टोकेमिकल स्थानीयकरण गरिएको थियो। पर्चाहरूलाई कोठाको तापक्रममा २० मिनेटको लागि प्रकाशमा इन्क्युबेट गरिएको थियो, त्यसपछि माथिको रूपमा ब्लीच गरिएको थियो, र त्यसपछि गाढा नीलो/बैजनी दागहरू देखा नपरेसम्म उज्यालो पारिएको थियो। परिणामस्वरूप खैरो (H2O2 सूचकको रूपमा) वा नीलो-बैजनी (O2•− सूचकको रूपमा) रंगको तीव्रता छवि प्रशोधन प्याकेज ImageJ (http://fiji.sc; पहुँच गरिएको ७ मार्च २०२४) को फिजी संस्करण प्रयोग गरेर मूल्याङ्कन गरिएको थियो।
मालोन्डियाल्डिहाइड (MDA; लिपिड पेरोक्सिडेशनको मार्करको रूपमा) थोरै परिमार्जनहरू सहित Du र Bramlage (१९९२) को विधि अनुसार निर्धारण गरिएको थियो। प्रत्येक जैविक प्रतिकृति (माथिबाट दोस्रो र तेस्रो पूर्ण रूपमा विकसित पातहरू) बाट पातहरू उपचार पछि ७२ घण्टा (hpt) सङ्कलन गरिएको थियो। प्रत्येक जैविक प्रतिकृतिमा पाँचवटा भाँडाहरू (प्रति भाँडामा दुईवटा बिरुवाहरू) समावेश थिए। विधिको शुद्धता, विश्वसनीयता र पुनरुत्पादन क्षमता सुनिश्चित गर्न प्रत्येक जैविक प्रतिकृतिलाई डुप्लिकेट (दुई प्राविधिक प्रतिकृतिहरू) मा विश्लेषण गरिएको थियो। संक्षेपमा, २०% ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड (TCA; मिलिपोरसिग्मा, बर्लिंगटन, MA, USA) सँग ०.०१% ब्यूटिलेटेड हाइड्रोक्सीटोल्युइन (BHT; सिग्मा-एल्ड्रिच, सेन्ट लुइस, MO, USA) भएको MDA निकासीको लागि ०.५ ग्राम जमिनको पातको तन्तु प्रयोग गरिएको थियो। त्यसपछि सुपरनेटेन्टमा रहेको MDA सामग्रीलाई UV-160A स्पेक्ट्रोफोटोमिटर (शिमाडजु कर्पोरेशन, जापान) प्रयोग गरेर ५३२ र ६०० nm मा अवशोषण मापन गरेर रंगमिति निर्धारण गरियो र त्यसपछि nmol g−1 FW को रूपमा व्यक्त गरियो।
गैर-एन्जाइमेटिक र एन्जाइमेटिक एन्टिअक्सिडेन्टहरूको मूल्याङ्कनको लागि, उपचार पछि ७२ घण्टा (hpt) मा प्रत्येक जैविक प्रतिकृतिबाट पातहरू (माथिबाट दोस्रो र तेस्रो पूर्ण रूपमा विकसित पातहरू) सङ्कलन गरिएको थियो। प्रत्येक जैविक प्रतिकृतिमा पाँचवटा भाँडाहरू (प्रति भाँडा दुईवटा बिरुवाहरू) थिए। प्रत्येक जैविक नमूनालाई डुप्लिकेटमा विश्लेषण गरिएको थियो (दुई प्राविधिक नमूनाहरू)। दुई पातहरूलाई तरल नाइट्रोजनले पिसेर इन्जाइमेटिक र गैर-एन्जाइमेटिक एन्टिअक्सिडेन्टहरू, कुल एमिनो एसिडहरू, प्रोलाइन सामग्री, जीन अभिव्यक्ति, र अक्सालेट परिमाण निर्धारणको लागि प्रत्यक्ष रूपमा प्रयोग गरिएको थियो।
काहकोनेन एट अल (१९९९) द्वारा वर्णन गरिएको विधिमा थोरै परिमार्जनहरू सहित फोलिन-सियोकाल्टेउ अभिकर्मक (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेन्ट लुइस, MO, संयुक्त राज्य अमेरिका) प्रयोग गरेर कुल घुलनशील फेनोलिक्स निर्धारण गरिएको थियो। संक्षेपमा, लगभग ०.१ ग्राम समरूप पातको तन्तु २० मिली ८०% मेथानोलको साथ २४ घण्टाको लागि अँध्यारोमा निकालिएको थियो र सेन्ट्रीफ्यूगेशन पछि सुपरनेटेन्ट सङ्कलन गरिएको थियो। नमूना अर्कको ०.१ मिलीलीटरलाई ०.५ मिलीलीटर फोलिन-सियोकाल्टेउ अभिकर्मक (१०%) सँग मिसाइएको थियो, ३० सेकेन्डको लागि हल्लाइयो र ५ मिनेटको लागि अँध्यारोमा छोडियो। त्यसपछि प्रत्येक ट्यूबमा ०.५ मिलीलीटर २०% सोडियम कार्बोनेट घोल (Na2CO3; अल-गोमहोरिया फार्मास्युटिकल्स एण्ड मेडिकल सप्लाईज कम्पनी, कायरो, इजिप्ट) थपिएको थियो, राम्ररी मिसाइएको थियो र अँध्यारोमा कोठाको तापक्रममा १ घण्टाको लागि इन्क्युबेट गरिएको थियो। इन्क्युबेशन पछि, प्रतिक्रिया मिश्रणको अवशोषण UV-160A स्पेक्ट्रोफोटोमिटर (शिमाडजु कर्पोरेशन, जापान) प्रयोग गरेर ७६५ nm मा मापन गरिएको थियो। नमूना अर्कहरूमा कुल घुलनशील फिनोलहरूको सांद्रता ग्यालिक एसिड क्यालिब्रेसन कर्भ (फिशर साइन्टिफिक, ह्याम्पटन, NH, संयुक्त राज्य अमेरिका) प्रयोग गरेर निर्धारण गरिएको थियो र प्रति ग्राम ताजा तौल (mg GAE g-1 ताजा तौल) मिलिग्राम ग्यालिक एसिड बराबरको रूपमा व्यक्त गरिएको थियो।
कुल घुलनशील फ्लेभोनोइडको मात्रा थोरै परिमार्जनसहित Djeridane et al. (2006) को विधि अनुसार निर्धारण गरिएको थियो। छोटकरीमा, माथिको मिथानोल अर्कको ०.३ मिलीलीटर ५% एल्युमिनियम क्लोराइड घोल (AlCl3; फिशर साइन्टिफिक, ह्याम्प्टन, NH, USA) सँग मिसाइएको थियो, जोडदार रूपमा हलचल गरिएको थियो र त्यसपछि कोठाको तापक्रममा ५ मिनेटको लागि इन्क्युबेट गरिएको थियो, त्यसपछि १०% पोटासियम एसीटेट घोल (अल-गोमहोरिया फार्मास्युटिकल्स एण्ड मेडिकल सप्लाईज, कायरो, इजिप्ट) को ०.३ मिलीलीटर थपिएको थियो, राम्ररी मिसाइएको थियो र अँध्यारोमा ३० मिनेटको लागि कोठाको तापक्रममा इन्क्युबेट गरिएको थियो। इन्क्युबेशन पछि, प्रतिक्रिया मिश्रणको अवशोषण UV-160A स्पेक्ट्रोफोटोमिटर (शिमाडजु कर्पोरेशन, जापान) प्रयोग गरेर ४३० nm मा मापन गरिएको थियो। नमूना अर्कमा कुल घुलनशील फ्लेभोनोइडको सांद्रता रुटिन क्यालिब्रेसन कर्भ (TCI अमेरिका, पोर्टल्याण्ड, OR, USA) प्रयोग गरेर निर्धारण गरिएको थियो र त्यसपछि प्रति ग्राम ताजा तौल (mg RE g-1 ताजा तौल) मिलिग्राम रुटिन बराबरको रूपमा व्यक्त गरिएको थियो।
योकोयामा र हिरामात्सु (२००३) द्वारा प्रस्तावित र सन एट अल द्वारा परिमार्जित विधिको आधारमा सिमीको पातहरूको कुल मुक्त एमिनो एसिड सामग्री परिमार्जित निनहाइड्रिन अभिकर्मक (थर्मो साइन्टिफिक केमिकल्स, वाल्थम, एमए, संयुक्त राज्य अमेरिका) प्रयोग गरेर निर्धारण गरिएको थियो। संक्षेपमा, ०.१ ग्राम जमिनको तन्तु pH ५.४ बफरको साथ निकालिएको थियो, र २०० μL सुपरनेटेन्टलाई २०० μL निनहाइड्रिन (२%) र २०० μL पाइरिडिन (१०%; स्पेक्ट्रम केमिकल, न्यू ब्रन्सविक, NJ, संयुक्त राज्य अमेरिका) सँग प्रतिक्रिया गरिएको थियो, उम्लिरहेको पानीको नुहाउने ठाउँमा ३० मिनेटको लागि इन्क्युबेट गरिएको थियो, त्यसपछि UV-१६०A स्पेक्ट्रोफोटोमिटर (शिमाडजु कर्पोरेशन, जापान) प्रयोग गरेर ५८० nm मा चिसो पारिएको थियो र मापन गरिएको थियो। अर्कोतर्फ, बेट्स विधि (बेट्स एट अल।, १९७३) द्वारा प्रोलाइन निर्धारण गरिएको थियो। प्रोलाइनलाई ३% सल्फोसालिसिलिक एसिड (थर्मो साइन्टिफिक केमिकल्स, वाल्थम, एमए, संयुक्त राज्य अमेरिका) बाट निकालिएको थियो र सेन्ट्रीफ्यूगेशन पछि, ०.५ मिलीलीटर सुपरनेटेन्टलाई १ मिलीलीटर ग्लेशियल एसिटिक एसिड (फिशर साइन्टिफिक, ह्याम्प्टन, NH, संयुक्त राज्य अमेरिका) र निनहाइड्रिन अभिकर्मकसँग मिसाइएको थियो, ९० डिग्री सेल्सियसमा ४५ मिनेटको लागि इन्क्युबेट गरिएको थियो, माथिको जस्तै स्पेक्ट्रोफोटोमिटर प्रयोग गरेर ५२० एनएममा चिसो पारिएको थियो र मापन गरिएको थियो। पातको अर्कमा कुल मुक्त एमिनो एसिड र प्रोलाइन क्रमशः ग्लाइसिन र प्रोलाइन क्यालिब्रेसन कर्भहरू (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेन्ट लुइस, MO, संयुक्त राज्य अमेरिका) प्रयोग गरेर निर्धारण गरिएको थियो, र mg/g ताजा वजनको रूपमा व्यक्त गरिएको थियो।
एन्टिअक्सिडेन्ट इन्जाइमहरूको इन्जाइम्याटिक गतिविधि निर्धारण गर्न, १ एमएम EDTA-Na2 (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेन्ट लुइस, MO, संयुक्त राज्य अमेरिका) र ७.५% पोलिभिनिलपाइरोलिडोन (PVP; सिग्मा-एल्ड्रिच, सेन्ट लुइस, MO, संयुक्त राज्य अमेरिका) भएको ३ मिली ५० एमएम ट्रिस बफर (pH ७.८) को साथ लगभग ५०० मिलीग्राम समरूप तन्तु निकालिएको थियो, प्रशीतन (४ डिग्री सेल्सियस) अन्तर्गत २० मिनेटको लागि १०,००० × g मा सेन्ट्रीफ्यूज गरिएको थियो, र सुपरनेटेन्ट (कच्चा इन्जाइम एक्स्ट्र्याक्ट) सङ्कलन गरिएको थियो (एल-नागर एट अल।, २०२३; ओस्मान एट अल।, २०२३)। त्यसपछि Catalase (CAT) लाई २ मिली ०.१ M सोडियम फस्फेट बफर (pH ६.५; सिग्मा-एल्ड्रिच, सेन्ट लुइस, MO, USA) र १०० μl २६९ mM H2O2 घोलले प्रतिक्रिया गरी Aebi (१९८४) को विधि अनुसार थोरै परिमार्जन सहित यसको इन्जाइम्याटिक गतिविधि निर्धारण गरियो (El-Nagar et al., २०२३; Osman et al., २०२३)। Guaiacol-dependent peroxidase (POX) इन्जाइम्याटिक गतिविधि Harrach et al. (२००९) को विधि प्रयोग गरेर निर्धारण गरिएको थियो। (२००८) मामूली परिमार्जनहरू सहित (एल-नागर एट अल।, २०२३; ओस्मान एट अल।, २०२३) र पोलिफेनोल अक्सिडेज (पीपीओ) को इन्जाइम्याटिक गतिविधि १०० एमएम सोडियम फस्फेट बफर (पीएच ६.०) को २.२ एमएल, ग्वायाकोलको १०० μl (टीसीआई रसायन, पोर्टल्याण्ड, ओरेगन, संयुक्त राज्य अमेरिका) र १२ एमएम H2O2 को १०० μl सँग प्रतिक्रिया पछि निर्धारण गरिएको थियो। विधिलाई (एल-नागर एट अल।, २०२३; ओस्मान एट अल।, २०२३) बाट थोरै परिमार्जन गरिएको थियो। ०.१ एम फस्फेट बफर (पीएच ६.०) मा ताजा रूपमा तयार पारिएको ३ एमएल क्याटेकोल घोल (थर्मो साइन्टिफिक केमिकल्स, वाल्थम, एमए, संयुक्त राज्य अमेरिका) (०.०१ एम) सँग प्रतिक्रिया पछि परीक्षण गरिएको थियो। २४० एनएम (A240) मा H2O2 को विघटनको निगरानी गरेर CAT गतिविधि मापन गरिएको थियो, ४३६ एनएम (A436) मा अवशोषणमा वृद्धिको निगरानी गरेर POX गतिविधि मापन गरिएको थियो, र PPO गतिविधि UV-160A स्पेक्ट्रोफोटोमिटर (शिमाडजु, जापान) प्रयोग गरेर ३ मिनेटको लागि प्रत्येक ३० सेकेन्डमा ४९५ एनएम (A495) मा अवशोषण उतारचढाव रेकर्ड गरेर मापन गरिएको थियो।
अन्तिम उपचार पछि ७२ घण्टामा सिमीको पात (माथिबाट दोस्रो र तेस्रो पूर्ण रूपमा विकसित पातहरू) मा पेरोक्सिसोमल क्याटालेज (PvCAT1; GenBank एक्सेसन नम्बर KF033307.1), सुपरअक्साइड डिसम्युटेज (PvSOD; GenBank एक्सेसन नम्बर XM_068639556.1), र ग्लुटाथियोन रिडक्टेज (PvGR; GenBank एक्सेसन नम्बर KY195009.1) सहित तीन एन्टिअक्सिडेन्ट-सम्बन्धित जीनहरूको ट्रान्सक्रिप्ट स्तर पत्ता लगाउन वास्तविक-समय RT-PCR प्रयोग गरिएको थियो। संक्षेपमा, निर्माताको प्रोटोकल अनुसार सिम्पली P टोटल आरएनए एक्स्ट्र्याक्शन किट (क्याट. नम्बर BSC52S1; बायोफ्लक्स, बायोरी टेक्नोलोजी, चीन) प्रयोग गरेर RNA लाई अलग गरिएको थियो। त्यसपछि, निर्माताको निर्देशन अनुसार TOP स्क्रिप्ट™ cDNA संश्लेषण किट प्रयोग गरेर cDNA संश्लेषित गरिएको थियो। माथिका तीन जीनहरूको प्राइमर अनुक्रमहरू पूरक तालिका S3 मा सूचीबद्ध छन्। PvActin-3 (GenBank एक्सेसन नम्बर: XM_068616709.1) लाई हाउसकीपिङ जीनको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो र सापेक्षिक जीन अभिव्यक्ति 2-ΔΔCT विधि (Livak and Schmittgen, 2001) प्रयोग गरेर गणना गरिएको थियो। जैविक तनाव (सामान्य फलफूल र एन्थ्राकनोज फंगस कोलेटोट्रिचम लिन्डेमुथियानम बीच असंगत अन्तरक्रिया) र अजैविक तनाव (खडेरी, लवणता, कम तापक्रम) अन्तर्गत एक्टिन स्थिरता प्रदर्शन गरिएको थियो (बोर्जेस एट अल।, २०१२)।
हामीले सुरुमा प्रोटिन-प्रोटीन BLAST उपकरण (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005) प्रयोग गरेर S. sclerotiorum मा oxaloacetate acetylhydrolase (OAH) प्रोटीनहरूको सिलिकोमा जीनोम-वाइड विश्लेषण गर्यौं। संक्षेपमा, हामीले S. sclerotiorum (taxide: 5180) मा होमोलोगस प्रोटीन नक्सा गर्न क्वेरी अनुक्रमको रूपमा Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; GenBank एक्सेसियन नम्बर XP_040799428.1; 342 एमिनो एसिड) र Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; GenBank एक्सेसियन नम्बर XP_056833920.1; 316 एमिनो एसिड) बाट OAH प्रयोग गर्यौं। BLASTp राष्ट्रिय जैव प्रौद्योगिकी सूचना केन्द्र (NCBI) को वेबसाइट, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ मा GenBank मा हालसालै उपलब्ध S. sclerotiorum जीनोम डेटा विरुद्ध गरिएको थियो।
यसको अतिरिक्त, S. sclerotiorum (SsOAH) बाट अनुमानित OAH जीन र A. fijiensis CBS 313.89 बाट AfOAH को विकासवादी विश्लेषण र फाइलोजेनेटिक रूख र P. lagena बाट PlOAH लाई MEGA11 (Tamura et al., 2021) र JTT म्याट्रिक्स-आधारित मोडेल (जोन्स et al., 1992) मा अधिकतम सम्भावना विधि प्रयोग गरेर अनुमान गरिएको थियो। फाइलोजेनेटिक रूखलाई S. sclerotiorum बाट सबै अनुमानित OAH जीन (SsOAH) को प्रोटीन अनुक्रमहरूको बहु संरेखण विश्लेषण र अवरोध-आधारित संरेखण उपकरण (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos र Agarwala, 2007) प्रयोग गरेर क्वेरी अनुक्रमसँग जोडिएको थियो। यसको अतिरिक्त, S. sclerotiorum बाट SsOAH को सबैभन्दा राम्रो मिल्दो एमिनो एसिड अनुक्रमहरू ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) प्रयोग गरेर क्वेरी अनुक्रमहरू (AfOAH र PlOAH) (Larkin et al., 2007) सँग पङ्क्तिबद्ध गरिएको थियो, र पङ्क्तिबद्धतामा संरक्षित क्षेत्रहरू ESPript उपकरण (संस्करण 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) प्रयोग गरेर दृश्यात्मक गरिएको थियो।
यसबाहेक, S. sclerotiorum SsOAH को भविष्यवाणी गरिएको कार्यात्मक प्रतिनिधि डोमेनहरू र संरक्षित साइटहरूलाई InterPro उपकरण (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021) प्रयोग गरेर विभिन्न परिवारहरूमा अन्तरक्रियात्मक रूपमा वर्गीकृत गरिएको थियो। अन्तमा, प्रोटीन होमोलजी/एनालॉजी पहिचान इन्जिन (Phyre2 सर्भर संस्करण 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) प्रयोग गरेर भविष्यवाणी गरिएको S. sclerotiorum SsOAH को त्रि-आयामी (3D) संरचना मोडेलिङ प्रदर्शन गरिएको थियो र SWISS-MODEL सर्भर (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014) प्रयोग गरेर प्रमाणित गरिएको थियो। अनुमानित त्रि-आयामिक संरचनाहरू (PDB ढाँचा) लाई UCSF-Chimera प्याकेज (संस्करण १.१५; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., २००४) प्रयोग गरेर अन्तरक्रियात्मक रूपमा दृश्यावलोकन गरिएको थियो।
स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरमको माइसेलियामा अक्सालोएसीटेट एसिटाइलहाइड्रोलेज (SsOAH; GenBank एक्सेसन नम्बर: XM_001590428.1) को ट्रान्सक्रिप्शनल स्तर निर्धारण गर्न मात्रात्मक वास्तविक-समय फ्लोरोसेन्स PCR प्रयोग गरिएको थियो। छोटकरीमा, S. स्क्लेरोटिओरमलाई PDB भएको फ्लास्कमा खोप लगाइएको थियो र हल्लाउने इन्क्यूबेटर (मोडेल: I2400, न्यू ब्रन्सविक साइन्टिफिक कम्पनी, एडिसन, NJ, USA) मा २५ ± २ °C मा २४ घण्टाको लागि १५० rpm मा र निरन्तर अँध्यारोमा (२४ घण्टा) मा माइसेलियल वृद्धिलाई उत्तेजित गर्न राखिएको थियो। त्यसपछि, कोषहरूलाई अन्तिम IC50 सांद्रतामा (क्रमशः लगभग ४० र ३.२ mg/L) L-ornithine र फङ्गिसाइड Rizolex-T ले उपचार गरियो र त्यसपछि उही अवस्थामा अर्को २४ घण्टाको लागि कल्चर गरियो। इन्क्युबेशन पछि, कल्चरहरूलाई ५ मिनेटको लागि २५०० आरपीएममा सेन्ट्रीफ्यूज गरियो र जीन अभिव्यक्ति विश्लेषणको लागि सुपरनेटेन्ट (फंगल माइसेलियम) सङ्कलन गरियो। त्यसैगरी, संक्रमित तन्तुहरूको सतहमा सेतो ढुसी र कपासको माइसेलियम बनेको संक्रमित बिरुवाहरूबाट संक्रमण पछि ०, २४, ४८, ७२, ९६ र १२० घण्टामा फंगल माइसेलियम सङ्कलन गरियो। फंगल माइसेलियमबाट आरएनए निकालियो र त्यसपछि माथि वर्णन गरिए अनुसार cDNA संश्लेषित गरियो। SsOAH को लागि प्राइमर अनुक्रमहरू पूरक तालिका S3 मा सूचीबद्ध छन्। SsActin (GenBank एक्सेसन नम्बर: XM_001589919.1) लाई हाउसकीपिङ जीनको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो, र सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति २-ΔΔΔCT विधि (Livak र Schmittgen, २००१) प्रयोग गरेर गणना गरिएको थियो।
आलुको डेक्सट्रोज ब्रोथ (PDB) र फंगल रोगजनक स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम भएको बिरुवाको नमूनामा अक्सालिक एसिड निर्धारण गरिएको थियो जसमा जु र झाङ (२०००) को विधि अनुसार थोरै परिमार्जन गरिएको थियो। संक्षेपमा, S. स्क्लेरोटिओरम आइसोलेटहरूलाई PDB भएको फ्लास्कमा खोप लगाइयो र त्यसपछि हल्लाउने इन्क्यूबेटर (मोडेल I2400, न्यू ब्रन्सविक साइन्टिफिक कम्पनी, एडिसन, NJ, USA) मा १५० rpm मा २५ ± २ °C मा ३-५ दिनको लागि निरन्तर अँध्यारोमा (२४ घण्टा) मा माइसेलियल वृद्धिलाई उत्तेजित गर्न कल्चर गरियो। इन्क्युबेशन पछि, फंगल कल्चरलाई पहिले व्हाटम्यान #१ फिल्टर पेपर मार्फत फिल्टर गरिएको थियो र त्यसपछि अवशिष्ट माइसेलियम हटाउन ५ मिनेटको लागि २५०० rpm मा सेन्ट्रीफ्यूज गरिएको थियो। अक्सालेटको थप मात्रात्मक निर्धारणको लागि सुपरनेटेन्ट ४°C मा सङ्कलन र भण्डारण गरिएको थियो। बिरुवाको नमूना तयार गर्न, लगभग ०.१ ग्राम बिरुवाको तन्तुका टुक्राहरू डिस्टिल्ड पानी (प्रत्येक पटक २ मिली) सँग तीन पटक निकालिएको थियो। त्यसपछि नमूनाहरूलाई २५०० आरपीएममा ५ मिनेटको लागि सेन्ट्रीफ्यूज गरियो, सुपरनेटेन्टलाई व्हाटम्यान नम्बर १ फिल्टर पेपर मार्फत सुख्खा फिल्टर गरियो र थप विश्लेषणको लागि सङ्कलन गरियो।
अक्सालिक एसिडको मात्रात्मक विश्लेषणको लागि, प्रतिक्रिया मिश्रणलाई गिलास स्टपर गरिएको ट्यूबमा निम्न क्रममा तयार गरिएको थियो: ०.२ मिलीलीटर नमूना (वा PDB कल्चर फिल्टरेट वा अक्सालिक एसिड मानक घोल), ०.११ मिलीलीटर ब्रोमोफेनोल ब्लू (BPB, १ mM; फिशर केमिकल, पिट्सबर्ग, PA, USA), ०.१९८ मिलीलीटर १ M सल्फ्यूरिक एसिड (H2SO4; अल-गोमहोरिया फार्मास्युटिकल्स एण्ड मेडिकल सप्लाईज, कायरो, इजिप्ट) र ०.१७६ मिलीलीटर १०० mM पोटासियम डाइक्रोमेट (K2Cr2O7; TCI केमिकल्स, पोर्टल्याण्ड, OR, USA), र त्यसपछि घोललाई डिस्टिल्ड पानीसँग ४.८ मिलीलीटरमा पातलो पारिएको थियो, जोडदार रूपमा मिसाइएको थियो र तुरुन्तै ६० डिग्री सेल्सियस पानीको नुहाउने ठाउँमा राखिएको थियो। १० मिनेट पछि, ०.५ मिलीलीटर सोडियम हाइड्रोक्साइड घोल (NaOH; ०.७५ M) थपेर प्रतिक्रिया रोकिएको थियो। प्रतिक्रिया मिश्रणको अवशोषण (A600) UV-160 स्पेक्ट्रोफोटोमिटर (शिमाडजु कर्पोरेशन, जापान) प्रयोग गरेर 600 nm मा मापन गरिएको थियो। कल्चर फिल्टरेट र बिरुवाको नमूनाको परिमाण निर्धारणको लागि क्रमशः PDB र आसुत पानी प्रयोग गरिएको थियो। कल्चर फिल्टरेटमा अक्सालिक एसिड सांद्रता, PDB माध्यम (μg.mL−1) को प्रति मिलिलिटर माइक्रोग्राम अक्सालिक एसिडको रूपमा व्यक्त गरिएको, र पातको अर्कमा, प्रति ग्राम ताजा तौल (μg.g−1 FW) को माइक्रोग्राम अक्सालिक एसिडको रूपमा व्यक्त गरिएको, अक्सालिक एसिड क्यालिब्रेसन कर्भ (थर्मो फिशर साइन्टिफिक केमिकल्स, वाल्थम, एमए, संयुक्त राज्य अमेरिका) प्रयोग गरेर निर्धारण गरिएको थियो।
अध्ययनभरि, सबै प्रयोगहरू पूर्ण रूपमा अनियमित डिजाइन (CRD) मा डिजाइन गरिएको थियो जसमा प्रति उपचार छ जैविक प्रतिकृतिहरू र प्रति जैविक प्रतिकृति पाँच गमलाहरू (प्रति गमला दुई बिरुवाहरू) समावेश थिए जबसम्म अन्यथा भनिएको थिएन। जैविक प्रतिकृतिहरू डुप्लिकेट (दुई प्राविधिक प्रतिकृतिहरू) मा विश्लेषण गरिएको थियो। प्राविधिक प्रतिकृतिहरू एउटै प्रयोगको पुनरुत्पादन क्षमता जाँच गर्न प्रयोग गरिएको थियो तर नक्कली प्रतिकृतिहरूबाट बच्न तथ्याङ्कीय विश्लेषणमा प्रयोग गरिएको थिएन। डेटालाई भिन्नताको विश्लेषण (ANOVA) प्रयोग गरेर तथ्याङ्कीय रूपमा विश्लेषण गरिएको थियो र त्यसपछि टुके-क्रामरले इमानदारीपूर्वक महत्त्वपूर्ण भिन्नता (HSD) परीक्षण (p ≤ 0.05) गरे। इन भिट्रो प्रयोगहरूको लागि, IC50 र IC99 मानहरू प्रोबिट मोडेल प्रयोग गरेर गणना गरिएको थियो र 95% विश्वास अन्तरालहरू गणना गरिएको थियो।
इजिप्टको एल घाबिया गभर्नरेटमा विभिन्न भटमास खेतहरूबाट जम्मा चार आइसोलेटहरू सङ्कलन गरिएको थियो। PDA माध्यममा, सबै आइसोलेटहरूले क्रिमी सेतो माइसेलियम उत्पादन गरे जुन चाँडै कपास जस्तो सेतो भयो (चित्र १A) र त्यसपछि स्क्लेरोटियम चरणमा बेज वा खैरो। स्क्लेरोटिया सामान्यतया बाक्लो, कालो, गोलाकार वा अनियमित आकारको हुन्छ, ५.२ देखि ७.७ मिमी लामो र ३.४ देखि ५.३ मिमी व्यासमा (चित्र १B)। यद्यपि चार आइसोलेटहरूले २५ ± २ °C (चित्र १A) मा १०-१२ दिनको इन्क्युबेशन पछि कल्चर माध्यमको किनारमा स्क्लेरोटियाको सीमान्त ढाँचा विकास गरे, प्रति प्लेट स्क्लेरोटियाको संख्या तिनीहरूमध्ये उल्लेखनीय रूपमा फरक थियो (P < ०.००१), आइसोलेट ३ मा स्क्लेरोटियाको उच्चतम संख्या थियो (प्रति प्लेट ३२.३३ ± १.५३ स्क्लेरोटिया; चित्र १C)। त्यस्तै गरी, आइसोलेट #३ ले ​​अन्य आइसोलेटहरू भन्दा PDB मा बढी अक्सालिक एसिड उत्पादन गर्‍यो (३.३३ ± ०.४९ μg.mL−१; चित्र १D)। आइसोलेट #३ ले ​​फाइटोप्याथोजेनिक फंगस स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरमको विशिष्ट रूपात्मक र सूक्ष्म विशेषताहरू देखायो। उदाहरणका लागि, PDA मा, आइसोलेट #३ को उपनिवेशहरू द्रुत रूपमा बढे, क्रिमी सेतो थिए (चित्र १A), उल्टो बेज वा हल्का साल्मन पहेंलो-खैरो, र ९ सेमी व्यासको प्लेटको सतहलाई पूर्ण रूपमा ढाक्न २५ ± २°C मा ६-७ दिन आवश्यक पर्‍यो। माथिको रूपात्मक र सूक्ष्म विशेषताहरूको आधारमा, आइसोलेट #३ लाई स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरमको रूपमा पहिचान गरिएको थियो।
चित्र १. सामान्य फलफूल बालीहरूबाट S. sclerotiorum isolates को विशेषताहरू र रोगजनकता। (A) PDA माध्यममा चार S. sclerotiorum isolates को माइसेलियल वृद्धि, (B) चार S. sclerotiorum isolates को sclerotia, (C) स्क्लेरोटियाको संख्या (प्रति प्लेट), (D) PDB माध्यममा अक्सालिक एसिड स्राव (μg.mL−1), र (E) हरितगृह अवस्थाहरूमा संवेदनशील व्यावसायिक फलफूल खेती Giza 3 मा चार S. sclerotiorum isolates को रोग गम्भीरता (%)। मानहरूले पाँच जैविक प्रतिकृतिहरूको औसत ± SD प्रतिनिधित्व गर्दछ (n = 5)। फरक अक्षरहरूले उपचारहरू बीचको तथ्याङ्कीय रूपमा महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ (p < 0.05)। (F–H) आइसोलेट #3 (dpi) सँग टीकाकरण पछि १० दिन पछि क्रमशः माथिल्लो डाँठ र सिलिकहरूमा विशिष्ट सेतो ढुसीका लक्षणहरू देखा परे। (I) S. sclerotiorum isolate #3 को आन्तरिक ट्रान्सक्राइब्ड स्पेसर (ITS) क्षेत्रको विकासवादी विश्लेषण अधिकतम सम्भावना विधि प्रयोग गरेर गरिएको थियो र राष्ट्रिय जैव प्रौद्योगिकी सूचना केन्द्र (NCBI) डाटाबेस (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) बाट प्राप्त २० सन्दर्भ आइसोलेट/स्ट्रेनहरूसँग तुलना गरिएको थियो। क्लस्टरिङ लाइनहरू माथिका संख्याहरूले क्षेत्र कभरेज (%) लाई जनाउँछ, र क्लस्टरिङ लाइनहरू मुनिका संख्याहरूले शाखा लम्बाइलाई जनाउँछ।
यसबाहेक, रोगजनकता पुष्टि गर्न, चार प्राप्त S. sclerotiorum आइसोलेटहरू हरितगृह अवस्थाहरूमा संवेदनशील व्यावसायिक बीन खेती गिजा ३ लाई खोप लगाउन प्रयोग गरिएको थियो, जुन कोचको पोस्टुलेटहरू (चित्र १E) सँग मेल खान्छ। यद्यपि प्राप्त गरिएका सबै फंगल आइसोलेटहरू रोगजनक थिए र हरियो बीन (cv. Giza ३) लाई संक्रमित गर्न सक्थे, जसले गर्दा जमिन माथिका सबै भागहरूमा (चित्र १F), विशेष गरी डाँठहरूमा (चित्र १G) र कोसाहरूमा (चित्र १H) १० दिन पछि टीकाकरण (dpi) मा विशिष्ट सेतो ढुसीका लक्षणहरू देखा पर्न थाले, आइसोलेट ३ दुई स्वतन्त्र प्रयोगहरूमा सबैभन्दा आक्रामक आइसोलेट थियो। आइसोलेट ३ मा बीन बिरुवाहरूमा सबैभन्दा बढी रोगको गम्भीरता (%) थियो (क्रमशः २४.० ± ४.०, ५८.० ± २.०, र ७६.७ ± ३.१ ७, १४, र २१ दिन पछि संक्रमण; चित्र १F)।
सबैभन्दा आक्रामक S. sclerotiorum isolate #3 को पहिचान आन्तरिक ट्रान्सक्राइब्ड स्पेसर (ITS) अनुक्रमण (चित्र 1I) को आधारमा थप पुष्टि गरिएको थियो। आइसोलेट #3 र 20 सन्दर्भ आइसोलेटहरू/स्ट्रेनहरू बीचको फाइलोजेनेटिक विश्लेषणले तिनीहरू बीच उच्च समानता (>99%) देखायो। यो ध्यान दिन लायक छ कि S. sclerotiorum isolate #3 (533 bp) मा सुक्खा मटरको बीउबाट अलग गरिएको अमेरिकी S. sclerotiorum isolate LPM36 (GenBank accession नम्बर MK896659.1; 540 bp) र चिनियाँ S. sclerotiorum isolate YKY211 (GenBank accession नम्बर OR206374.1; 548 bp) सँग उच्च समानता छ, जसले बैजनी (Matthiola incana) स्टेम रोट निम्त्याउँछ, जुन सबै डेन्ड्रोग्रामको शीर्षमा छुट्टाछुट्टै समूहबद्ध छन् (चित्र 1I)। नयाँ अनुक्रमलाई NCBI डाटाबेसमा जम्मा गरिएको छ र यसलाई "Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25" (GenBank एक्सेसन नम्बर PV202792) नाम दिइएको छ। यो देख्न सकिन्छ कि isolate 3 सबैभन्दा आक्रामक isolate हो; त्यसैले, यो isolate सबै पछिल्ला प्रयोगहरूमा अध्ययनको लागि छनोट गरिएको थियो।
S. sclerotiorum isolate 3 विरुद्ध विभिन्न सांद्रता (१२.५, २५, ५०, ७५, १०० र १२५ mg/L) मा डायमाइन L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, जर्मनी) को जीवाणुरोधी गतिविधिको अनुसन्धान इन भिट्रोमा गरिएको थियो। यो उल्लेखनीय छ कि L-ornithine ले जीवाणुरोधी प्रभाव पारेको थियो र खुराक-निर्भर तरिकाले S. sclerotiorum hyphae को रेडियल वृद्धिलाई बिस्तारै रोकेको थियो (चित्र २A, B)। परीक्षण गरिएको उच्चतम सांद्रता (१२५ mg/L) मा, L-ornithine ले उच्चतम माइसेलियल वृद्धि अवरोध दर (९९.६२ ± ०.२७%; चित्र २B) प्रदर्शन गरेको थियो, जुन व्यावसायिक फङ्गिसाइड Rizolex-T (निरोध दर ९९.४५ ± ०.३९%; चित्र २C) को बराबर थियो जुन उच्चतम सांद्रता (१० mg/L) मा परीक्षण गरिएको थियो, जसले समान प्रभावकारिता जनाउँछ।
चित्र २. स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम विरुद्ध एल-ओर्निथिनको इन भिट्रो जीवाणुरोधी गतिविधि। (क) व्यावसायिक फङ्गिसाइड रिजोलेक्स-टी (१० मिलीग्राम/लिटर) सँग एस. स्क्लेरोटिओरम विरुद्ध एल-ओर्निथिनको विभिन्न सांद्रताको जीवाणुरोधी गतिविधिको तुलना। (ख, ग) क्रमशः एल-ओर्निथिन (१२.५, २५, ५०, ७५, १०० र १२५ मिलीग्राम/लिटर) वा रिजोलेक्स-टी (२, ४, ६, ८ र १० मिलीग्राम/लिटर) को विभिन्न सांद्रतासँग उपचार पछि एस. स्क्लेरोटिओरम माइसेलियल वृद्धिको अवरोध दर (%)। मानहरूले पाँच जैविक प्रतिकृतिहरूको औसत ± SD प्रतिनिधित्व गर्दछ (n = ५)। फरक अक्षरहरूले उपचारहरू बीचको सांख्यिकीय भिन्नताहरू (p < ०.०५) लाई जनाउँछ। (घ, इ) क्रमशः एल-ओर्निथिन र व्यावसायिक फङ्गिसाइड रिजोलेक्स-टीको प्रोबिट मोडेल रिग्रेसन विश्लेषण। प्रोबिट मोडेल रिग्रेसन रेखालाई ठोस नीलो रेखाको रूपमा देखाइएको छ, र आत्मविश्वास अन्तराल (९५%) लाई ड्यास गरिएको रातो रेखाको रूपमा देखाइएको छ।
यसको अतिरिक्त, प्रोबिट रिग्रेसन विश्लेषण गरिएको थियो र सम्बन्धित प्लटहरू तालिका १ र चित्र २D,E मा देखाइएको छ। संक्षेपमा, L-ornithine को स्वीकार्य ढलान मान (y = 2.92x − 4.67) र सम्बन्धित महत्त्वपूर्ण तथ्याङ्कहरू (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 र p < 0.0001; चित्र २D) ले व्यावसायिक फङ्गिसाइड Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 र p < 0.0001) (तालिका १) को तुलनामा S. sclerotiorum विरुद्ध बढेको एन्टिफंगल गतिविधिलाई संकेत गर्‍यो।
तालिका १. एस. स्क्लेरोटियोरम विरुद्ध एल-ओर्निथिन र व्यावसायिक फङ्गिसाइड "रिजोलेक्स-टी" को आधा-अधिकतम निरोधात्मक सांद्रता (IC50) र IC99 (mg/l) को मान।
समग्रमा, उपचार नगरिएका एस. स्क्लेरोटियोरम-संक्रमित बिरुवाहरूको तुलनामा उपचार गरिएका सामान्य बीन बिरुवाहरूमा एल-ओर्निथिन (२५० मिलीग्राम/लिटर) ले सेतो ढुसी (मोल्ड) को विकास र गम्भीरतालाई उल्लेखनीय रूपमा कम गर्‍यो (नियन्त्रण; चित्र ३ए)। संक्षेपमा, उपचार नगरिएका संक्रमित नियन्त्रण बिरुवाहरूको रोगको गम्भीरता बिस्तारै बढ्यो (५२.६७ ± १.५३, ८३.२१ ± २.६१, र ९२.३३ ± ३.०६%), एल-ओर्निथिनले उपचार पछिको ७, १४ र २१ दिन (dpt) मा क्रमशः प्रयोग (८.९७ ± ०.१५, १८.०० ± १.००, र २६.३६ ± ३.०७) भरि रोगको गम्भीरता (%) लाई उल्लेखनीय रूपमा कम गर्‍यो (चित्र ३ए)। त्यस्तै गरी, जब S. sclerotiorum-संक्रमित सिमीका बोटहरूलाई २५० mg/L L-ornithine ले उपचार गरियो, रोग प्रगति वक्र (AUDPC) अन्तर्गतको क्षेत्र उपचार नगरिएको नियन्त्रणमा १२७४.३३ ± ३३.१३ बाट घटेर २८१.०३ ± ७.९५ भयो, जुन सकारात्मक नियन्त्रण ५० mg/L Rizolex-T फङ्गिसाइड (१८३.६१ ± ७.७१; चित्र ३B) भन्दा थोरै कम थियो। दोस्रो प्रयोगमा पनि उही प्रवृत्ति देखियो।
चित्र ३. हरितगृह अवस्थामा स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटियोरमको कारणले हुने साधारण सिमीको सेतो सड्ने विकासमा L-ornithine को बाह्य प्रयोगको प्रभाव। (A) २५० मिलीग्राम/लिटर L-ornithine को उपचार पछि साधारण सिमीको सेतो ढुसी को रोग प्रगति वक्र। (B) L-ornithine को उपचार पछि साधारण सिमीको सेतो ढुसी को रोग प्रगति वक्र (AUDPC) अन्तर्गतको क्षेत्र। मानहरूले पाँच जैविक प्रतिकृतिहरूको औसत ± SD (n = 5) प्रतिनिधित्व गर्दछ। विभिन्न अक्षरहरूले उपचारहरू बीचको सांख्यिकीय रूपमा महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू जनाउँछ (p < ०.०५)।
२५० मिलीग्राम/लिटर एल-ओर्निथिनको बाह्य प्रयोगले ४२ दिन पछि बिरुवाको उचाइ (चित्र ४क), प्रति बोट हाँगाहरूको संख्या (चित्र ४ख) र प्रति बोट पातहरूको संख्या (चित्र ४ग) बिस्तारै बढायो। व्यावसायिक फङ्गिसाइड रिजोलेक्स-टी (५० मिलीग्राम/लिटर) ले अध्ययन गरिएका सबै पोषण मापदण्डहरूमा सबैभन्दा ठूलो प्रभाव पारेको भए पनि, उपचार नगरिएका नियन्त्रणहरूको तुलनामा २५० मिलीग्राम/लिटर एल-ओर्निथिनको बाह्य प्रयोगले दोस्रो ठूलो प्रभाव पारेको थियो (चित्र ४क–क)। अर्कोतर्फ, एल-ओर्निथिन उपचारले प्रकाश संश्लेषक पिग्मेन्ट क्लोरोफिल ए (चित्र ४D) र क्लोरोफिल बी (चित्र ४E) को सामग्रीमा कुनै उल्लेखनीय प्रभाव पारेन, तर नकारात्मक नियन्त्रण (०.४४ ± ०.०२ मिलीग्राम/ग्राम fr wt) र सकारात्मक नियन्त्रण (०.४६ ± ०.०२ मिलीग्राम/ग्राम fr wt; चित्र ४F) को तुलनामा कुल क्यारोटिनोइड सामग्री (०.५६ ± ०.०३ मिलीग्राम/ग्राम fr wt) मा थोरै वृद्धि गर्‍यो। समग्रमा, यी नतिजाहरूले संकेत गर्छन् कि एल-ओर्निथिन उपचार गरिएका फलफूलहरूको लागि फाइटोटोक्सिक छैन र तिनीहरूको वृद्धिलाई पनि उत्तेजित गर्न सक्छ।
चित्र ४. ग्रीनहाउस अवस्थामा स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटियोरमबाट संक्रमित सिमीका पातहरूको वृद्धि विशेषताहरू र प्रकाशसंश्लेषक पिग्मेन्टहरूमा बाह्य एल-ओर्निथिनको प्रयोगको प्रभाव। (A) बिरुवाको उचाइ (सेमी), (B) प्रति बिरुवा हाँगाहरूको संख्या, (C) प्रति बिरुवा पातहरूको संख्या, (D) क्लोरोफिल a सामग्री (mg g-1 fr wt), (E) क्लोरोफिल b सामग्री (mg g-1 fr wt), (F) कुल क्यारोटिनोइड सामग्री (mg g-1 fr wt)। मानहरू पाँच जैविक प्रतिकृतिहरूको औसत ± SD हुन् (n = 5)। विभिन्न अक्षरहरूले उपचारहरू बीचको तथ्याङ्कीय रूपमा महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ (p < 0.05)।
प्रतिक्रियाशील अक्सिजन प्रजातिहरू (ROS; हाइड्रोजन पेरोक्साइड [H2O2] को रूपमा व्यक्त गरिएको) र मुक्त रेडिकलहरू (सुपरअक्साइड एनियनहरू [O2•−] को रूपमा व्यक्त गरिएको) को इन सिटु हिस्टोकेमिकल स्थानीयकरणले पत्ता लगायो कि L-ornithine (250 mg/L) को बाह्य प्रयोगले H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; चित्र 5A) र O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; चित्र 5B) को संचयलाई उल्लेखनीय रूपमा कम गर्‍यो, उपचार नगरिएका संक्रमित बिरुवाहरू (क्रमशः १७३.३१ ± १२.०६ र १४९.३५ ± ७.९४ nmol.g−1 FW) र व्यावसायिक फङ्गिसाइड Rizolex-T (१७०.१२ ± ९.५० र १५७.०० ± ७.८१ nmol.g−१ fr wt, को ५० mg/L संग उपचार गरिएका बिरुवाहरूको संचयको तुलनामा। क्रमशः) ७२ घण्टामा। hpt अन्तर्गत H2O2 र O2•− को उच्च स्तर जम्मा भयो (चित्र ५A, B)। त्यस्तै, TCA-आधारित malondialdehyde (MDA) परीक्षणले देखायो कि S. sclerotiorum-संक्रमित बीन बिरुवाहरूले आफ्नो पातहरूमा MDA (११३.४८ ± १०.०२ nmol.g fr wt) को उच्च स्तर जम्मा गरे (चित्र ५C)। यद्यपि, L-ornithine को बाह्य प्रयोगले लिपिड पेरोक्सिडेशनलाई उल्लेखनीय रूपमा कम गर्‍यो जुन उपचार गरिएका बोटहरूमा MDA सामग्रीमा कमी (३३.०८ ± ४.०० nmol.g fr wt) द्वारा प्रमाणित हुन्छ।
चित्र ५. ग्रीनहाउस अवस्थामा संक्रमण पछि ७२ घण्टामा S. sclerotiorum बाट संक्रमित सिमीका पातहरूमा अक्सिडेटिभ तनाव र गैर-एन्जाइमेटिक एन्टिअक्सिडेन्ट प्रतिरक्षा संयन्त्रका प्रमुख मार्करहरूमा बाह्य L-ornithine प्रयोगको प्रभाव। (A) हाइड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2; nmol g−1 FW) ७२ hpt मा, (B) सुपरअक्साइड आयन (O2•−; nmol g−1 FW) ७२ hpt मा, (C) मालोन्डियाल्डिहाइड (MDA; nmol g−1 FW) ७२ hpt मा, (D) कुल घुलनशील फिनोलहरू (mg GAE g−1 FW) ७२ hpt मा, (E) कुल घुलनशील फ्लेभोनोइड्स (mg RE g−1 FW) ७२ hpt मा, (F) कुल मुक्त एमिनो एसिडहरू (mg g−1 FW) ७२ hpt मा, र (G) प्रोलाइन सामग्री (mg g−1 FW) ७२ hpt मा। मानहरूले ५ जैविक प्रतिकृतिहरूको औसत ± मानक विचलन (औसत ± SD) प्रतिनिधित्व गर्दछ (n = ५)। फरक अक्षरहरूले उपचारहरू बीचको तथ्याङ्कीय रूपमा महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ (p < ०.०५)।