Nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद।तपाईंले प्रयोग गरिरहनुभएको ब्राउजर संस्करणमा CSS को लागि सीमित समर्थन छ।उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई अद्यावधिक गरिएको ब्राउजर प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड बन्द गर्नुहोस्)।यस बीचमा, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी शैली र जाभास्क्रिप्ट बिना साइट प्रदर्शन गर्नेछौं।
उच्च लोडिङ सामग्री भएका इन्सुलिन न्यानोपार्टिकल्स (NPs) ले विभिन्न खुराक रूपहरूमा फरक-फरक अनुप्रयोगहरू फेला पारेका छन्। यो कामको उद्देश्य इन्सुलिन-लोड गरिएका चिटोसन न्यानोपार्टिकल्सको संरचनामा फ्रिज-ड्राइङ र स्प्रे-ड्राइङ प्रक्रियाहरूको प्रभावको मूल्याङ्कन गर्नु हो, म्यानिटोललाई क्रायोप्रोटेक्टेन्टको रूपमा वा बिना। हामीले यी न्यानोपार्टिकल्सहरूलाई पुन: विघटन गरेर पनि गुणस्तरको मूल्याङ्कन गर्यौं। निर्जलीकरण अघि, चिटोसन/सोडियम ट्राइपोलिफोस्फेट/इन्सुलिन क्रस-लिङ्क गरिएको न्यानोपार्टिकल्सको कण आकार 318 nm मा अनुकूलित गरिएको थियो, PDI 0.18 थियो, इन्क्याप्सुलेशन दक्षता 99.4% थियो, र लोडिङ 25.01% थियो। पुनर्गठन पछि, म्यानिटोलको प्रयोग बिना फ्रिज-ड्राइङ विधिद्वारा उत्पादित बाहेक सबै न्यानोपार्टिकल्सले आफ्नो गोलाकार कण संरचना कायम राखे। स्प्रेद्वारा निर्जलित म्यानिटोल-युक्त न्यानोपार्टिकल्सको तुलनामा, म्यानिटोल-मुक्त स्प्रे-सुक्खा न्यानोपार्टिकल्सले पनि समान इन्क्याप्सुलेशन दरको साथ सबैभन्दा सानो औसत कण आकार (376 nm) र उच्चतम लोडिङ सामग्री (25.02%) देखायो। (९८.७%) र PDI (०.२०) सुकाउने वा फ्रिज-सुकाउने प्रविधिहरूद्वारा। म्यानिटोल बिना स्प्रे सुकाउने द्वारा सुकेका न्यानोपार्टिकल्सले इन्सुलिनको सबैभन्दा छिटो रिलीज र सेलुलर अपटेकको उच्चतम दक्षतामा पनि परिणाम दियो। यो कामले देखाउँछ कि स्प्रे सुकाउनेले परम्परागत फ्रिज सुकाउने विधिहरूको तुलनामा क्रायोप्रोटेक्टेन्टहरूको आवश्यकता बिना इन्सुलिन न्यानोपार्टिकल्सलाई निर्जलीकरण गर्न सक्छ, जसले गर्दा बढी लोडिङ क्षमता सिर्जना हुन्छ, थप आवश्यकताहरू कम हुन्छन् र सञ्चालन लागतहरू महत्त्वपूर्ण फाइदा हुन्छ।
१९२२१,२,३ मा यसको खोज भएदेखि, इन्सुलिन र यसको औषधि तयारीहरूले टाइप १ मधुमेह (T1DM) र टाइप २ मधुमेह (T1DM) भएका बिरामीहरूको जीवन बचाएको छ। यद्यपि, उच्च आणविक तौल प्रोटीनको रूपमा यसको गुणहरूको कारण, इन्सुलिन सजिलैसँग एकत्रित हुन्छ, प्रोटियोलाइटिक इन्जाइमहरूद्वारा टुक्रिन्छ, र पहिलो-पास प्रभावद्वारा हटाइन्छ। टाइप १ मधुमेहको निदान भएका मानिसहरूलाई आफ्नो बाँकी जीवनको लागि इन्सुलिन इंजेक्शन चाहिन्छ। टाइप २ मधुमेहको सुरुवातमा निदान गरिएका धेरै बिरामीहरूलाई पनि लामो समयसम्म इन्सुलिन इंजेक्शन चाहिन्छ। दैनिक इन्सुलिन इंजेक्शनहरू यी व्यक्तिहरूको लागि दैनिक पीडा र असुविधाको गम्भीर स्रोत हुन्, मानसिक स्वास्थ्यमा नकारात्मक प्रभाव पार्छन्। फलस्वरूप, कम असुविधा निम्त्याउने इन्सुलिन प्रशासनका अन्य रूपहरू, जस्तै मौखिक इन्सुलिन प्रशासन, व्यापक रूपमा अध्ययन गरिँदैछ5 किनभने तिनीहरूसँग विश्वभर मधुमेह भएका लगभग ५ अर्ब मानिसहरूको जीवनको गुणस्तर पुनर्स्थापित गर्ने क्षमता छ।
न्यानोपार्टिकल टेक्नोलोजीले मौखिक इन्सुलिन ४,६,७ लिने प्रयासहरूमा उल्लेखनीय प्रगति प्रदान गरेको छ। एउटा जसले प्रभावकारी रूपमा इन्सुलिनलाई समेट्छ र विशिष्ट शरीर साइटहरूमा लक्षित डेलिभरीको लागि गिरावटबाट बचाउँछ। यद्यपि, न्यानोपार्टिकल सूत्रहरूको प्रयोगमा धेरै सीमितताहरू छन्, मुख्यतया कण निलम्बनको स्थिरता समस्याहरूको कारणले। भण्डारणको क्रममा केही एकत्रीकरण हुन सक्छ, जसले इन्सुलिन-लोड गरिएको न्यानोपार्टिकलहरूको जैव उपलब्धतालाई कम गर्छ। थप रूपमा, इन्सुलिन न्यानोपार्टिकलहरू (NPs) को स्थिरता सुनिश्चित गर्न न्यानोपार्टिकलहरू र इन्सुलिनको पोलिमर म्याट्रिक्सको रासायनिक स्थिरतालाई पनि विचार गर्नुपर्छ। हाल, भण्डारणको समयमा अनावश्यक परिवर्तनहरूलाई रोक्दै स्थिर NPs सिर्जना गर्न फ्रिज-ड्राइङ टेक्नोलोजी सुनको मानक हो।
यद्यपि, फ्रिज-ड्राइङमा क्रायोप्रोटेक्टेन्टहरू थप्न आवश्यक पर्दछ ताकि NPs को गोलाकार संरचनालाई बरफको क्रिस्टलको मेकानिकल तनावबाट प्रभावित हुनबाट रोकियोस्। यसले लाइओफिलाइजेशन पछि इन्सुलिन न्यानोपार्टिकल्सको लोडिङलाई उल्लेखनीय रूपमा कम गर्छ, किनकि क्रायोप्रोटेक्टेन्टले अधिकांश तौल अनुपात ओगटेको हुन्छ। त्यसकारण, उत्पादित इन्सुलिन NPs प्रायः सुक्खा पाउडर सूत्रहरू, जस्तै मौखिक ट्याब्लेटहरू र मौखिक फिल्महरूको निर्माणको लागि अनुपयुक्त पाइएको छ, किनभने इन्सुलिनको चिकित्सीय विन्डो प्राप्त गर्न ठूलो मात्रामा सुख्खा न्यानोपार्टिकल्सको आवश्यकता पर्दछ।
औषधि उद्योगमा तरल चरणहरूबाट सुख्खा पाउडर उत्पादन गर्ने स्प्रे सुकाउने एक प्रसिद्ध र सस्तो औद्योगिक-स्तरीय प्रक्रिया हो10,11। कण गठन प्रक्रियामा नियन्त्रणले धेरै जैविक सक्रिय यौगिकहरूको उचित इन्क्याप्सुलेशनलाई अनुमति दिन्छ 12, 13। यसबाहेक, यो मौखिक प्रशासनको लागि इन्क्याप्सुलेटेड प्रोटीनहरू तयार गर्ने प्रभावकारी प्रविधि बनेको छ। स्प्रे सुकाउने क्रममा, पानी धेरै छिटो वाष्पीकरण हुन्छ, जसले कण कोरको तापक्रम कम राख्न मद्दत गर्दछ11,14, यसको प्रयोगलाई गर्मी-संवेदनशील घटकहरूलाई इन्क्याप्सुलेट गर्न सक्षम बनाउँछ। स्प्रे सुकाउनु अघि, कोटिंग सामग्रीलाई इन्क्याप्सुलेटेड सामग्रीहरू भएको घोलसँग राम्ररी एकरूप गर्नुपर्छ11,14। फ्रिज-सुकाउने विपरीत, स्प्रे-सुकाउनेमा इन्क्याप्सुलेसन अघि एकरूपीकरणले डिहाइड्रेसनको समयमा इन्क्याप्सुलेशन दक्षतामा सुधार गर्दछ। स्प्रे-सुकाउने इन्क्याप्सुलेशन प्रक्रियालाई क्रायोप्रोटेक्टेन्टहरू आवश्यक पर्दैन, स्प्रे-सुकाउने उच्च लोडिङ सामग्रीको साथ सुकेको NPs उत्पादन गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ।
यस अध्ययनले आयन जेल विधि प्रयोग गरेर चिटोसन र सोडियम ट्राइपोलिफोस्फेटको क्रस-लिङ्किङद्वारा इन्सुलिन-लोडेड एनपीहरूको उत्पादनको रिपोर्ट गर्दछ। आयन जेलेसन एक तयारी विधि हो जसले निश्चित परिस्थितिहरूमा दुई वा बढी आयनिक प्रजातिहरू बीच इलेक्ट्रोस्टेटिक अन्तरक्रिया मार्फत न्यानोपार्टिकल्सको उत्पादनलाई अनुमति दिन्छ। अनुकूलित चिटोसन/सोडियम ट्राइपोलिफोस्फेट/इन्सुलिन क्रस-लिङ्क गरिएको न्यानोपार्टिकल्सलाई निर्जलीकरण गर्न फ्रिज-ड्राइङ र स्प्रे-ड्राइङ दुवै प्रविधिहरू प्रयोग गरिएको थियो। निर्जलीकरण पछि, तिनीहरूको आकारविज्ञान SEM द्वारा विश्लेषण गरिएको थियो। तिनीहरूको आकार वितरण, सतह चार्ज, PDI, इन्क्याप्सुलेशन दक्षता, र लोडिङ सामग्री मापन गरेर तिनीहरूको पुनर्संयोजन क्षमताको मूल्याङ्कन गरिएको थियो। विभिन्न निर्जलीकरण विधिहरूद्वारा उत्पादित रिजोल्युबिलाइज्ड न्यानोपार्टिकल्सको गुणस्तर पनि तिनीहरूको इन्सुलिन सुरक्षा, रिलीज व्यवहार, र सेलुलर अपटेक प्रभावकारिता तुलना गरेर मूल्याङ्कन गरिएको थियो।
मिश्रित घोलको pH र chitosan र इन्सुलिनको अनुपात दुई प्रमुख कारकहरू हुन् जसले अन्तिम NPs को कण आकार र encapsulation दक्षता (EE) लाई असर गर्छ, किनकि तिनीहरूले प्रत्यक्ष रूपमा ionotropic gelation प्रक्रियालाई असर गर्छन्। मिश्रित घोलको pH कण आकार र encapsulation दक्षता (चित्र 1a) सँग अत्यधिक सम्बन्धित देखाइएको थियो। चित्र 1a मा देखाइएझैं, pH 4.0 बाट 6.0 मा बढ्दै जाँदा, औसत कण आकार (nm) घट्यो र EE उल्लेखनीय रूपमा बढ्यो, जब pH 6.5 मा बढ्यो, औसत कण आकार बढ्न थाल्यो र EE अपरिवर्तित रह्यो। chitosan र इन्सुलिनको अनुपात बढ्दै जाँदा, औसत कण आकार पनि बढ्छ। यसबाहेक, न्यानोपार्टिकलहरू 2.5:1 (w/w) (चित्र 1b) भन्दा बढी chitosan/insulin को द्रव्यमान अनुपातमा तयार पार्दा EE मा कुनै परिवर्तन देखिएन। त्यसकारण, यस अध्ययनमा इष्टतम तयारी अवस्थाहरू (pH 6.0, chitosan/insulin को द्रव्यमान अनुपात) २.५:१) थप अध्ययनको लागि इन्सुलिन-लोड गरिएका न्यानोपार्टिकल्स तयार गर्न प्रयोग गरिएको थियो। यस तयारी अवस्थामा, इन्सुलिन न्यानोपार्टिकल्सको औसत कण आकार ३१८ एनएम (चित्र १c) मा अनुकूलित गरिएको थियो, PDI ०.१८ थियो, इम्बेडिङ दक्षता ९९.४% थियो, जेटा क्षमता ९.८ mv थियो, र इन्सुलिन लोडिङ २५.०१% (m/m) थियो। ट्रान्समिसन इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोपी (TEM) नतिजाहरूको आधारमा, अनुकूलित न्यानोपार्टिकल्सहरू लगभग गोलाकार र अपेक्षाकृत एकसमान आकार (चित्र १d) सँग अलग थिए।
इन्सुलिन न्यानोपार्टिकल्सको प्यारामिटर अप्टिमाइजेसन: (क) इन्सुलिन न्यानोपार्टिकल्सको औसत व्यास र इन्क्याप्सुलेशन दक्षता (EE) मा pH को प्रभाव (chitosan र इन्सुलिनको 5:1 द्रव्यमान अनुपातमा तयार गरिएको); (ख) chitosan र इन्सुलिन NPs को औसत व्यास र इन्क्याप्सुलेशन दक्षता (EE) मा इन्सुलिनको द्रव्यमान अनुपातको प्रभाव (pH 6 मा तयार गरिएको); (ग) अनुकूलित इन्सुलिन न्यानोपार्टिकल्सको कण आकार वितरण; (घ) अनुकूलित इन्सुलिन NPs को TEM माइक्रोग्राफ।
यो सबैलाई थाहा छ कि चिटोसन एक कमजोर पोलीइलेक्ट्रोलाइट हो जसको pKa 6.5 हुन्छ। यो अम्लीय माध्यममा सकारात्मक रूपमा चार्ज हुन्छ किनभने यसको मुख्य एमिनो समूह हाइड्रोजन आयनहरू द्वारा प्रोटोनेटेड हुन्छ। त्यसकारण, यो प्रायः नकारात्मक रूपमा चार्ज गरिएको म्याक्रोमोलेक्युलहरू समाहित गर्न वाहकको रूपमा प्रयोग गरिन्छ। यस अध्ययनमा, चिटोसन 5.3 को आइसोइलेक्ट्रिक बिन्दुको साथ इन्सुलिन समाहित गर्न प्रयोग गरिएको थियो। चिटोसनलाई कोटिंग सामग्रीको रूपमा प्रयोग गरिएको हुनाले, यसको अनुपात बढ्दै जाँदा, न्यानोपार्टिकल्सको बाहिरी तहको मोटाई तदनुसार बढ्छ, जसको परिणामस्वरूप ठूलो औसत कण आकार हुन्छ। थप रूपमा, चिटोसनको उच्च स्तरले बढी इन्सुलिन समाहित गर्न सक्छ। हाम्रो अवस्थामा, चिटोसन र इन्सुलिनको अनुपात 2.5:1 पुग्दा EE उच्चतम थियो, र अनुपात बढ्दै जाँदा EE मा कुनै महत्त्वपूर्ण परिवर्तन भएन।
चिटोसन र इन्सुलिनको अनुपातको अलावा, pH ले NPs को तयारीमा पनि महत्त्वपूर्ण भूमिका खेलेको थियो। Gan et al. 17 ले चिटोसन न्यानोपार्टिकल्सको कण आकारमा pH को प्रभावको अध्ययन गरे। pH 6.0 नपुगुन्जेल तिनीहरूले कण आकारमा निरन्तर कमी पाए, र pH > 6.0 मा कण आकारमा उल्लेखनीय वृद्धि देखियो, जुन हाम्रो अवलोकनहरूसँग मेल खान्छ। यो घटना यस तथ्यको कारणले हो कि बढ्दो pH सँग, इन्सुलिन अणुले नकारात्मक सतह चार्ज प्राप्त गर्दछ, यसरी, चिटोसन/सोडियम ट्राइपोलिफोस्फेट (TPP) जटिलसँग इलेक्ट्रोस्टेटिक अन्तरक्रियाको पक्षमा, सानो कण आकार र उच्च EE हुन्छ। यद्यपि, जब pH 6.5 मा समायोजन गरिएको थियो, चिटोसनमा रहेका एमिनो समूहहरू डिप्रोटोनेटेड थिए, जसको परिणामस्वरूप चिटोसन फोल्डिंग भयो। यसरी, उच्च pH ले TPP र इन्सुलिनमा एमिनो आयनहरूको कम जोखिममा परिणाम दिन्छ, जसको परिणामस्वरूप कम क्रस-लिङ्किङ, ठूलो अन्तिम औसत कण आकार र कम EE हुन्छ।
फ्रिज-ड्राईड र स्प्रे-ड्राईड NPs को रूपात्मक गुणहरूको विश्लेषणले राम्रो निर्जलीकरण र पाउडर गठन प्रविधिहरूको चयनलाई मार्गदर्शन गर्न सक्छ। रुचाइएको विधिले औषधि स्थिरता, एकसमान कण आकार, उच्च औषधि लोडिङ र मूल घोलमा राम्रो घुलनशीलता प्रदान गर्नुपर्छ। यस अध्ययनमा, दुई प्रविधिहरूको राम्रो तुलना गर्न, निर्जलीकरणको समयमा १% म्यानिटोल भएको वा बिना इन्सुलिन NPs प्रयोग गरिएको थियो। फ्रिज सुकाउने र स्प्रे सुकाउनेको लागि विभिन्न सुख्खा पाउडर सूत्रहरूमा म्यानिटोललाई बल्किङ एजेन्ट वा क्रायोप्रोटेक्टेन्टको रूपमा प्रयोग गरिन्छ। चित्र २a मा देखाइए अनुसार, म्यानिटोल बिनाको लियोफिलाइज्ड इन्सुलिन न्यानोपार्टिकल्सको लागि, ठूलो, अनियमित र नराम्रो सतहहरू भएको अत्यधिक छिद्रपूर्ण पाउडर संरचना स्क्यानिङ इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोपी (SEM) अन्तर्गत अवलोकन गरिएको थियो। निर्जलीकरण पछि पाउडरमा केही अलग कणहरू पत्ता लगाइयो (चित्र २e)। यी नतिजाहरूले संकेत गरे कि धेरैजसो NPs कुनै पनि क्रायोप्रोटेक्टेन्ट बिना फ्रिज-ड्राईडिङको समयमा विघटित भएको थियो। फ्रिज-ड्राईड र स्प्रे-ड्राईड इन्सुलिन न्यानोपार्टिकल्सको लागि १% म्यानिटोल भएको, चिल्लो सतहहरू भएका गोलाकार न्यानोपार्टिकल्स अवलोकन गरिएको थियो (चित्र)। २b,d,f,h)।म्यानिटोल बिना स्प्रे-ड्राई गरिएको इन्सुलिन न्यानोपार्टिकल्स गोलाकार रहे तर सतहमा चाउरी परेको (चित्र २c)। गोलाकार र चाउरी परेको सतहहरू तल रिलीज व्यवहार र सेलुलर अपटेक परीक्षणहरूमा थप छलफल गरिएको छ। सुकेको NPs को दृश्य उपस्थितिको आधारमा, म्यानिटोल बिना स्प्रे-ड्राई गरिएको NPs र म्यानिटोलसँग फ्रिज-ड्राई गरिएको NPs र स्प्रे-ड्राई गरिएको NPs दुवैले राम्रो NPs पाउडरहरू उत्पादन गरे (चित्र २f,g,h)। कण सतहहरू बीचको सतह क्षेत्रफल जति ठूलो हुन्छ, घुलनशीलता त्यति नै उच्च हुन्छ र त्यसैले रिलीज दर पनि त्यति नै उच्च हुन्छ।
विभिन्न निर्जलित इन्सुलिन NPs को आकारविज्ञान: (a) म्यानिटोल बिनाको लियोफिलाइज्ड इन्सुलिन NPs को SEM छवि; (b) म्यानिटोल सहितको लियोफिलाइज्ड इन्सुलिन NPs को SEM छवि; (c) म्यानिटोल बिनाको स्प्रे-ड्राईड इन्सुलिन NPs को SEM छवि; (d) म्यानिटोल संग स्प्रे-ड्राईड इन्सुलिन NPs को SEM छवि; (e) म्यानिटोल बिनाको लियोफिलाइज्ड इन्सुलिन NPs पाउडरको छवि; (f) म्यानिटोल संगको लियोफिलाइज्ड इन्सुलिन NPs को छवि; (g) म्यानिटोल बिनाको स्प्रे-ड्राईड इन्सुलिन NPs पाउडरको छवि; (h) म्यानिटोल सहितको स्प्रे-ड्राईड इन्सुलिन NPs पाउडरको छवि।
फ्रिज-ड्राइङको समयमा, म्यानिटोलले क्रायोप्रोटेक्टेन्टको रूपमा काम गर्छ, NPs लाई अनाकार रूपमा राख्छ र बरफ क्रिस्टलहरूद्वारा हुने क्षतिलाई रोक्छ। यसको विपरीत, स्प्रे सुकाउने क्रममा कुनै फ्रिजिङ चरण हुँदैन। त्यसैले यस विधिमा म्यानिटोल आवश्यक पर्दैन। वास्तवमा, म्यानिटोल बिना स्प्रे-ड्राइङ NPs ले पहिले वर्णन गरिए अनुसार राम्रो NPs उत्पादन गर्‍यो। यद्यपि, म्यानिटोलले अझै पनि NPs लाई थप गोलाकार संरचना दिन स्प्रे-ड्राइङ प्रक्रियामा फिलरको रूपमा काम गर्न सक्छ (चित्र 2d), जसले त्यस्ता एन्क्याप्सुलेटेड NPs को एकसमान रिलीज व्यवहार प्राप्त गर्न मद्दत गर्दछ। थप रूपमा, यो स्पष्ट छ कि केही ठूला कणहरू फ्रिज-ड्राइङ र स्प्रे-ड्राइङ इन्सुलिन NPs दुवैमा पत्ता लगाउन सकिन्छ जसमा म्यानिटोल (चित्र 2b,d) हुन्छ, जुन एन्क्याप्सुलेटेड इन्सुलिनसँगै कण कोरमा म्यानिटोलको संचयको कारणले हुन सक्छ। चिटोसन तह। यो ध्यान दिन लायक छ कि यस अध्ययनमा, निर्जलीकरण पछि गोलाकार संरचना अक्षुण्ण रहन्छ भनेर सुनिश्चित गर्न, म्यानिटोल र चिटोसनको अनुपात ५:१ मा राखिएको छ, ताकि ठूलो मात्रामा फिलरले सुकेका एनपीहरूको कण आकार पनि बढाउन सकोस्।
फुरियर ट्रान्सफर्म इन्फ्रारेड एटेन्युएटेड टोटल रिफ्लेक्सन (FTIR-ATR) स्पेक्ट्रोस्कोपीले फ्री इन्सुलिन, चिटोसन, चिटोसन, TPP र इन्सुलिनको भौतिक मिश्रणलाई चित्रण गर्‍यो। सबै डिहाइड्रेटेड NP हरूलाई FTIR-ATR स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रयोग गरेर चित्रण गरिएको थियो। उल्लेखनीय रूपमा, १६४१, १५४३ र १४१२ cm-१ को ब्यान्ड तीव्रता म्यानिटोलले फ्रिज-ड्राइ गरिएको एन्क्याप्सुलेटेड NP हरूमा र म्यानिटोलले र बिना स्प्रे-ड्राइ गरिएको NP हरूमा अवलोकन गरिएको थियो (चित्र ३)। पहिले रिपोर्ट गरिएझैं, शक्तिमा यी वृद्धिहरू चिटोसन, TPP र इन्सुलिन बीचको क्रस-लिङ्किङसँग सम्बन्धित थिए। चिटोसन र इन्सुलिन बीचको अन्तरक्रियाको अनुसन्धानले देखाएको छ कि इन्सुलिन-लोड गरिएको चिटोसन न्यानोपार्टिकल्सको FTIR स्पेक्ट्रामा, चिटोसन ब्यान्ड इन्सुलिनको साथ ओभरल्याप हुन्छ, कार्बोनिल तीव्रता (१६४१ cm-१) र एमाइन (१५४३ cm-१) बेल्ट बढ्छ। TPP का ट्राइपोलिफोस्फेट समूहहरू अमोनियमसँग जोडिएका छन्। चिटोसनमा समूहहरू, १४१२ सेमी-१ मा ब्यान्ड बनाउँछन्।
विभिन्न विधिहरूद्वारा निर्जलित नि:शुल्क इन्सुलिन, चिटोसन, चिटोसन/TPP/इन्सुलिनको भौतिक मिश्रण र NPs को FTIR-ATR स्पेक्ट्रा।
यसबाहेक, यी नतिजाहरू SEM मा देखाइएका नतिजाहरूसँग मिल्दोजुल्दो छन्, जसले देखाएको छ कि इनक्याप्सुलेटेड NPs स्प्रे गर्दा र म्यानिटोलले फ्रिज-ड्राइ गर्दा दुवै अक्षुण्ण रह्यो, तर म्यानिटोलको अनुपस्थितिमा, स्प्रे-ड्राइङले मात्र इनक्याप्सुलेटेड कणहरू उत्पादन गर्‍यो। यसको विपरित, म्यानिटोल बिना फ्रिज-ड्राइ गरिएका NPs को FTIR-ATR स्पेक्ट्रल नतिजाहरू chitosan, TPP, र इन्सुलिनको भौतिक मिश्रणसँग धेरै मिल्दोजुल्दो थिए। यो नतिजाले संकेत गर्दछ कि chitosan, TPP र इन्सुलिन बीचको क्रस-लिङ्कहरू अब म्यानिटोल बिना फ्रिज-ड्राइ गरिएका NPs मा उपस्थित छैनन्। NPs संरचना क्रायोप्रोटेक्टेन्ट बिना फ्रिज-ड्राइ गर्ने क्रममा नष्ट भएको थियो, जुन SEM परिणामहरूमा देख्न सकिन्छ (चित्र 2a)। डिहाइड्रेटेड इन्सुलिन NPs को आकारविज्ञान र FTIR नतिजाहरूको आधारमा, केवल लाइओफिलाइज्ड, स्प्रे-ड्राइ, र म्यानिटोल-मुक्त NPs पुनर्गठन प्रयोगहरू र म्यानिटोल-मुक्त NPs को लागि प्रयोग गरिएको थियो किनभने म्यानिटोल-मुक्त NPs को विघटनको समयमा। निर्जलीकरण। छलफल गर्नुहोस्।
डिहाइड्रेसनलाई दीर्घकालीन भण्डारण र अन्य सूत्रहरूमा पुन: प्रशोधनको लागि प्रयोग गरिन्छ। ट्याब्लेट र फिल्महरू जस्ता विभिन्न सूत्रहरूमा प्रयोगको लागि भण्डारण पछि सुख्खा NPs को पुनर्गठन गर्ने क्षमता महत्त्वपूर्ण छ। हामीले याद गर्यौं कि म्यानिटोलको अनुपस्थितिमा स्प्रे-सुक्खा इन्सुलिन NPs को औसत कण आकार पुनर्गठन पछि थोरै मात्र बढ्यो। अर्कोतर्फ, म्यानिटोलको साथ स्प्रे-सुक्खा र फ्रिज-सुक्खा इन्सुलिन न्यानोपार्टिकल्सको कण आकार उल्लेखनीय रूपमा बढ्यो (तालिका १)। यस अध्ययनमा सबै NPs को पुनर्संयोजन पछि PDI र EE उल्लेखनीय रूपमा परिवर्तन भएनन् (p > ०.०५)। यो नतिजाले संकेत गर्दछ कि धेरैजसो कणहरू पुन: घुलन पछि अक्षुण्ण रहे। यद्यपि, म्यानिटोल थप्दा लाइओफिलाइज्ड र स्प्रे-सुक्खा म्यानिटोल न्यानोपार्टिकल्स (तालिका १) को इन्सुलिन लोडिङ धेरै कम भयो। यसको विपरीत, म्यानिटोल बिना स्प्रे-सुक्खा NPs को इन्सुलिन लोड सामग्री पहिले जस्तै रह्यो (तालिका १)।
औषधि वितरण उद्देश्यका लागि प्रयोग गर्दा न्यानोपार्टिकल्सको लोडिङ महत्वपूर्ण हुन्छ भन्ने कुरा सबैलाई थाहा छ। कम लोडिङ भएका NP हरूको लागि, चिकित्सीय सीमामा पुग्न धेरै ठूलो मात्रामा सामग्री आवश्यक पर्दछ। यद्यपि, यस्तो उच्च NP सांद्रताको उच्च चिपचिपापनले क्रमशः मौखिक प्रशासन र इंजेक्शन योग्य सूत्रहरूमा असुविधा र कठिनाई निम्त्याउँछ 22। यसको अतिरिक्त, इन्सुलिन NP हरू ट्याब्लेट र चिपचिपा बायोफिल्महरू बनाउन पनि प्रयोग गर्न सकिन्छ 23, 24, जसलाई कम लोडिङ स्तरहरूमा ठूलो मात्रामा NP हरूको प्रयोग आवश्यक पर्दछ, जसको परिणामस्वरूप ठूला ट्याब्लेटहरू र बाक्लो बायोफिल्महरू हुन्छन् जुन मौखिक अनुप्रयोगहरूको लागि उपयुक्त हुँदैनन्। त्यसकारण, उच्च इन्सुलिन भार भएका निर्जलित NP हरू अत्यधिक वांछनीय छन्। हाम्रा नतिजाहरूले सुझाव दिन्छन् कि म्यानिटोल-मुक्त स्प्रे-सुक्खा NP हरूको उच्च इन्सुलिन भारले यी वैकल्पिक डेलिभरी विधिहरूको लागि धेरै आकर्षक फाइदाहरू प्रदान गर्न सक्छ।
सबै निर्जलित NP हरूलाई तीन महिनाको लागि फ्रिजमा राखिएको थियो। SEM नतिजाहरूले देखाएको छ कि तीन महिनाको भण्डारणको समयमा सबै निर्जलित NP हरूको आकारविज्ञानमा उल्लेखनीय परिवर्तन भएन (चित्र ४)। पानीमा पुनर्गठन पछि, सबै NP हरूले EE मा थोरै कमी देखाए र तीन महिनाको भण्डारण अवधिमा लगभग थोरै मात्रामा (~५%) इन्सुलिन जारी गरे (तालिका २)। यद्यपि, सबै न्यानोपार्टिकल्सको औसत कण आकार बढ्यो। म्यानिटोल बिना स्प्रे-ड्राई गरिएको NP हरूको कण आकार ५२५ nm मा बढ्यो, जबकि म्यानिटोल सहित स्प्रे-ड्राई र फ्रिज-ड्राई गरिएको NP हरूको कण आकार क्रमशः ८७२ र ९२१ nm मा बढ्यो (तालिका २)।
तीन महिनासम्म भण्डारण गरिएका विभिन्न डिहाइड्रेटेड इन्सुलिन NPs को आकारविज्ञान: (क) म्यानिटोल भएको लियोफिलाइज्ड इन्सुलिन NPs को SEM छवि; (ख) म्यानिटोल बिना स्प्रे-ड्राईड इन्सुलिन न्यानोपार्टिकल्सको SEM छवि; (ग) म्यानिटोल बिना स्प्रे-ड्राईड इन्सुलिन NPs को SEM छवि।
यसबाहेक, पुनर्गठित इन्सुलिन न्यानोपार्टिकल्सलाई स्प्रे-ड्राई म्यानिटोल र फ्रिज-ड्राई (चित्र S2) मा अवक्षेपणहरू देखिए। यो ठूला कणहरू पानीमा राम्ररी निलम्बित नभएको कारणले हुन सक्छ। माथिका सबै परिणामहरूले स्प्रे सुकाउने प्रविधिले इन्सुलिन न्यानोपार्टिकल्सलाई निर्जलीकरणबाट जोगाउन सक्छ र इन्सुलिन न्यानोपार्टिकल्सको उच्च लोडिङ कुनै पनि फिलर वा क्रायोप्रोटेक्टेन्ट बिना प्राप्त गर्न सकिन्छ भनेर देखाउँछ।
डिहाइड्रेसन पछि इन्जाइम्याटिक पाचन विरुद्ध NPs को सुरक्षात्मक क्षमता प्रदर्शन गर्न pH = 2.5 माध्यममा पेप्सिन, ट्रिप्सिन र α-काइमोट्रिप्सिनको साथ इन्सुलिन रिटेन्सन परीक्षण गरिएको थियो। डिहाइड्रेटेड NPs को इन्सुलिन रिटेन्सनलाई भर्खरै तयार पारिएको NPs सँग तुलना गरिएको थियो, र नि:शुल्क इन्सुलिनलाई नकारात्मक नियन्त्रणको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो। यस अध्ययनमा, नि:शुल्क इन्सुलिनले तीनवटै इन्जाइम्याटिक उपचारहरूमा 4 घण्टा भित्र द्रुत इन्सुलिन उन्मूलन देखायो (चित्र 5a–c)। यसको विपरित, म्यानिटोलसँग फ्रिज-ड्राइ गरिएको NPs र म्यानिटोल बिना स्प्रे-ड्राइ गरिएको NPs को इन्सुलिन उन्मूलन परीक्षणले इन्जाइम्याटिक पाचन विरुद्ध यी NPs को उल्लेखनीय रूपमा उच्च सुरक्षा देखायो, जुन भर्खरै तयार पारिएको इन्सुलिन NPs जस्तै थियो (चित्र 1)। 5a–c)। पेप्सिन, ट्रिप्सिन र α-काइमोट्रिप्सिनमा न्यानोपार्टिकल्सको मद्दतले, क्रमशः 50%, 60%, र 75% भन्दा बढी इन्सुलिनलाई 4 घण्टा भित्र सुरक्षित गर्न सकिन्छ (चित्र 5a–c)। यो इन्सुलिन-सुरक्षा क्षमताले रक्तप्रवाहमा उच्च इन्सुलिन अवशोषणको सम्भावना बढाउन सक्छ25। यी नतिजाहरूले सुझाव दिन्छ कि म्यानिटोलसँग वा बिना स्प्रे सुकाउने र म्यानिटोलसँग फ्रिज-सुकाउनेले निर्जलीकरण पछि NPs को इन्सुलिन-सुरक्षा क्षमतालाई सुरक्षित राख्न सक्छ।
डिहाइड्रेटेड इन्सुलिन NPs को संरक्षण र रिलीज व्यवहार: (a) पेप्सिन घोलमा इन्सुलिनको सुरक्षा; (b) ट्रिप्सिन घोलमा इन्सुलिनको सुरक्षा; (c) α-काइमोट्रिप्सिन घोलद्वारा इन्सुलिनको सुरक्षा; (d) pH = 2.5 घोलमा डिहाइड्रेटेड NPs को रिलीज व्यवहार; (e) pH = 6.6 घोलमा डिहाइड्रेटेड NPs को रिलीज व्यवहार; (f) pH = 7.0 घोलमा डिहाइड्रेटेड NPs को रिलीज व्यवहार।
इन्सुलिन प्रतिरोधमा इन्सुलिनको प्रभावको जाँच गर्न, भर्खरै तयार पारिएको र पुनर्गठित सुख्खा इन्सुलिन NP हरूलाई पेट, डुओडेनम र माथिल्लो सानो आन्द्राको pH वातावरण अनुकरण गर्दै ३७ डिग्री सेल्सियसमा विभिन्न बफरहरू (pH = २.५, ६.६, ७.०) मा इन्क्युबेट गरिएको थियो। विभिन्न वातावरणमा रिलिज व्यवहार। जठरांत्र पथको अंश। pH = 2.5 मा, इन्सुलिन-लोड गरिएका NPs र रिजोल्युबिलाइज्ड ड्राई इन्सुलिन NPs ले पहिलो एक घण्टा भित्र प्रारम्भिक फट रिलिज देखायो, त्यसपछि अर्को 5 घण्टामा ढिलो रिलिज भयो (चित्र 5d)। सुरुमा यो द्रुत रिलिज सम्भवतः कणको आन्तरिक संरचनामा पूर्ण रूपमा स्थिर नभएका प्रोटीन अणुहरूको द्रुत सतह डिसोर्प्शनको परिणाम हो। pH = 6.5 मा, इन्सुलिन-लोड गरिएका NPs र पुनर्गठित ड्राई इन्सुलिन NPs ले 6 घण्टामा सहज र ढिलो रिलिज देखायो, किनकि परीक्षण समाधानको pH NPs-तयार गरिएको घोल (चित्र 5e) जस्तै थियो। pH = 7 मा, NPs अस्थिर थिए र पहिलो दुई घण्टा भित्र लगभग पूर्ण रूपमा विघटित भए (चित्र 5f)। यो किनभने chitosan को deprotonation उच्च pH मा हुन्छ, जसले कम कम्प्याक्ट पोलिमर नेटवर्क र लोड गरिएको इन्सुलिनको रिलिजमा परिणाम दिन्छ।
यसबाहेक, म्यानिटोल बिना स्प्रे-सुकाइएका इन्सुलिन NPs ले अन्य निर्जलित NPs (चित्र 5d–f) भन्दा छिटो रिलीज प्रोफाइल देखायो। पहिले वर्णन गरिएझैं, म्यानिटोल बिना सुकाइएका पुनर्गठित इन्सुलिन NPs ले सबैभन्दा सानो कण आकार देखायो। साना कणहरूले ठूलो सतह क्षेत्र प्रदान गर्दछ, त्यसैले धेरैजसो सान्दर्भिक औषधि कण सतहमा वा नजिक हुनेछ, जसको परिणामस्वरूप द्रुत औषधि रिलीज हुनेछ।
NPs को साइटोटोक्सिसिटी MTT परख द्वारा अनुसन्धान गरिएको थियो। चित्र S4 मा देखाइए अनुसार, सबै निर्जलित NPs ले 50-500 μg/ml को सांद्रतामा कोशिका व्यवहार्यतामा कुनै महत्त्वपूर्ण प्रभाव पारेको पाइएन, जसले सुझाव दिन्छ कि सबै निर्जलित NPs लाई चिकित्सीय विन्डोमा पुग्न सुरक्षित रूपमा प्रयोग गर्न सकिन्छ।
कलेजो मुख्य अंग हो जसको माध्यमबाट इन्सुलिनले आफ्नो शारीरिक कार्यहरू गर्दछ।HepG2 कोषहरू मानव हेपाटोमा कोष लाइन हो जुन सामान्यतया इन भिट्रो हेपाटोसाइट अपटेक मोडेलको रूपमा प्रयोग गरिन्छ। यहाँ, फ्रिज-ड्राइङ र स्प्रे-ड्राइङ विधिहरू प्रयोग गरेर निर्जलित NPs को सेलुलर अपटेक मूल्याङ्कन गर्न HepG2 कोषहरू प्रयोग गरिएको थियो। 25 μg/mL को सांद्रतामा नि:शुल्क FITC इन्सुलिनको साथ धेरै घण्टाको इन्क्युबेशन पछि फ्लो साइटोमेट्री र दृष्टि प्रयोग गरेर कन्फोकल लेजर स्क्यानिङद्वारा कोशिका अपटेक, भर्खरै तयार गरिएको FITC इन्सुलिन-लोड गरिएको NPs र समान इन्सुलिन सांद्रतामा निर्जलित FITC इन्सुलिन-लोड गरिएको NPs मात्रात्मक माइक्रोस्कोपी (CLSM) अवलोकनहरू प्रदर्शन गरियो। म्यानिटोल बिना लियोफिलाइज्ड NPs निर्जलीकरणको समयमा नष्ट गरियो र यस परीक्षणमा मूल्याङ्कन गरिएको थिएन। भर्खरै तयार गरिएको इन्सुलिन-लोड गरिएको NPs, म्यानिटोल सहित लियोफिलाइज्ड NPs, र म्यानिटोल बिना र बिना स्प्रे-ड्राइन्ड NPs (चित्र 6a) को इन्ट्रासेल्युलर फ्लोरोसेन्स तीव्रता 4.3, 2.6 थियो, २.४, र ४.१-गुणा बढी। FITC-इन्सुलिन समूह, क्रमशः (चित्र ६ख)। यी नतिजाहरूले सुझाव दिन्छ कि एन्क्याप्सुलेटेड इन्सुलिन फ्री इन्सुलिन भन्दा सेलुलर अपटेकमा बढी शक्तिशाली हुन्छ, मुख्यतया अध्ययनमा उत्पादन गरिएको इन्सुलिन-लोड गरिएको न्यानोपार्टिकल्सको सानो आकारको कारणले।
भर्खरै तयार पारिएको NPs र डिहाइड्रेटेड NPs सँग ४ घण्टा इन्क्युबेशन पछि HepG2 कोषको अपटेक: (a) HepG2 कोषहरूद्वारा FITC-इन्सुलिन अपटेकको वितरण। (b) फ्लो साइटोमेट्री (n = 3) द्वारा विश्लेषण गरिएको फ्लोरोसेन्स तीव्रताको ज्यामितीय माध्य, *P < ०.०५ नि:शुल्क इन्सुलिनको तुलनामा।
त्यस्तै गरी, CLSM छविहरूले देखाएको छ कि भर्खरै तयार पारिएका FITC-इन्सुलिन-लोडेड NPs र FITC-इन्सुलिन-लोडेड स्प्रे-ड्राईड NPs (म्यानिटोल बिना) को FITC फ्लोरोसेन्स तीव्रता अन्य नमूनाहरू भन्दा धेरै बलियो थियो (चित्र 6a)। यसबाहेक, म्यानिटोल थपिएसँगै, घोलको उच्च चिपचिपाहटले सेलुलर अपटेकको प्रतिरोध बढायो, जसको परिणामस्वरूप इन्सुलिन प्रसार घट्यो। यी नतिजाहरूले सुझाव दिन्छ कि म्यानिटोल-मुक्त स्प्रे-ड्राईड NPs ले उच्चतम सेलुलर अपटेक दक्षता प्रदर्शन गर्‍यो किनभने तिनीहरूको कण आकार पुन: विघटन पछि फ्रिज-ड्राईड NPs भन्दा सानो थियो।
चिटोसन (औसत आणविक तौल १०० केडीए, ७५–८५% डिएसिटाइलेटेड) सिग्मा-एल्ड्रिचबाट खरिद गरिएको थियो। (ओकभिल, ओन्टारियो, क्यानडा)। सोडियम ट्राइपोलिफोस्फेट (टीपीपी) VWR (राडनोर, पेन्सिलभेनिया, संयुक्त राज्य अमेरिका) बाट खरिद गरिएको थियो। यस अध्ययनमा प्रयोग गरिएको पुनः संयोजक मानव इन्सुलिन फिशर साइन्टिफिक (वालथम, एमए, संयुक्त राज्य अमेरिका) बाट प्राप्त गरिएको थियो। फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (FITC)-लेबल गरिएको मानव इन्सुलिन र ४′,६-डायमिडिनो-२-फेनिलिन्डोल डाइहाइड्रोक्लोराइड (DAPI) सिग्मा-एल्ड्रिचबाट खरिद गरिएको थियो। (ओकभिल, ओन्टारियो, क्यानडा)। हेपजी२ सेल लाइन एटीसीसी (मानासास, भर्जिनिया, संयुक्त राज्य अमेरिका) बाट प्राप्त गरिएको थियो। अन्य सबै अभिकर्मकहरू विश्लेषणात्मक वा क्रोमेटोग्राफिक ग्रेड थिए।
०.१% एसिटिक एसिड भएको डबल डिस्टिल्ड वाटर (DD वाटर) मा घोलेर १ मिलीग्राम/मिली CS घोल तयार गर्नुहोस्। TPP र इन्सुलिनको १ मिलीग्राम/मिली घोललाई क्रमशः DD पानी र ०.१% एसिटिक एसिडमा घोलेर तयार गर्नुहोस्। प्रि-इमल्सन पोलिट्रोन PCU-2-110 हाई स्पीड होमोजिनाइजर (ब्रिंकम्यान इन्ड। वेस्टबरी, NY, USA) को साथ तयार गरिएको थियो। तयारी प्रक्रिया निम्नानुसार छ: पहिले, ४ मिली इन्सुलिन घोलमा २ मिली TPP घोल थपिन्छ, र मिश्रणलाई ३० मिनेटको लागि चलाइन्छ र पूर्ण रूपमा मिसाइन्छ। त्यसपछि, मिश्रित घोललाई उच्च-गतिको हलचल (१०,००० rpm) अन्तर्गत सिरिन्ज मार्फत CS घोलमा ड्रपवाइज थपियो। मिश्रणहरूलाई ३० मिनेटको लागि बरफको बाथमा उच्च-गतिको हलचल (१५,००० rpm) अन्तर्गत राखिएको थियो, र क्रस-लिङ्क गरिएको इन्सुलिन NPs प्राप्त गर्न तिनीहरूलाई निश्चित pH मा समायोजन गरिएको थियो। इन्सुलिनको कण आकारलाई थप एकरूप बनाउन र घटाउन। NPs, तिनीहरूलाई प्रोब-प्रकारको सोनिकेटर (UP 200ST, Hielscher अल्ट्रासोनिक्स, Teltow, जर्मनी) प्रयोग गरेर आइस बाथमा थप 30 मिनेटको लागि सोनिकेट गरिएको थियो।
इन्सुलिन NPS लाई २५°C मा DD पानीमा पातलो पारेर Litesizer 500 (Anton Par, Graz, Austria) प्रयोग गरेर गतिशील प्रकाश स्क्याटरिङ (DLS) मापन प्रयोग गरेर Z-औसत व्यास, पोलिडिस्पर्सिटी इन्डेक्स (PDI) र zeta क्षमताको लागि परीक्षण गरिएको थियो। आकार विज्ञान र आकार वितरणलाई Hitachi H7600 ट्रान्समिशन इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोप (TEM) (Hitachi, टोकियो, जापान) द्वारा विशेषता गरिएको थियो, र पछि Hitachi इमेजिङ सफ्टवेयर (Hitachi, टोकियो, जापान) प्रयोग गरेर छविहरूको विश्लेषण गरिएको थियो। इन्सुलिन NPs को encapsulation दक्षता (EE) र लोडिङ क्षमता (LC) को मूल्याङ्कन गर्न, NPs लाई १०० kDa को आणविक वजन कट-अफको साथ अल्ट्राफिल्ट्रेसन ट्यूबहरूमा पाइपेट गरिएको थियो र ३० मिनेटको लागि ५०० xg मा सेन्ट्रीफ्यूज गरिएको थियो। फिल्टरमा अनएनक्याप्सुलेटेड इन्सुलिनलाई Agilent 1100 Series HPLC प्रणाली (Agilent, Santa Clara, क्यालिफोर्निया, USA) प्रयोग गरेर परिमाण गरिएको थियो जसमा a क्वाटरनरी पम्प, अटोस्याम्पलर, स्तम्भ हीटर, र DAD डिटेक्टर। इन्सुलिनलाई C18 स्तम्भ (Zorbax, 3.5 μm, 4.6 mm × 150 mm, Agilent, USA) द्वारा विश्लेषण गरिएको थियो र 214 nm मा पत्ता लगाइएको थियो। मोबाइल चरण एसिटोनिट्राइल र पानी थियो, जसमा 0.1% TFA थियो, ग्रेडियन्ट अनुपात 10/90 देखि 100/0 सम्म थियो, र 10 मिनेटको लागि चलाइएको थियो। मोबाइल चरण 1.0 ml/min को प्रवाह दरमा पम्प गरिएको थियो। स्तम्भ तापमान 20 °C मा सेट गरिएको थियो। समीकरणहरू प्रयोग गरेर EE र LC को प्रतिशत गणना गर्नुहोस्।(1) र समीकरण (2)।
इन्सुलिन NP लाई अनुकूलन गर्न २.० देखि ४.० सम्मका विभिन्न CS/इन्सुलिन अनुपातहरू परीक्षण गरिएका थिए। तयारीको क्रममा विभिन्न मात्रामा CS घोल थपिएको थियो, जबकि इन्सुलिन/TPP मिश्रणलाई स्थिर राखिएको थियो। सबै घोलहरू (इन्सुलिन, TPP र CS) थपेपछि मिश्रणको pH लाई सावधानीपूर्वक नियन्त्रण गरेर इन्सुलिन NP हरूलाई ४.० देखि ६.५ को pH दायरामा तयार पारिएको थियो। इन्सुलिन NP हरूको गठनलाई अनुकूलन गर्न इन्सुलिन न्यानोपार्टिकल्सको EE र कण आकारलाई विभिन्न pH मानहरू र CS/इन्सुलिन द्रव्यमान अनुपातहरूमा मूल्याङ्कन गरिएको थियो।
अनुकूलित इन्सुलिन NP हरूलाई एल्युमिनियम कन्टेनरमा राखिएको थियो र केही टेपले कसिएको टिस्युले ढाकिएको थियो। त्यसपछि, स्क्रू गरिएका कन्टेनरहरूलाई ट्रे ड्रायरले सुसज्जित ल्याबकोन्को फ्रीजोन फ्रिज ड्रायर (ल्याबकोन्को, क्यान्सस सिटी, MO, USA) मा राखिएको थियो। सुख्खा इन्सुलिन NP हरू प्राप्त गर्न तापक्रम र भ्याकुम प्रेसर -१० °C, पहिलो २ घण्टाको लागि ०.३५० टोर, र २४ घण्टाको बाँकी २२ घण्टाको लागि ० °C र ०.१२० टोरमा सेट गरिएको थियो।
बुची मिनी स्प्रे ड्रायर B-290 (BÜCHI, Flawil, Switzerland) लाई इनक्याप्सुलेटेड इन्सुलिन उत्पादन गर्न प्रयोग गरिएको थियो। चयन गरिएका सुकाउने प्यारामिटरहरू थिए: तापक्रम १०० डिग्री सेल्सियस, फिड फ्लो ३ लिटर/मिनेट, र ग्यास फ्लो ४ लिटर/मिनेट।
डिहाइड्रेसन अघि र पछिको इन्सुलिन NPs लाई FTIR-ATR स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रयोग गरेर चित्रण गरिएको थियो। डिहाइड्रेटेड न्यानोपार्टिकल्स साथै फ्री इन्सुलिन र चिटोसनलाई स्पेक्ट्रम १०० FTIR स्पेक्ट्रोफोटोमिटर (पर्किनएल्मर, वाल्थम, म्यासाचुसेट्स, संयुक्त राज्य अमेरिका) प्रयोग गरेर विश्लेषण गरिएको थियो जुन एक विश्वव्यापी ATR नमूना सहायक उपकरण (पर्किनएल्मर, वाल्थम, म्यासाचुसेट्स, संयुक्त राज्य अमेरिका) ले सुसज्जित थियो। ४०००-६०० cm2 को फ्रिक्वेन्सी दायरामा ४ cm2 को रिजोल्युसनमा १६ स्क्यानहरूबाट सिग्नल औसत प्राप्त गरिएको थियो।
हेलियोस नानोल्याब ६५० फोकस्ड आयन बीम-स्क्यानिङ इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोप (FIB-SEM) (FEI, हिल्सबोरो, ओरेगन, संयुक्त राज्य अमेरिका) द्वारा खिचिएका फ्रिज-ड्राईड र स्प्रे-ड्राईड इन्सुलिन NPs को SEM छविहरू द्वारा ड्राई इन्सुलिन NPs को आकारविज्ञानको मूल्याङ्कन गरिएको थियो। प्रयोग गरिएको मुख्य प्यारामिटर भोल्टेज ५ केभी र वर्तमान ३० एमए थियो।
सबै डिहाइड्रेटेड इन्सुलिन NP हरूलाई dd पानीमा पुन: घुलनशील बनाइयो। डिहाइड्रेटेड पछि तिनीहरूको गुणस्तर मूल्याङ्कन गर्न पहिले उल्लेख गरिएको उही विधि प्रयोग गरेर कण आकार, PDI, EE र LC पुन: परीक्षण गरियो। लामो समयसम्म भण्डारण पछि NP हरूको गुणहरू परीक्षण गरेर एनहाइड्रोइन्सुलिन NP हरूको स्थिरता पनि मापन गरिएको थियो। यस अध्ययनमा, डिहाइड्रेटेड पछि सबै NP हरूलाई तीन महिनाको लागि फ्रिजमा भण्डारण गरिएको थियो। तीन महिनाको भण्डारण पछि, NP हरूलाई मोर्फोलॉजिकल कण आकार, PDI, EE र LC को लागि परीक्षण गरिएको थियो।
निर्जलीकरण पछि NP हरूलाई बचाउन इन्सुलिनको प्रभावकारिताको मूल्याङ्कन गर्न सिमुलेटेड ग्यास्ट्रिक फ्लुइड (pH १.२, १% पेप्सिन भएको), आन्द्राको तरल पदार्थ (pH ६.८, १% ट्रिप्सिन भएको) वा काइमोट्रिप्सिन घोल (१०० ग्राम/मिली, फस्फेट बफरमा, pH ७.८) भएको ४५ एमएलमा ५ एमएल पुनर्गठित NP हरू घोल्नुहोस्। तिनीहरूलाई १०० आरपीएमको आन्दोलन गतिको साथ ३७°C मा इन्क्युबेट गरिएको थियो। घोलको ५०० μL विभिन्न समय बिन्दुहरूमा सङ्कलन गरिएको थियो र HPLC द्वारा इन्सुलिन सांद्रता निर्धारण गरिएको थियो।
भर्खरै तयार पारिएका र निर्जलित इन्सुलिन NPs को इन भिट्रो रिलिज व्यवहार डायलाइसिस ब्याग विधि (आणविक तौल कट-अफ १०० kDa, स्पेक्ट्रा पोर इंक) द्वारा परीक्षण गरिएको थियो। पेट, डुओडेनम र माथिल्लो सानो आन्द्राको pH वातावरण अनुकरण गर्न क्रमशः pH 2.5, pH 6.6, र pH 7.0 (0.1 M फस्फेट-बफर गरिएको सलाइन, PBS) मा तरल पदार्थमा भर्खरै तयार पारिएका र पुनर्गठित सुख्खा NPs लाई डायलाइसिस गरिएको थियो। सबै नमूनाहरू २०० rpm मा निरन्तर हल्लाइरहँदै ३७ °C मा इन्क्युबेट गरिएको थियो। निम्न समयमा ५ एमएल डायलाइसिस ब्याग बाहिर तरल पदार्थलाई एस्पिरेट गर्नुहोस्: ०.५, १, २, ३, ४, र ६ घण्टा, र तुरुन्तै ताजा डायलाइसेटले भोल्युम भर्नुहोस्। HPLC द्वारा तरल पदार्थमा इन्सुलिन प्रदूषणको विश्लेषण गरिएको थियो, र न्यानोपार्टिकल्सबाट इन्सुलिन रिलिजको दर न्यानोपार्टिकल्समा इनक्याप्सुलेट गरिएको कुल इन्सुलिनमा निस्कने फ्री इन्सुलिनको अनुपातबाट गणना गरिएको थियो (समीकरण ३)।
मानव हेपाटोसेलुलर कार्सिनोमा सेल लाइन HepG2 कोषहरू Dulbecco को परिमार्जित ईगलको माध्यम (DMEM) प्रयोग गरेर ६० मिमी व्यासका भाँडाहरूमा हुर्काइएका थिए जसमा १०% भ्रूण गोवाइन सीरम, १०० IU/mL पेनिसिलिन, र १०० μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन थियो। संस्कृतिहरू ३७°C, ९५% सापेक्षिक आर्द्रता, र ५% CO2 मा कायम राखिएका थिए। अपटेक परीक्षणहरूको लागि, HepG2 कोषहरूलाई ८-वेल ननक ल्याब-टेक चेम्बर स्लाइड प्रणाली (थर्मो फिशर, NY, USA) मा १ × १०५ कोष/मिलीमा सिड गरिएको थियो। साइटोटोक्सिसिटी परीक्षणहरूको लागि, तिनीहरूलाई ५ × १०४ कोष/मिलीको घनत्वमा ९६-वेल प्लेटहरू (कोर्निङ, NY, USA) मा सिड गरिएको थियो।
भर्खरै तयार पारिएको र निर्जलित इन्सुलिन NPs30 को साइटोटोक्सिसिटी मूल्याङ्कन गर्न MTT परख प्रयोग गरिएको थियो। HepG2 कोषहरूलाई ५ × १०४ कोष/मिली घनत्वमा ९६-वेल प्लेटहरूमा सिड गरिएको थियो र परीक्षण गर्नुअघि ७ दिनसम्म कल्चर गरिएको थियो। इन्सुलिन NPs लाई कल्चर माध्यममा विभिन्न सांद्रता (५० देखि ५०० μg/मिली) मा पातलो पारिएको थियो र त्यसपछि कोषहरूमा प्रशासित गरिएको थियो। २४ घण्टाको इन्क्युबेशन पछि, कोषहरूलाई PBS ले ३ पटक धोइयो र थप ४ घण्टाको लागि ०.५ मिलीग्राम/मिली MTT भएको माध्यमले इन्क्युबेट गरिएको थियो। Tecan infinite M200 pro spectrophotometer प्लेट रिडर (Tecan, Männedorf, Switzerland) प्रयोग गरेर ५७० nm मा पहेंलो टेट्राजोलियम MTT लाई बैजनी फर्माजानमा इन्जाइम्याटिक कमी मापन गरेर साइटोटोक्सिसिटी मूल्याङ्कन गरिएको थियो।
NPs को सेलुलर अपटेक दक्षता कन्फोकल लेजर स्क्यानिङ माइक्रोस्कोपी र फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण द्वारा परीक्षण गरिएको थियो। Nunc Lab-Tek चेम्बर स्लाइड प्रणालीको प्रत्येक इनारलाई नि:शुल्क FITC-इन्सुलिन, FITC-इन्सुलिन-लोडेड NPs ले उपचार गरिएको थियो, र समान सांद्रतामा 25 μg/mL डिहाइड्रेटेड FITC-इन्सुलिन NPs को पुनर्गठन गरिएको थियो र 4 घण्टाको लागि इन्क्युबेट गरिएको थियो। कोषहरू PBS सँग 3 पटक धोइएका थिए र 4% प्याराफर्मल्डिहाइडले फिक्स गरिएका थिए। न्यूक्लीलाई 4′,6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल (DAPI) ले दाग लगाइएको थियो। ओलम्पस FV1000 लेजर स्क्यानिङ/टु-फोटोन कन्फोकल माइक्रोस्कोप (ओलम्पस, शिन्जुकु सिटी, टोकियो, जापान) प्रयोग गरेर इन्सुलिन स्थानीयकरण अवलोकन गरिएको थियो। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषणको लागि, 10 μg/mL फ्री FITC-इन्सुलिन, FITC-इन्सुलिन-लोडेड NPs, र रिसोलुबिलाइज्ड डिहाइड्रेटेड FITC-इन्सुलिन NPs को समान सांद्रता थपिएको थियो। ९६ वटा इनहेल प्लेटहरूलाई HepG2 कोषहरूद्वारा सिड गरिएको थियो र ४ घण्टाको लागि इन्क्युबेट गरिएको थियो। ४ घण्टा इन्क्युबेट पछि, कोषहरूलाई हटाइयो र FBS ले ३ पटक धोइयो। प्रति नमूना ५ × १०४ कोषहरूलाई BD LSR II फ्लो साइटोमिटर (BD, फ्र्याङ्कलिन लेक्स, न्यू जर्सी, संयुक्त राज्य अमेरिका) द्वारा विश्लेषण गरिएको थियो।
सबै मानहरू औसत ± मानक विचलनको रूपमा व्यक्त गरिन्छ। सबै समूहहरू बीचको तुलनालाई एकतर्फी ANOVA वा IBM SPSS तथ्याङ्क 26 द्वारा Mac (IBM, Endicott, New York, USA) को लागि t-परीक्षण प्रयोग गरेर मूल्याङ्कन गरिएको थियो र p < 0.05 लाई तथ्याङ्कीय रूपमा महत्त्वपूर्ण मानिएको थियो।
यस अध्ययनले बल्किङ एजेन्ट वा क्रायोप्रोटेक्टेन्ट क्षमता र उच्च भार क्षमता प्रयोग गरेर मानक फ्रिज-ड्राइङ विधिहरूको तुलनामा राम्रो पुनर्गठनको साथ क्रस-लिङ्क गरिएको चिटोसन/टीपीपी/इन्सुलिन न्यानोपार्टिकल्सलाई डिहाइड्रेट गर्न स्प्रे ड्राइङको लचिलोपन र क्षमता प्रदर्शन गर्दछ। अनुकूलित इन्सुलिन न्यानोपार्टिकल्सले औसत कण आकार ३१८ एनएम र ९९.४% को इन्क्याप्सुलेशन दक्षता प्राप्त गर्‍यो। निर्जलीकरण पछि SEM र FTIR नतिजाहरूले देखाए कि गोलाकार संरचना केवल स्प्रे-ड्राइन्ड एनपीहरूमा म्यानिटोलको साथ र बिना र म्यानिटोलको साथ लियोफिलाइज गरिएको थियो, तर म्यानिटोल बिना लियोफिलाइज्ड एनपीहरू निर्जलीकरणको समयमा विघटित भएका थिए। पुनर्गठन क्षमता परीक्षणमा, म्यानिटोल बिना स्प्रे-ड्राइन्ड इन्सुलिन न्यानोपार्टिकल्सले सबैभन्दा सानो औसत कण आकार र पुनर्गठनमा उच्चतम लोडिंग देखायो। यी सबै निर्जलित एनपीहरूको रिलीज व्यवहारले देखायो कि तिनीहरू pH = 2.5 र pH = 7 को समाधानमा द्रुत रूपमा रिलीज भएका थिए, र pH = 6.5 को समाधानमा धेरै स्थिर थिए। अन्य पुन: घुलनशील निर्जलित NPs को तुलनामा, NPs म्यानिटोल बिना स्प्रे-ड्राई गरिएकोले सबैभन्दा छिटो रिलीज देखायो। यो नतिजा सेलुलर अपटेक परखमा अवलोकन गरिएकोसँग मिल्दोजुल्दो छ, किनकि म्यानिटोलको अनुपस्थितिमा स्प्रे-ड्राई गरिएको NPs ले भर्खरै तयार पारिएको NPs को सेलुलर अपटेक दक्षता लगभग पूर्ण रूपमा कायम राखेको थियो। यी नतिजाहरूले सुझाव दिन्छ कि म्यानिटोल-मुक्त स्प्रे सुकाउने द्वारा तयार पारिएको सुख्खा इन्सुलिन न्यानोपार्टिकल्स अन्य निर्जल खुराक रूपहरू, जस्तै मौखिक ट्याब्लेट वा बायोएडेसिभ फिल्महरूमा थप प्रशोधनको लागि सबैभन्दा उपयुक्त छन्।
बौद्धिक सम्पत्ति समस्याहरूको कारणले गर्दा, हालको अध्ययनको क्रममा उत्पन्न र/वा विश्लेषण गरिएका डेटासेटहरू सार्वजनिक रूपमा उपलब्ध छैनन्, तर उचित अनुरोधमा सम्बन्धित लेखकहरूबाट उपलब्ध छन्।
कागन, ए. टाइप २ मधुमेह: सामाजिक र वैज्ञानिक उत्पत्ति, चिकित्सा जटिलताहरू, र बिरामीहरू र अरूहरूका लागि प्रभावहरू। (म्याकफार्लेन, २००९)।
सिंह, एपी, गुओ, वाई., सिंह, ए., झी, डब्ल्यू. र जियाङ, पी. इन्सुलिन इन्क्याप्सुलेशनको विकास: के मौखिक प्रशासन अब सम्भव छ? जे. फार्मेसी.बायो-फार्मेसी.रिजर्भोयर.१, ७४–९२ (२०१९)।
वोङ, सीवाई, अल-सलामी, एच. र दास, सीआर मधुमेहको उपचारको लागि मौखिक इन्सुलिन-लोडेड लिपोसोम डेलिभरी प्रणालीमा हालैका प्रगतिहरू। व्याख्या। जे. फार्मेसी।५४९, २०१–२१७ (२०१८)।