Nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद। तपाईंले प्रयोग गरिरहनुभएको ब्राउजरको संस्करणमा सीमित CSS समर्थन छ। उत्कृष्ट परिणामहरूको लागि, हामी तपाईंलाई आफ्नो ब्राउजरको नयाँ संस्करण प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड असक्षम पार्नुहोस्)। यसैबीच, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी स्टाइलिङ वा जाभास्क्रिप्ट बिना साइट देखाउँदैछौं।
प्रोपियोनिक एसिड (PPA) अटिजम स्पेक्ट्रम डिसअर्डर जस्ता न्यूरोडेभलपमेन्टल विकारहरूमा माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शनको भूमिका अध्ययन गर्न प्रयोग गरिन्छ। PPA ले माइटोकोन्ड्रियल बायोजेनेसिस, मेटाबोलिज्म र टर्नओभरलाई बाधा पुर्‍याउन जानिन्छ। यद्यपि, यी संयन्त्रहरूको जटिल अस्थायी प्रकृतिको कारणले माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलता, विखंडन र फ्यूजनमा PPA को प्रभाव समस्याग्रस्त रहन्छ। यहाँ, हामी न्यूरोन-जस्तो SH-SY5Y कोशिकाहरूमा PPA ले माइटोकोन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर, आकारविज्ञान र गतिशीलतालाई कसरी असर गर्छ भनेर अनुसन्धान गर्न पूरक मात्रात्मक इमेजिङ प्रविधिहरू प्रयोग गर्छौं। PPA (5 mM) ले माइटोकोन्ड्रियल क्षेत्र (p < 0.01), फेरेट व्यास र परिधि (p < 0.05), र क्षेत्र 2 (p < 0.01) मा उल्लेखनीय कमी ल्यायो। माइटोकोन्ड्रियल घटना लोकेटर विश्लेषणले विखंडन र फ्यूजन घटनाहरूमा उल्लेखनीय वृद्धि (p < 0.05) देखायो, जसले गर्दा तनाव अवस्थाहरूमा माइटोकोन्ड्रियल नेटवर्कको अखण्डता कायम राख्यो। यसको अतिरिक्त, cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) र OPA1 (p < 0.05) को mRNA अभिव्यक्ति उल्लेखनीय रूपमा घटाइएको थियो। 01)। यसले तनाव अवस्थाहरूमा कार्य कायम राख्न माइटोकोन्ड्रियल आकारविज्ञान, जैविक उत्पत्ति र गतिशीलताको पुनर्निर्माणलाई चित्रण गर्दछ। हाम्रो डेटाले माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलतामा PPA को प्रभावहरूमा नयाँ अन्तर्दृष्टि प्रदान गर्दछ र माइटोकोन्ड्रियल तनाव प्रतिक्रियाहरूमा संलग्न जटिल नियामक संयन्त्रहरूको अध्ययनको लागि इमेजिङ प्रविधिहरूको उपयोगितालाई हाइलाइट गर्दछ।
माइटोकोन्ड्रिया ऊर्जा उत्पादन र जैव संश्लेषणमा आफ्नो विशिष्ट भूमिकाभन्दा बाहिर विभिन्न सेलुलर कार्यहरूमा अभिन्न सहभागी हुन्। माइटोकोन्ड्रिया मेटाबोलिज्म क्याल्सियम सिग्नलिङ, मेटाबोलिक र रेडक्स होमियोस्टेसिस, इन्फ्लेमेटरी सिग्नलिङ, एपिजेनेटिक परिमार्जन, कोशिका प्रसार, भिन्नता र प्रोग्राम गरिएको कोशिका मृत्युको प्रमुख नियामक हो। विशेष गरी, माइटोकोन्ड्रियल मेटाबोलिज्म न्यूरोनल विकास, अस्तित्व र कार्यको लागि महत्त्वपूर्ण छ र न्यूरोपैथोलोजीको विभिन्न अभिव्यक्तिहरूमा व्यापक रूपमा संलग्न छ2,3,4।
विगत एक दशकमा, मेटाबोलिक स्थिति न्यूरोजेनेसिस, भिन्नता, परिपक्वता र प्लास्टिसिटीको केन्द्रीय नियामकको रूपमा देखा परेको छ5,6। हालै, माइटोकोन्ड्रियल आकारविज्ञान र गतिशीलता माइटोसिसको विशेष रूपमा महत्त्वपूर्ण घटक बनेका छन्, एक गतिशील प्रक्रिया जसले कोषहरू भित्र स्वस्थ माइटोकोन्ड्रियाको पोखरी कायम राख्छ। माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलता माइटोकोन्ड्रियल बायोजेनेसिस र बायोएनर्जेटिक्सदेखि माइटोकोन्ड्रियल विखंडन, फ्यूजन, यातायात र क्लियरेन्स7,8 सम्मका जटिल अन्तरनिर्भर मार्गहरूद्वारा विनियमित हुन्छ। यी कुनै पनि एकीकृत संयन्त्रको अवरोधले स्वस्थ माइटोकोन्ड्रियल नेटवर्कहरूको मर्मतसम्भारलाई बाधा पुर्‍याउँछ र न्यूरोडेभलपमेन्टको लागि गहिरो कार्यात्मक परिणामहरू निम्त्याउँछ9,10। वास्तवमा, माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलताको डिसरेगुलेसन धेरै मनोचिकित्सा, न्यूरोडिजेनेरेटिभ र न्यूरोडेभलपमेन्टल विकारहरूमा अवलोकन गरिन्छ, जसमा अटिजम स्पेक्ट्रम डिसअर्डर (ASD)11,12 समावेश छ।
ASD एक जटिल आनुवंशिक र एपिजेनेटिक वास्तुकला भएको विषम न्यूरोडेभलपमेन्टल विकार हो। ASD को वंशानुगतता निर्विवाद छ, तर अन्तर्निहित आणविक एटियोलोजी अझै पनि राम्रोसँग बुझिएको छैन। प्रीक्लिनिकल मोडेलहरू, क्लिनिकल अध्ययनहरू, र बहु-ओमिक्स आणविक डेटासेटहरूबाट डेटा जम्मा गर्नाले ASD13,14 मा माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शनको बढ्दो प्रमाण प्रदान गर्दछ। हामीले पहिले ASD भएका बिरामीहरूको समूहमा जीनोम-वाइड DNA मेथिलेसन स्क्रिन प्रदर्शन गर्यौं र माइटोकोन्ड्रियल मेटाबोलिक मार्गहरू15 मा क्लस्टर गरिएका भिन्न रूपमा मिथाइलेटेड जीनहरू पहिचान गर्यौं। हामीले पछि माइटोकोन्ड्रियल बायोजेनेसिस र गतिशीलताको केन्द्रीय नियामकहरूको भिन्न मेथिलेसन रिपोर्ट गर्यौं, जुन ASD16 मा बढेको mtDNA प्रतिलिपि संख्या र परिवर्तन गरिएको मूत्र मेटाबोलिक प्रोफाइलसँग सम्बन्धित थियो। हाम्रो डेटाले बढ्दो प्रमाण प्रदान गर्दछ कि माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलता र होमियोस्टेसिसले ASD को प्याथोफिजियोलोजीमा केन्द्रीय भूमिका खेल्छ। त्यसकारण, माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलता, आकारविज्ञान, र प्रकार्य बीचको सम्बन्धको यान्त्रिक बुझाइ सुधार गर्नु माध्यमिक माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शन द्वारा विशेषता न्यूरोलोजिकल रोगहरूमा चलिरहेको अनुसन्धानको प्रमुख लक्ष्य हो।
माइटोकोन्ड्रियल तनाव प्रतिक्रियाहरूमा विशिष्ट जीनहरूको भूमिका अध्ययन गर्न आणविक प्रविधिहरू प्रायः प्रयोग गरिन्छ। यद्यपि, यो दृष्टिकोण माइटोटिक नियन्त्रण संयन्त्रहरूको बहुआयामिक र अस्थायी प्रकृतिद्वारा सीमित हुन सक्छ। यसबाहेक, माइटोकोन्ड्रियल जीनको विभेदक अभिव्यक्ति कार्यात्मक परिवर्तनहरूको अप्रत्यक्ष सूचक हो, विशेष गरी सीमित संख्यामा मात्र जीनहरूको विश्लेषण गरिन्छ। त्यसकारण, माइटोकोन्ड्रियल प्रकार्य र बायोएनर्जेटिक्स अध्ययन गर्न थप प्रत्यक्ष विधिहरू प्रस्ताव गरिएको छ17। माइटोकोन्ड्रियल आकारविज्ञान माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलतासँग नजिकबाट सम्बन्धित छ। माइटोकोन्ड्रियल आकार, जडान, र संरचना ऊर्जा उत्पादन र माइटोकोन्ड्रियल र कोशिका अस्तित्वको लागि महत्त्वपूर्ण छन्5,18। यसबाहेक, माइटोसिसका विभिन्न घटकहरूले माइटोकोन्ड्रियल आकारविज्ञानमा परिवर्तनहरूमा केन्द्रित हुन्छन्, जसले माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शनको उपयोगी अन्त्य बिन्दुको रूपमा काम गर्न सक्छ र पछिल्ला मेकानिस्टिक अध्ययनहरूको लागि आधार प्रदान गर्दछ।
माइटोकोन्ड्रियल आकारविज्ञानलाई ट्रान्समिशन इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोपी (TEM) प्रयोग गरेर प्रत्यक्ष रूपमा अवलोकन गर्न सकिन्छ, जसले सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चरको विस्तृत अध्ययन गर्न अनुमति दिन्छ। TEM ले कोष जनसंख्यामा जीन ट्रान्सक्रिप्शन, प्रोटीन अभिव्यक्ति वा माइटोकोन्ड्रियल कार्यात्मक प्यारामिटरहरूमा मात्र भर पर्नुको सट्टा व्यक्तिगत माइटोकोन्ड्रियलको रिजोलुसनमा माइटोकोन्ड्रियल क्रिस्टेको आकारविज्ञान, आकार र संरचनालाई प्रत्यक्ष रूपमा कल्पना गर्दछ। १७,१९,२०। थप रूपमा, TEM ले माइटोकोन्ड्रियल र अन्य अर्गानेलहरू, जस्तै एन्डोप्लाज्मिक रेटिकुलम र अटोफागोसोमहरू बीचको अन्तरक्रियाको अध्ययनलाई सहज बनाउँछ, जसले माइटोकोन्ड्रियल प्रकार्य र होमियोस्टेसिस २१,२२ मा प्रमुख भूमिका खेल्छ। यसरी, यसले विशिष्ट मार्गहरू वा जीनहरूमा ध्यान केन्द्रित गर्नु अघि माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शन अध्ययन गर्न TEM लाई राम्रो सुरुवात बिन्दु बनाउँछ। माइटोकोन्ड्रियल प्रकार्य न्यूरोपैथोलोजीसँग बढ्दो रूपमा सान्दर्भिक हुँदै जाँदा, इन भिट्रो न्यूरोनल मोडेलहरूमा माइटोकोन्ड्रियल आकारविज्ञान र गतिशीलता प्रत्यक्ष र मात्रात्मक रूपमा अध्ययन गर्न सक्षम हुनु स्पष्ट आवश्यकता छ।
यस लेखमा, हामी अटिजम स्पेक्ट्रम डिसअर्डरमा माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शनको न्यूरोनल मोडेलमा माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलताको जाँच गर्छौं। हामीले पहिले ASD15 मा प्रोपियोनिल-CoA कार्बोक्सिलेज बीटा (PCCB) को विभेदक मेथिलेसन रिपोर्ट गरेका थियौं, जुन माइटोकोन्ड्रियल प्रोपियोनिल-CoA कार्बोक्सिलेज इन्जाइम PCC को उपयुनिट हो। PCC को डिसरेगुलेसनले प्रोपियोनिल डेरिभेटिभहरूको विषाक्त संचयको कारण जानिन्छ, जसमा प्रोपियोनिक एसिड (PPA)23,24,25 समावेश छ। PPA ले न्यूरोनल मेटाबोलिज्मलाई बाधा पुर्‍याउने र भिभोमा व्यवहार परिवर्तन गर्ने देखाइएको छ र ASD26,27,28 मा संलग्न न्यूरोडेभलपमेन्टल संयन्त्रहरूको अध्ययनको लागि एक स्थापित पशु मोडेल हो। थप रूपमा, PPA ले भिट्रोमा माइटोकोन्ड्रियल झिल्ली क्षमता, जैवजनन र श्वासप्रश्वासलाई बाधा पुर्‍याउने रिपोर्ट गरिएको छ र न्यूरोन्समा माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शन मोडेल गर्न व्यापक रूपमा प्रयोग गरिएको छ29,30। यद्यपि, माइटोकोन्ड्रियल आकारविज्ञान र गतिशीलतामा PPA-प्रेरित माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शनको प्रभावलाई राम्ररी बुझिएको छैन।
यस अध्ययनले SH-SY5Y कोषहरूमा माइटोकोन्ड्रियल मोर्फोलोजी, गतिशीलता र प्रकार्यमा PPA को प्रभावहरूको मात्रा निर्धारण गर्न पूरक इमेजिङ प्रविधिहरू प्रयोग गर्दछ। पहिले, हामीले माइटोकोन्ड्रियल मोर्फोलोजी र अल्ट्रास्ट्रक्चरमा परिवर्तनहरू कल्पना गर्न TEM विधि विकास गर्यौं17,31,32। माइटोकोन्ड्रियलको गतिशील प्रकृतिलाई ध्यानमा राख्दै33, हामीले PPA तनाव अन्तर्गत विखंडन र फ्यूजन घटनाहरू, माइटोकोन्ड्रियल संख्या र भोल्युम बीचको सन्तुलनमा परिवर्तनहरू परिमाण गर्न माइटोकोन्ड्रियल घटना लोकलाइजर (MEL) विश्लेषण पनि प्रयोग गर्यौं। अन्तमा, हामीले जाँच गर्यौं कि माइटोकोन्ड्रियल मोर्फोलोजी र गतिशीलता बायोजेनेसिस, विखंडन र फ्यूजनमा संलग्न जीनहरूको अभिव्यक्तिमा परिवर्तनहरूसँग सम्बन्धित छन् कि छैनन्। सँगै लिइएपछि, हाम्रो डेटाले माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलता नियमन गर्ने संयन्त्रहरूको जटिलता स्पष्ट पार्ने चुनौतीलाई चित्रण गर्दछ। हामी SH-SY5Y कोषहरूमा माइटोसिसको मापनयोग्य अभिसरण अन्त्य बिन्दुको रूपमा माइटोकोन्ड्रियल मोर्फोलोजी अध्ययन गर्न TEM को उपयोगितालाई हाइलाइट गर्छौं। थप रूपमा, हामी हाइलाइट गर्छौं कि TEM डेटाले इमेजिङ प्रविधिहरूसँग मिलाएर सबैभन्दा धनी जानकारी प्रदान गर्दछ जसले मेटाबोलिक तनावको प्रतिक्रियामा गतिशील घटनाहरू पनि खिच्दछ। न्यूरोनल सेल माइटोसिसलाई समर्थन गर्ने आणविक नियामक संयन्त्रहरूको थप विशेषताकरणले स्नायु प्रणालीको माइटोकोन्ड्रियल घटक र न्यूरोडिजेनेरेटिभ रोगहरूमा महत्त्वपूर्ण अन्तर्दृष्टि प्रदान गर्न सक्छ।
माइटोकोन्ड्रियल तनाव उत्पन्न गर्न, SH-SY5Y कोषहरूलाई 3 mM र 5 mM सोडियम प्रोपियोनेट (NaP) प्रयोग गरेर PPA ले उपचार गरिएको थियो। TEM अघि, नमूनाहरूलाई उच्च-दबाव फ्रिजिङ र फ्रिजिङ प्रयोग गरेर क्रायोजेनिक नमूना तयारीको अधीनमा राखिएको थियो (चित्र 1a)। हामीले तीन जैविक प्रतिकृतिहरूमा माइटोकोन्ड्रियल जनसंख्याको आठ रूपात्मक प्यारामिटरहरू मापन गर्न स्वचालित माइटोकोन्ड्रियल छवि विश्लेषण पाइपलाइन विकास गर्यौं। हामीले फेला पार्यौं कि PPA उपचारले चार प्यारामिटरहरूमा उल्लेखनीय रूपमा परिवर्तन गरेको छ: क्षेत्र 2, क्षेत्र, परिधि, र फेरेट व्यास (चित्र 1b–e)। क्षेत्र 2 ले 3 mM र 5 mM PPA उपचार (क्रमशः p = 0.0183 र p = 0.002) (चित्र 1b) सँग उल्लेखनीय रूपमा घट्यो, जबकि क्षेत्र (p = 0.003), परिधि (p = 0.0106) र फेरेट व्यास सबै उल्लेखनीय रूपमा घटेका छन्। नियन्त्रण समूह (चित्र 1c–e) को तुलनामा 5 mM उपचार समूहमा उल्लेखनीय कमी (p = 0.0172) थियो। क्षेत्रफल र परिधिमा उल्लेखनीय कमीले देखाएको छ कि ५ एमएम पीपीएसँग उपचार गरिएका कोषहरूमा सानो, बढी गोलाकार माइटोकोन्ड्रिया थियो, र यी माइटोकोन्ड्रिया नियन्त्रण कोषहरूमा भन्दा कम लामो थिए। यो फेरेट व्यासमा उल्लेखनीय कमीसँग पनि मिल्दोजुल्दो छ, जुन कण किनारहरू बीचको सबैभन्दा ठूलो दूरीमा कमीलाई संकेत गर्ने स्वतन्त्र प्यारामिटर हो। क्रिस्टेको अल्ट्रास्ट्रक्चरमा परिवर्तनहरू अवलोकन गरियो: पीपीए तनावको प्रभावमा क्रिस्टे कम स्पष्ट भयो (चित्र १a, प्यानल बी)। यद्यपि, सबै छविहरूले क्रिस्टेको अल्ट्रास्ट्रक्चरलाई स्पष्ट रूपमा प्रतिबिम्बित गरेनन्, त्यसैले यी परिवर्तनहरूको मात्रात्मक विश्लेषण गरिएको थिएन। यी TEM डेटाले तीन सम्भावित परिदृश्यहरू प्रतिबिम्बित गर्न सक्छ: (१) पीपीएले विखंडन बढाउँछ वा फ्युजनलाई रोक्छ, जसले गर्दा अवस्थित माइटोकोन्ड्रिया आकारमा संकुचित हुन्छ; (२) बढाइएको बायोजेनेसिसले नयाँ, सानो माइटोकोन्ड्रिया सिर्जना गर्दछ वा (३) दुवै संयन्त्रहरूलाई एकैसाथ प्रेरित गर्दछ। यद्यपि यी अवस्थाहरूलाई TEM द्वारा छुट्याउन सकिँदैन, महत्त्वपूर्ण रूपात्मक परिवर्तनहरूले माइटोकोन्ड्रियल होमियोस्टेसिस र पीपीए तनाव अन्तर्गत गतिशीलतामा परिवर्तनहरूलाई संकेत गर्दछ। हामीले पछि यी गतिशीलताहरू र तिनीहरूमा अन्तर्निहित सम्भावित संयन्त्रहरूलाई थप विशेषता दिन थप प्यारामिटरहरू अन्वेषण गर्यौं।
प्रोपियोनिक एसिड (PPA) ले माइटोकोन्ड्रियल आकारविज्ञानलाई पुनर्निर्माण गर्दछ। (a) प्रतिनिधि प्रसारण इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोपी (TEM) छविहरूले देखाउँछन् कि माइटोकोन्ड्रियल आकार घट्छ र माइटोकोन्ड्रियल सानो र गोलाकार हुन्छ PPA उपचार बढ्दै जाँदा; ० mM (उपचार नगरिएको), ३ mM ​​र ५ mM, क्रमशः। रातो तीरहरूले माइटोकोन्ड्रियालाई संकेत गर्दछ। (b–e) २४ घण्टाको लागि PPA सँग उपचार गरिएका SH-SY5Y कोषहरू TEM को लागि तयार पारिएका थिए र परिणामहरू Fiji/ImageJ प्रयोग गरेर विश्लेषण गरिएको थियो। आठ प्यारामिटरहरू मध्ये चारले नियन्त्रण (उपचार नगरिएको, ० mM PPA) र उपचार गरिएको (३ mM र ५ mM PPA) कोषहरू बीच महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू देखाए। (b) क्षेत्र २, (c) क्षेत्र, (d) परिधि, (e) फेरेट व्यास। भिन्नता (नियन्त्रण बनाम उपचार) को एकतर्फी विश्लेषण र डनेटको बहु तुलना परीक्षण महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू निर्धारण गर्न प्रयोग गरिएको थियो (p < ०.०५)। डेटा बिन्दुहरूले प्रत्येक व्यक्तिगत कोषको लागि औसत माइटोकोन्ड्रियल मान प्रतिनिधित्व गर्दछ, र त्रुटि बारहरूले औसत ± SEM प्रतिनिधित्व गर्दछ। देखाइएको डेटाले n = ३ लाई प्रतिनिधित्व गर्दछ, प्रति प्रतिकृति कम्तिमा २४ कोषहरू; कुल २६६ छविहरूको विश्लेषण गरिएको थियो; * ले p < ०.०५ जनाउँछ, ** ले p < ०.०१ जनाउँछ।
माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलताले PPA लाई कसरी प्रतिक्रिया दिन्छ भनेर थप वर्णन गर्न, हामीले टेट्रामेथिलरोडामाइन इथाइल एस्टर (TMRE) ले माइटोकोन्ड्रियालाई दाग लगायौं र ३ र ५ mM PPA मा २४ घण्टा पछि माइटोकोन्ड्रियालाई स्थानीयकरण र परिमाण गर्न समय-ल्याप्स माइक्रोस्कोपी र MEL विश्लेषण प्रयोग गर्यौं। विखंडन र फ्यूजन घटनाहरूको उपचार। (चित्र २a)। MEL विश्लेषण पछि, माइटोकोन्ड्रियल संरचनाहरूको संख्या र तिनीहरूको औसत आयतन परिमाण गर्न माइटोकोन्ड्रियालाई थप विश्लेषण गरियो। हामीले विखंडन [५.६ ± ०.३ (p < ०.०५))] र फ्यूजन [५.४ ± ०.५ (p < ०.०५)] र फ्यूजन [५.४ ± ०.५ (p < ०.०५)] ०.०५)] को तुलनामा ३ mM ​​[४.९ ± ०.३ (p < ०.०५)] मा हुने विखंडन घटनाहरूको संख्यामा सानो तर उल्लेखनीय वृद्धि देख्यौं। नियन्त्रण (चित्र ३b) को तुलनामा ५ mM मा। माइटोकोन्ड्रियाको संख्या ३ [३२.६ ± २.१ (p < ०.०५)] र ५ mM [३४.१ ± २.२ (p < ०.०५)] (चित्र ३c) मा उल्लेखनीय रूपमा बढेको छ, जबकि प्रत्येक माइटोकोन्ड्रियल संरचनाको औसत आयतन अपरिवर्तित रह्यो (चित्र ३c)। ३d)। सँगै लिँदा, यसले सुझाव दिन्छ कि माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलताको पुनर्निर्माणले क्षतिपूर्ति प्रतिक्रियाको रूपमा काम गर्दछ जसले माइटोकोन्ड्रियल नेटवर्कको अखण्डतालाई सफलतापूर्वक कायम राख्छ। ३ mM ​​PPA मा विखंडन घटनाहरूको संख्यामा भएको वृद्धिले माइटोकोन्ड्रियल संख्यामा वृद्धि आंशिक रूपमा माइटोकोन्ड्रियल विखंडनको कारणले भएको सुझाव दिन्छ, तर औसत माइटोकोन्ड्रियल भोल्युम अनिवार्य रूपमा अपरिवर्तित रहन्छ, बायोजेनेसिसलाई अतिरिक्त क्षतिपूर्ति प्रतिक्रियाको रूपमा अस्वीकार गर्न सकिँदैन। यद्यपि, यी डेटा TEM द्वारा अवलोकन गरिएका साना, गोलाकार माइटोकोन्ड्रियल संरचनाहरूसँग मिल्दोजुल्दो छ र PPA द्वारा प्रेरित माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलतामा महत्त्वपूर्ण परिवर्तनहरू पनि प्रदर्शन गर्दछ।
प्रोपियोनिक एसिड (PPA) ले नेटवर्क अखण्डता कायम राख्न गतिशील माइटोकोन्ड्रियल पुनर्निर्माणलाई प्रेरित गर्छ। SH-SY5Y कोषहरूलाई २४ घण्टासम्म ३ र ५ mM PPA ले उपचार गरियो, TMRE र Hoechst 33342 ले रंग लगाइयो र त्यसपछि MEL विश्लेषण गरियो। (a) प्रत्येक अवस्थाको लागि समय २ (t2) मा रंग र बाइनराइज्ड अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपणहरू चित्रण गर्ने प्रतिनिधि समय-ल्याप्स माइक्रोस्कोपी छविहरू। प्रत्येक बाइनरी छविमा संकेत गरिएका चयन गरिएका क्षेत्रहरूलाई समयसँगै गतिशीलता चित्रण गर्न तीन फरक समय फ्रेमहरू (t1-t3) मा 3D मा बढाइन्छ र प्रदर्शन गरिन्छ; फ्युजन घटनाहरू हरियो रंगमा हाइलाइट गरिन्छ; विखंडन घटनाहरू हरियो रंगमा हाइलाइट गरिन्छ। रातो रंगमा प्रदर्शित। (b) प्रति अवस्था गतिशील घटनाहरूको औसत संख्या। (c) प्रति सेल माइटोकोन्ड्रियल संरचनाहरूको औसत संख्या। (d) प्रति सेल प्रत्येक माइटोकोन्ड्रियल संरचनाको औसत मात्रा (µm3)। देखाइएको डेटा प्रति उपचार समूह n = १५ कोषहरूको प्रतिनिधित्व गर्दछ। देखाइएको त्रुटि बारहरूले औसत ± SEM, स्केल बार = १० μm, * p < ०.०५ प्रतिनिधित्व गर्दछ।
प्रोपियोनिक एसिड (PPA) ले माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलतासँग सम्बन्धित जीनहरूको ट्रान्सक्रिप्शनल दमन निम्त्याउँछ। SH-SY5Y कोषहरूलाई २४ घण्टाको लागि ३ र ५ mM PPA ले उपचार गरिएको थियो। RT-qPCR प्रयोग गरेर सापेक्षिक जीन परिमाणीकरण गरिएको थियो र B2M मा सामान्यीकृत गरिएको थियो। माइटोकोन्ड्रियल बायोजेनेसिस जीनहरू (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 र (d) NFE2L2। माइटोकोन्ड्रियल फ्युजन र फिसन जीनहरू (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 र (i) DRP1। एकतर्फी ANOVA (नियन्त्रण बनाम उपचार) र डनेटको बहु तुलना परीक्षण प्रयोग गरेर महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू (p < ०.०५) परीक्षण गरिएको थियो: * ले p < ०.०५ जनाउँछ, ** ले p < ०.०१ जनाउँछ, र **** ले p < ०.०००१ जनाउँछ। बारहरूले औसत अभिव्यक्ति ± SEM प्रतिनिधित्व गर्दछ। देखाइएको डेटाले n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), र n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) जैविक प्रतिकृतिहरू प्रतिनिधित्व गर्दछ।
TEM र MEL विश्लेषणबाट प्राप्त तथ्याङ्कले PPA ले माइटोकोन्ड्रियल आकारविज्ञान र गतिशीलतालाई परिवर्तन गर्छ भन्ने संकेत गर्छ। यद्यपि, यी इमेजिङ प्रविधिहरूले यी प्रक्रियाहरूलाई चलाउने अन्तर्निहित संयन्त्रहरूमा अन्तर्दृष्टि प्रदान गर्दैनन्। त्यसैले हामीले PPA उपचारको प्रतिक्रियामा माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलता, बायोजेनेसिस र माइटोसिसका नौ प्रमुख नियामकहरूको mRNA अभिव्यक्तिको जाँच गर्यौं। हामीले सेल माइलोमा ओन्कोजीन (cMYC), आणविक श्वासप्रश्वास कारक (NRF1), माइटोकोन्ड्रियल ट्रान्सक्रिप्शन कारक 1 (TFAM), NFE2-जस्तो ट्रान्सक्रिप्शन कारक BZIP (NFE2L2), ग्यास्ट्रिन-जस्तो प्रोटीन 2 (STOML2), अप्टिक नर्भ एट्रोफी 1 (OPA1), मिटोफ्युसिन 1 (MFN1), मिटोफ्युसिन 2 (MFN2) र डायनामिन-सम्बन्धित प्रोटीन 1 (DRP1) लाई 3 mM र 5 mM PPA सँग २४ घण्टाको उपचार पछि परिमाण गर्यौं। हामीले ३ एमएम (p = ०.००५३, p = ०.०४१५ र p < ०.०००१, क्रमशः) र ५ एमएम (p = ०.००३१, p = ०.०२३३, p < ०.०००१) पीपीए उपचार अवलोकन गर्यौं। (चित्र ३a–c)। एमआरएनए अभिव्यक्तिमा कमी खुराक-निर्भर थियो: cMYC, NRF1 र TFAM को अभिव्यक्ति ३ एमएममा क्रमशः ५.७, २.६ र १.९ गुणाले घट्यो, र ५ एमएममा ११.२, ३ र २.२ गुणाले घट्यो। यसको विपरित, केन्द्रीय रेडक्स बायोजेनेसिस जीन NFE2L2 पीपीएको कुनै पनि सांद्रतामा परिवर्तन गरिएको थिएन, यद्यपि घटेको अभिव्यक्तिको समान खुराक-निर्भर प्रवृत्ति अवलोकन गरिएको थियो (चित्र ३d)।
हामीले विखंडन र फ्युजनको नियमनमा संलग्न शास्त्रीय जीनहरूको अभिव्यक्तिको पनि जाँच गर्यौं। STOML2 लाई फ्युजन, माइटोफेजी र बायोजेनेसिसमा संलग्न मानिन्छ, र यसको अभिव्यक्ति उल्लेखनीय रूपमा घटाइएको थियो (p < 0.0001) 3 mM (2.4-गुणा परिवर्तन) र 5 mM (2.8-गुणा परिवर्तन) PPA (चित्र 1) द्वारा। 3d)। त्यस्तै गरी, OPA1 फ्युजन जीन अभिव्यक्ति 3 mM (1.6-गुणा परिवर्तन) र 5 mM (1.9-गुणा परिवर्तन) PPA (p = 0.006 र p = 0.0024, क्रमशः) मा घटाइएको थियो (चित्र 3f)। यद्यपि, हामीले 24-घण्टा PPA तनाव (चित्र 3g–i) अन्तर्गत फ्युजन जीन MFN1, MFN2 वा विखंडन जीन DRP1 को अभिव्यक्तिमा महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू फेला पारेनौं। यसको अतिरिक्त, हामीले चार फ्युजन र फिसन प्रोटीनहरू (OPA1, MFN1, MFN2 र DRP1) को स्तरहरू एउटै अवस्थाहरूमा परिवर्तन नभएको फेला पार्यौं (चित्र 4a–d)। यो ध्यान दिनु महत्त्वपूर्ण छ कि यी डेटाले समयको एकल बिन्दुलाई प्रतिबिम्बित गर्दछ र PPA तनावको प्रारम्भिक चरणहरूमा प्रोटीन अभिव्यक्ति वा गतिविधि स्तरहरूमा परिवर्तनहरू प्रतिबिम्बित नगर्न सक्छ। यद्यपि, cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, र OPA1 को अभिव्यक्तिमा उल्लेखनीय कमीले माइटोकोन्ड्रियल मेटाबोलिज्म, बायोजेनेसिस, र गतिशीलताको महत्त्वपूर्ण ट्रान्सक्रिप्शनल डिसरेगुलेसनलाई संकेत गर्दछ। थप रूपमा, यी डेटाले माइटोकोन्ड्रियल प्रकार्यमा अन्तिम-अवस्था परिवर्तनहरू प्रत्यक्ष रूपमा अध्ययन गर्न इमेजिङ प्रविधिहरूको उपयोगितालाई हाइलाइट गर्दछ।
प्रोपियोनिक एसिड (PPA) उपचार पछि फ्युजन र फिसन फ्याक्टर प्रोटिन स्तर परिवर्तन भएन। SH-SY5Y कोषहरूलाई २४ घण्टाको लागि ३ र ५ mM PPA ले उपचार गरियो। पश्चिमी ब्लट विश्लेषणद्वारा प्रोटिन स्तरहरू परिमाण गरिएको थियो, र अभिव्यक्ति स्तरहरू कुल प्रोटिनमा सामान्यीकृत गरिएको थियो। औसत प्रोटिन अभिव्यक्ति र लक्ष्य र कुल प्रोटिनको प्रतिनिधि पश्चिमी ब्लटहरू देखाइएको छ। a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1। बारहरूले औसत ± SEM प्रतिनिधित्व गर्दछ, र देखाइएको डेटा n = 3 जैविक प्रतिकृतिहरूको प्रतिनिधि हो। भिन्नता र डनेटको परीक्षणको एकतर्फी विश्लेषण प्रयोग गरेर धेरै तुलनाहरू (p < ०.०५) गरिएको थियो। मूल जेल र ब्लट चित्र S1 मा देखाइएको छ।
माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शन मेटाबोलिक, कार्डियोभास्कुलर र मांसपेशी रोगहरूदेखि स्नायु रोगहरू १,१० सम्मका बहुप्रणाली रोगहरूसँग सम्बन्धित छ। धेरै न्यूरोडिजेनेरेटिभ र न्यूरोडिजेनेरेटिभ रोगहरू माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शनसँग सम्बन्धित छन्, जसले मस्तिष्कको जीवनकालभरि यी अंगहरूको महत्त्वलाई प्रकाश पार्छ। यी रोगहरूमा पार्किन्सन रोग, अल्जाइमर रोग र ASD३,४,१८ समावेश छन्। यद्यपि, यी रोगहरूको अध्ययन गर्न मस्तिष्कको तन्तुमा पहुँच गाह्रो छ, विशेष गरी मेकानिस्टिक स्तरमा, जसले सेलुलर मोडेल प्रणालीहरूलाई आवश्यक विकल्प बनाउँछ। यस अध्ययनमा, हामी न्यूरोनल रोगहरू, विशेष गरी अटिजम स्पेक्ट्रम विकारहरूमा अवलोकन गरिएको माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शनलाई पुन: कथन गर्न PPA-उपचार गरिएको SH-SY5Y कोशिकाहरू प्रयोग गरेर सेलुलर मोडेल प्रणाली प्रयोग गर्छौं। न्यूरोन्समा माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलता अध्ययन गर्न यो PPA मोडेल प्रयोग गर्नाले ASD को एटियोलोजीमा अन्तर्दृष्टि प्रदान गर्न सक्छ।
हामीले माइटोकोन्ड्रियल मोर्फोलजीमा परिवर्तनहरू हेर्न TEM प्रयोग गर्ने सम्भावनाको खोजी गर्यौं। यो ध्यान दिनु महत्त्वपूर्ण छ कि TEM लाई यसको प्रभावकारिता अधिकतम बनाउन सही रूपमा प्रयोग गर्नुपर्छ। क्रायो-नमूनाहरूको तयारीले सेलुलर कम्पोनेन्टहरू फिक्स गरेर र कलाकृतिहरूको गठन घटाएर न्यूरोनल संरचनाहरूको राम्रो संरक्षण गर्न अनुमति दिन्छ34। यससँग मिल्दोजुल्दो, हामीले अवलोकन गर्यौं कि न्यूरोन-जस्तै SH-SY5Y कोशिकाहरूमा अक्षुण्ण उपकोशिकीय अर्गानेलहरू र लम्बिएको माइटोकोन्ड्रिया थियो (चित्र 1a)। यसले न्यूरोनल सेल मोडेलहरूमा माइटोकोन्ड्रियल मोर्फोलजी अध्ययन गर्न क्रायोजेनिक तयारी प्रविधिहरूको उपयोगितालाई हाइलाइट गर्दछ। TEM डेटाको वस्तुनिष्ठ विश्लेषणको लागि मात्रात्मक मापनहरू महत्त्वपूर्ण भए पनि, माइटोकोन्ड्रियल मोर्फोलजी परिवर्तनहरू पुष्टि गर्न कुन विशिष्ट प्यारामिटरहरू मापन गर्नुपर्छ भन्ने बारे अझै पनि कुनै सहमति छैन। माइटोकोन्ड्रियल मोर्फोलजी17,31,32 मात्रात्मक रूपमा जाँच गरिएका धेरै अध्ययनहरूको आधारमा, हामीले एक स्वचालित माइटोकोन्ड्रियल छवि विश्लेषण पाइपलाइन विकास गर्यौं जसले आठ मोर्फोलजिकल प्यारामिटरहरू मापन गर्दछ, अर्थात्: क्षेत्र, क्षेत्रफल2, पक्ष अनुपात, परिधि, गोलाकारता, डिग्री, फेरेट व्यास। र गोलाकारता।
ती मध्ये, PPA ले क्षेत्रफल २, क्षेत्रफल, परिधि, र फेरेट व्यासलाई उल्लेखनीय रूपमा घटायो (चित्र १b–e)। यसले देखाएको छ कि माइटोकोन्ड्रियल सानो र गोलाकार हुँदै गयो, जुन PPA30-प्रेरित माइटोकोन्ड्रियल तनावको ७२ घण्टा पछि माइटोकोन्ड्रियल क्षेत्रमा कमी देखाउने अघिल्लो अध्ययनहरूसँग मिल्दोजुल्दो छ। यी रूपात्मक विशेषताहरूले माइटोकोन्ड्रियल विखंडनलाई संकेत गर्न सक्छन्, जुन माइटोकोन्ड्रियल नेटवर्कबाट क्षतिग्रस्त घटकहरूलाई अलग गर्न आवश्यक प्रक्रिया हो जसले माइटोफ्याजी ३५,३६,३७ मार्फत तिनीहरूको क्षयलाई बढावा दिन्छ। अर्कोतर्फ, औसत माइटोकोन्ड्रियल आकारमा कमी बढेको बायोजेनेसिससँग सम्बन्धित हुन सक्छ, जसले गर्दा सानो नवजात माइटोकोन्ड्रियलको गठन हुन्छ। बढेको विखंडन वा बायोजेनेसिसले माइटोकोन्ड्रियल तनाव विरुद्ध माइटोसिस कायम राख्न क्षतिपूर्ति प्रतिक्रियालाई प्रतिनिधित्व गर्दछ। यद्यपि, माइटोकोन्ड्रियल वृद्धिमा कमी, बिग्रिएको फ्युजन, वा अन्य अवस्थाहरूलाई बहिष्कार गर्न सकिँदैन।
यद्यपि TEM द्वारा सिर्जना गरिएका उच्च-रिजोल्युसन छविहरूले व्यक्तिगत माइटोकोन्ड्रियाको स्तरमा रूपात्मक विशेषताहरूको निर्धारण गर्न अनुमति दिन्छ, यो विधिले एकै समयमा दुई-आयामी स्न्यापशटहरू उत्पादन गर्दछ। मेटाबोलिक तनावको गतिशील प्रतिक्रियाहरू अध्ययन गर्न, हामीले TMRE ले माइटोकोन्ड्रियालाई दाग लगायौं र MEL विश्लेषणको साथ समय-ल्याप्स माइक्रोस्कोपी प्रयोग गर्यौं, जसले समयसँगै माइटोकोन्ड्रियल नेटवर्कमा परिवर्तनहरूको उच्च-थ्रुपुट 3D दृश्यीकरणलाई अनुमति दिन्छ। हामीले PPA तनाव अन्तर्गत माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलतामा सूक्ष्म तर महत्त्वपूर्ण परिवर्तनहरू अवलोकन गर्यौं (चित्र 2)। 3 mM मा, विखंडन घटनाहरूको संख्या उल्लेखनीय रूपमा बढ्यो, जबकि फ्यूजन घटनाहरू नियन्त्रणमा जस्तै रहे। 5 mM PPA मा विखंडन र फ्यूजन घटनाहरू दुवैको संख्यामा वृद्धि अवलोकन गरिएको थियो, तर यी परिवर्तनहरू लगभग समानुपातिक थिए, जसले सुझाव दिन्छ कि विखंडन र फ्यूजन गतिविज्ञान उच्च सांद्रतामा सन्तुलनमा पुग्छ (चित्र 2b)। औसत माइटोकोन्ड्रियल भोल्युम 3 र 5 mM PPA दुवैमा अपरिवर्तित रह्यो, जसले माइटोकोन्ड्रियल नेटवर्कको अखण्डता संरक्षित रहेको संकेत गर्दछ (चित्र 2d)। यसले गतिशील माइटोकोन्ड्रियल नेटवर्कहरूको हल्का मेटाबोलिक तनावलाई प्रतिक्रिया दिन र नेटवर्क विखंडन नगरी प्रभावकारी रूपमा होमियोस्टेसिस कायम राख्ने क्षमतालाई प्रतिबिम्बित गर्दछ। ३ एमएम पीपीएमा, विखंडनमा वृद्धि नयाँ सन्तुलनमा संक्रमणलाई बढावा दिन पर्याप्त छ, तर पीपीएको उच्च सांद्रताले प्रेरित तनावको प्रतिक्रियामा थप गहन गतिज पुनर्निर्माण आवश्यक छ।
दुवै PPA तनाव सांद्रतामा माइटोकोन्ड्रियाको संख्या बढ्यो, तर औसत माइटोकोन्ड्रियल मात्रामा उल्लेखनीय परिवर्तन भएन (चित्र 2c)। यो बढेको जैविक उत्सर्जन वा बढेको विभाजनको कारणले हुन सक्छ; यद्यपि, औसत माइटोकोन्ड्रियल मात्रामा उल्लेखनीय कमीको अनुपस्थितिमा, जैविक संश्लेषण बढ्ने सम्भावना बढी हुन्छ। यद्यपि, चित्र 2 मा रहेको तथ्याङ्कले दुई क्षतिपूर्ति संयन्त्रहरूको अस्तित्वलाई समर्थन गर्दछ: माइटोकोन्ड्रियल विखंडनको अपरेगुलेसनसँग मिल्दोजुल्दो विखंडन घटनाहरूको संख्यामा वृद्धि, र माइटोकोन्ड्रियल बायोजेनेसिससँग मिल्दोजुल्दो घटनाहरूको संख्यामा वृद्धि। अन्ततः, हल्का तनावको लागि गतिशील क्षतिपूर्तिमा विखंडन, फ्यूजन, बायोजेनेसिस, र माइटोफेजी समावेश गर्ने एकसाथ प्रक्रियाहरू समावेश हुन सक्छन्। यद्यपि अघिल्ला लेखकहरूले PPA ले माइटोसिस 30,39 र माइटोफेजी 29 बढाउँछ भनेर देखाएका छन्, हामी PPA को प्रतिक्रियामा माइटोकोन्ड्रियल विखंडन र फ्यूजन गतिशीलताको पुनर्निर्माणको लागि प्रमाण प्रदान गर्दछौं। यी तथ्याङ्कहरूले TEM द्वारा अवलोकन गरिएका रूपात्मक परिवर्तनहरूको पुष्टि गर्छन् र PPA-प्रेरित माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शनसँग सम्बन्धित संयन्त्रहरूमा थप अन्तर्दृष्टि प्रदान गर्छन्।
TEM वा MEL विश्लेषणले अवलोकन गरिएको मोर्फोलॉजिकल परिवर्तनहरू अन्तर्निहित जीन नियामक संयन्त्रहरूको प्रत्यक्ष प्रमाण प्रदान नगरेको हुनाले, हामीले माइटोकोन्ड्रियल मेटाबोलिज्म, बायोजेनेसिस र गतिशीलतामा संलग्न जीनहरूको RNA अभिव्यक्तिको जाँच गर्यौं। cMYC प्रोटो-अन्कोजीन माइटोकोन्ड्रियल, ग्लाइकोलिसिस, एमिनो एसिड र फ्याटी एसिड मेटाबोलिज्मको नियमनमा संलग्न ट्रान्सक्रिप्शन कारक हो40। यसको अतिरिक्त, cMYC ले NRF1 र TFAM41 सहित माइटोकोन्ड्रियल ट्रान्सक्रिप्शन, अनुवाद, र जटिल एसेम्बलीमा संलग्न लगभग 600 माइटोकोन्ड्रियल जीनहरूको अभिव्यक्तिलाई नियमन गर्न जानिन्छ। NRF1 र TFAM माइटोसिसका दुई केन्द्रीय नियामकहरू हुन्, mtDNA प्रतिकृति सक्रिय गर्न PGC-1α को डाउनस्ट्रीममा कार्य गर्छन्। यो मार्ग cAMP र AMPK सिग्नलिंग द्वारा सक्रिय छ र ऊर्जा खर्च र मेटाबोलिक तनाव प्रति संवेदनशील छ। हामीले PPA को प्रभावहरू अक्सिडेटिभ तनाव द्वारा मध्यस्थता हुन सक्छ कि भनेर निर्धारण गर्न, माइटोकोन्ड्रियल बायोजेनेसिसको रेडक्स नियामक NFE2L2 को पनि जाँच गर्यौं।
यद्यपि NFE2L2 अभिव्यक्ति अपरिवर्तित रह्यो, हामीले 3 mM र 5 mM PPA (चित्र 3a–c) को साथ २४ घण्टाको उपचार पछि cMYC, NRF1 र TFAM को अभिव्यक्तिमा निरन्तर खुराक-निर्भर कमी फेला पार्यौं। cMYC अभिव्यक्तिको डाउनरेगुलेसन पहिले नै माइटोकोन्ड्रियल तनावको प्रतिक्रियाको रूपमा रिपोर्ट गरिएको छ42, र यसको विपरीत, cMYC अभिव्यक्तिको डाउनरेगुलेसनले माइटोकोन्ड्रियल मेटाबोलिज्म, नेटवर्क कनेक्टिभिटी, र झिल्ली ध्रुवीकरण पुनर्निर्माण गरेर माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शन निम्त्याउन सक्छ43। चाखलाग्दो कुरा के छ भने, cMYC माइटोकोन्ड्रियल विखंडन र फ्यूजनको नियमनमा पनि संलग्न छ42,43 र कोशिका विभाजनको समयमा DRP1 फास्फोरिलेसन र माइटोकोन्ड्रियल स्थानीयकरण बढाउन जानिन्छ44, साथै न्यूरोनल स्टेम सेलहरूमा माइटोकोन्ड्रियल मोर्फोलॉजिकल पुनर्निर्माण मध्यस्थता गर्दछ45। वास्तवमा, cMYC-कमी फाइब्रोब्लास्टहरूले PPA43 तनावद्वारा प्रेरित परिवर्तनहरूसँग मिल्दोजुल्दो, कम माइटोकोन्ड्रियल आकार प्रदर्शन गर्दछ। यी तथ्याङ्कहरूले cMYC र माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलता बीचको एक रोचक तर अझै अस्पष्ट सम्बन्धलाई चित्रण गर्दछ, जसले PPA तनाव-प्रेरित पुनर्निर्माणको भविष्यको अध्ययनको लागि एक रोचक लक्ष्य प्रदान गर्दछ।
NRF1 र TFAM को कमी एक महत्त्वपूर्ण ट्रान्सक्रिप्शनल एक्टिभेटरको रूपमा cMYC को भूमिकासँग मिल्दोजुल्दो छ। यी तथ्याङ्कहरू मानव कोलोन क्यान्सर कोषहरूमा अघिल्लो अध्ययनहरूसँग पनि मिल्दोजुल्दो छन् जसले देखाउँछ कि PPA ले NRF1 mRNA अभिव्यक्तिलाई २२ घण्टामा घटायो, जुन ATP डिप्लेसनसँग सम्बन्धित थियो र ROS46 बढ्यो। यी लेखकहरूले यो पनि रिपोर्ट गरे कि TFAM अभिव्यक्ति ८.५ घण्टामा बढ्यो तर २२ घण्टामा आधारभूत स्तरमा फर्कियो। यसको विपरित, Kim et al. (2019) ले देखाए कि SH-SY5Y कोषहरूमा PPA तनावको ४ घण्टा पछि TFAM mRNA अभिव्यक्ति उल्लेखनीय रूपमा घटेको थियो; यद्यपि, ७२ घण्टा पछि, TFAM प्रोटीन अभिव्यक्ति उल्लेखनीय रूपमा बढेको थियो र mtDNA प्रतिलिपि संख्या उल्लेखनीय रूपमा बढेको थियो। यसरी, हामीले २४ घण्टा पछि अवलोकन गरेको माइटोकोन्ड्रियल बायोजेनेसिस जीनहरूको संख्यामा कमीले माइटोकोन्ड्रियाको संख्यामा वृद्धि पहिलेको समय बिन्दुहरूमा बायोजेनेसिसको सक्रियतासँग सम्बन्धित हुने सम्भावनालाई बहिष्कार गर्दैन। अघिल्ला अध्ययनहरूले देखाएका छन् कि PPA ले SH-SY5Y कोषहरूमा PGC-1α mRNA र प्रोटिनलाई ४ घण्टा ३० मिनेटमा उल्लेखनीय रूपमा अपरेगुलेट गर्छ, जबकि प्रोपियोनिक एसिडले १२ घण्टा ३९ मिनेटमा PGC-1α मार्फत बाछोको हेपाटोसाइट्समा माइटोकोन्ड्रियल बायोजेनेसिसलाई बढाउँछ। चाखलाग्दो कुरा के छ भने, PGC-1α NRF1 र TFAM को प्रत्यक्ष ट्रान्सक्रिप्शनल नियामक मात्र होइन, तर विखंडन र फ्युजन47 लाई नियमन गरेर MFN2 र DRP1 को गतिविधिलाई पनि नियमन गर्ने देखाइएको छ। सँगै लिँदा, यसले PPA द्वारा प्रेरित माइटोकोन्ड्रियल क्षतिपूर्ति प्रतिक्रियाहरू नियमन गर्ने संयन्त्रहरूको नजिकको युग्मनलाई हाइलाइट गर्दछ। यसबाहेक, हाम्रो डेटाले PPA तनाव अन्तर्गत बायोजेनेसिस र मेटाबोलिज्मको ट्रान्सक्रिप्शनल नियमनको महत्त्वपूर्ण डिसरेगुलेसनलाई प्रतिबिम्बित गर्दछ।
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 र DRP1 जीनहरू माइटोकोन्ड्रियल फिसन, फ्युजन र गतिशीलताका केन्द्रीय नियामकहरू हुन्37,48,49। माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलतामा संलग्न धेरै अन्य जीनहरू छन्, यद्यपि, STOML2, OPA1 र MFN2 पहिले ASD समूहहरूमा भिन्न रूपमा मिथाइलेटेड भएको पाइएको छ,16 र धेरै स्वतन्त्र अध्ययनहरूले माइटोकोन्ड्रियल तनावको प्रतिक्रियामा यी ट्रान्सक्रिप्शन कारकहरूमा परिवर्तनहरू रिपोर्ट गरेका छन्50,51. 52. OPA1 र STOML2 दुवैको अभिव्यक्ति 3 mM र 5 mM PPA उपचारले उल्लेखनीय रूपमा घटाइएको थियो (चित्र 3e, f)। OPA1 MFN1 र 2 सँग प्रत्यक्ष अन्तरक्रिया मार्फत माइटोकोन्ड्रियल फ्युजनको शास्त्रीय नियामकहरू मध्ये एक हो र क्रिस्टा रिमोडेलिंग र माइटोकोन्ड्रियल आकारविज्ञानमा भूमिका खेल्छ53। माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलतामा STOML2 को सटीक भूमिका अस्पष्ट रहन्छ, तर प्रमाणले सुझाव दिन्छ कि यसले माइटोकोन्ड्रियल फ्युजन, बायोजेनेसिस, र माइटोफेजीमा भूमिका खेल्छ।
STOML2 ले माइटोकोन्ड्रियल श्वासप्रश्वास युग्मन र श्वासप्रश्वास श्रृंखला जटिलहरूको गठन कायम राख्नमा संलग्न छ54,55 र क्यान्सर कोषहरूको मेटाबोलिक विशेषताहरूलाई गहिरो रूपमा परिवर्तन गर्ने देखाइएको छ56। अध्ययनहरूले देखाएको छ कि STOML2 ले BAN र कार्डियोलिपिन 55, 57, 58 सँग अन्तरक्रिया मार्फत माइटोकोन्ड्रियल झिल्ली क्षमता र जैविक उत्पतिलाई बढावा दिन्छ। थप रूपमा, स्वतन्त्र अध्ययनहरूले देखाएको छ कि STOML2 र PINK1 बीचको अन्तरक्रियाले माइटोफेजीलाई नियमन गर्दछ59,60। उल्लेखनीय रूपमा, STOML2 ले MFN2 सँग प्रत्यक्ष अन्तरक्रिया र स्थिरीकरण गर्ने रिपोर्ट गरिएको छ र OPA1 गिरावटको लागि जिम्मेवार प्रोटीजलाई रोकेर लामो OPA1 आइसोफर्महरूलाई स्थिर गर्नमा पनि महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छ53,61,62। PPA प्रतिक्रियाहरूमा अवलोकन गरिएको STOML2 अभिव्यक्तिमा कमीले यी फ्युजन प्रोटीनहरूलाई ubiquitin- र proteasome-निर्भर मार्गहरू मार्फत गिरावटको लागि बढी संवेदनशील बनाउन सक्छ48। PPA को गतिशील प्रतिक्रियामा STOML2 र OPA1 को सटीक भूमिका स्पष्ट नभए पनि, यी फ्युजन जीनहरूको कम अभिव्यक्ति (चित्र ३) ले विखंडन र फ्युजन बीचको सन्तुलनलाई बाधा पुर्‍याउन सक्छ र माइटोकोन्ड्रियल आकार घटाउन सक्छ (चित्र ३)। १)।
अर्कोतर्फ, २४ घण्टा पछि OPA1 प्रोटिन अभिव्यक्ति अपरिवर्तित रह्यो, जबकि MFN1, MFN2 वा DRP1 को mRNA र प्रोटिन स्तर PPA उपचार पछि उल्लेखनीय रूपमा परिवर्तन भएन (चित्र 3g-i, चित्र 4)। यसले माइटोकोन्ड्रियल फ्युजन र फिसनमा संलग्न यी कारकहरूको नियमनमा कुनै परिवर्तन नभएको संकेत गर्न सक्छ। यद्यपि, यो ध्यान दिन लायक छ कि यी चार जीनहरू मध्ये प्रत्येकलाई प्रोटीन गतिविधि नियन्त्रण गर्ने पोस्टट्रान्सक्रिप्शनल परिमार्जनहरू (PTMs) द्वारा पनि नियमन गरिन्छ। OPA1 मा आठ वैकल्पिक स्प्लिस भेरियन्टहरू छन् जुन दुई फरक आइसोफर्महरू 63 उत्पादन गर्न माइटोकोन्ड्रियलमा प्रोटियोलाइटिक रूपमा क्लीभ गरिएका छन्। लामो र छोटो आइसोफर्महरू बीचको सन्तुलनले अन्ततः माइटोकोन्ड्रियल फ्युजन र माइटोकोन्ड्रियल नेटवर्कको मर्मतमा OPA1 को भूमिका निर्धारण गर्दछ64। DRP1 गतिविधि क्याल्सियम/क्याल्मोडुलिन-निर्भर प्रोटीन किनेज II (CaMKII) फास्फोरिलेसन द्वारा नियमन गरिन्छ, जबकि DRP1 डिग्रेडेसन ubiquitination र SUMOylation65 द्वारा नियमन गरिन्छ। अन्तमा, DRP1 र MFN1/2 दुवै GTPases हुन्, त्यसैले गतिविधि माइटोकोन्ड्रिया 66 मा GTP उत्पादनको दरबाट प्रभावित हुन सक्छ। त्यसकारण, यद्यपि यी प्रोटीनहरूको अभिव्यक्ति स्थिर रहन्छ, यसले अपरिवर्तित प्रोटीन गतिविधि वा स्थानीयकरणलाई प्रतिबिम्बित नगर्न सक्छ67,68। वास्तवमा, अवस्थित PTM प्रोटीन भण्डारहरू प्रायः तीव्र तनाव प्रतिक्रियाहरूको मध्यस्थताको लागि जिम्मेवार पहिलो लाइनको रक्षाको रूपमा काम गर्छन्। हाम्रो मोडेलमा मध्यम मेटाबोलिक तनावको उपस्थितिमा, यो सम्भव छ कि PTM ले mRNA वा प्रोटीन स्तरमा यी जीनहरूको अतिरिक्त सक्रियताको आवश्यकता बिना माइटोकोन्ड्रियल अखण्डतालाई पर्याप्त रूपमा पुनर्स्थापित गर्न फ्युजन र विखंडन प्रोटीनहरूको बढ्दो गतिविधिलाई बढावा दिन्छ।
माथिको तथ्याङ्कलाई एकसाथ लिँदा, माइटोकोन्ड्रियल आकारविज्ञानको जटिल र समय-निर्भर नियमन र यी संयन्त्रहरूलाई स्पष्ट पार्ने चुनौतीहरूलाई हाइलाइट गर्दछ। जीन अभिव्यक्ति अध्ययन गर्न, पहिले मार्गमा विशिष्ट लक्ष्य जीनहरू पहिचान गर्न आवश्यक छ। यद्यपि, हाम्रो तथ्याङ्कले देखाउँछ कि एउटै मार्गमा रहेका जीनहरूले एउटै तनावमा उस्तै तरिकाले प्रतिक्रिया दिँदैनन्। वास्तवमा, अघिल्ला अध्ययनहरूले देखाएका छन् कि एउटै मार्गमा रहेका विभिन्न जीनहरूले फरक-फरक अस्थायी प्रतिक्रिया प्रोफाइलहरू प्रदर्शन गर्न सक्छन्30,46। थप रूपमा, ट्रान्सक्रिप्शन र जीन प्रकार्य बीचको सम्बन्धलाई बाधा पुर्‍याउने जटिल पोस्ट-ट्रान्सक्रिप्शनल संयन्त्रहरू छन्। प्रोटियोमिक अध्ययनहरूले PTM र प्रोटीन प्रकार्यको प्रभावमा अन्तर्दृष्टि प्रदान गर्न सक्छन्, तर तिनीहरूले कम-थ्रुपुट विधिहरू, उच्च सिग्नल-टु-शोर अनुपात, र कमजोर रिजोल्युसन सहित चुनौतीहरू पनि खडा गर्छन्।
यस सन्दर्भमा, TEM र MEL प्रयोग गरेर माइटोकोन्ड्रियल मोर्फोलजीको अध्ययन गर्दा माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलता र कार्य बीचको सम्बन्ध र यसले रोगलाई कसरी प्रभाव पार्छ भन्ने बारे आधारभूत प्रश्नहरूलाई सम्बोधन गर्ने ठूलो सम्भावना छ। सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण कुरा, TEM ले माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शन र गतिशीलताको अभिसरण अन्त्य बिन्दुको रूपमा माइटोकोन्ड्रियल मोर्फोलजी मापन गर्न प्रत्यक्ष विधि प्रदान गर्दछ। MEL ले त्रि-आयामी सेलुलर वातावरणमा विखंडन र फ्यूजन घटनाहरूको दृश्यावलोकन गर्न प्रत्यक्ष विधि पनि प्रदान गर्दछ, जसले जीन अभिव्यक्तिमा परिवर्तनहरूको अनुपस्थितिमा पनि गतिशील माइटोकोन्ड्रियल पुनर्निर्माणको परिमाण निर्धारण गर्न अनुमति दिन्छ। यहाँ हामी माध्यमिक माइटोकोन्ड्रियल रोगहरूमा माइटोकोन्ड्रियल इमेजिङ प्रविधिहरूको उपयोगितालाई हाइलाइट गर्छौं। यी रोगहरू सामान्यतया तीव्र माइटोकोन्ड्रियल क्षतिको सट्टा माइटोकोन्ड्रियल नेटवर्कहरूको सूक्ष्म पुनर्निर्माण द्वारा विशेषता गरिएको पुरानो हल्का मेटाबोलिक तनाव द्वारा विशेषता हुन्छन्। यद्यपि, पुरानो तनाव अन्तर्गत माइटोसिस कायम राख्न आवश्यक माइटोकोन्ड्रियल क्षतिपूर्तिको गहिरो कार्यात्मक परिणामहरू छन्। स्नायु विज्ञानको सन्दर्भमा, यी क्षतिपूर्ति संयन्त्रहरूको राम्रो बुझाइले माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शनसँग सम्बन्धित प्लियोट्रोपिक न्यूरोपैथोलोजीको बारेमा महत्त्वपूर्ण जानकारी प्रदान गर्न सक्छ।
अन्ततः, हाम्रो डेटाले जीन अभिव्यक्ति, प्रोटीन परिमार्जनहरू, र न्यूरोनल माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलता नियन्त्रण गर्ने प्रोटीन गतिविधि बीचको जटिल अन्तरक्रियाको कार्यात्मक परिणामहरू बुझ्नको लागि इमेजिङ प्रविधिहरूको उपयोगितालाई हाइलाइट गर्दछ। हामीले ASD को माइटोकोन्ड्रियल घटकमा अन्तर्दृष्टि प्राप्त गर्न न्यूरोनल सेल मोडेलमा माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शन मोडेल गर्न PPA प्रयोग गर्यौं। PPA सँग उपचार गरिएका SH-SY5Y कोशिकाहरूले माइटोकोन्ड्रियल मोर्फोलजीमा परिवर्तनहरू देखाए: माइटोकोन्ड्रिया सानो र गोलो भयो, र TEM द्वारा अवलोकन गर्दा क्रिस्टालाई राम्रोसँग परिभाषित गरिएको थिएन। MEL विश्लेषणले देखाउँछ कि यी परिवर्तनहरू हल्का मेटाबोलिक तनावको प्रतिक्रियामा माइटोकोन्ड्रियल नेटवर्क कायम राख्न विखंडन र फ्यूजन घटनाहरूमा वृद्धिसँगै हुन्छन्। यसबाहेक, PPA ले माइटोकोन्ड्रियल मेटाबोलिज्म र होमियोस्टेसिसको ट्रान्सक्रिप्शनल नियमनमा उल्लेखनीय रूपमा बाधा पुर्‍याउँछ। हामीले cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, र OPA1 लाई PPA तनावद्वारा बाधित प्रमुख माइटोकोन्ड्रियल नियामकहरूको रूपमा पहिचान गर्यौं र माइटोकोन्ड्रियल मोर्फोलजी र प्रकार्यमा PPA-प्रेरित परिवर्तनहरूको मध्यस्थतामा भूमिका खेल्न सक्छौं। जीन अभिव्यक्ति र प्रोटीन गतिविधि, स्थानीयकरण, र अनुवाद पछिको परिमार्जनहरूमा PPA-प्रेरित अस्थायी परिवर्तनहरूलाई राम्रोसँग चित्रण गर्न भविष्यका अध्ययनहरू आवश्यक छन्। हाम्रो डेटाले माइटोकोन्ड्रियल तनाव प्रतिक्रियाको मध्यस्थता गर्ने नियामक संयन्त्रहरूको जटिलता र अन्तरनिर्भरतालाई हाइलाइट गर्दछ र थप लक्षित मेकानिस्टिक अध्ययनहरूको लागि TEM र अन्य इमेजिङ प्रविधिहरूको उपयोगिता प्रदर्शन गर्दछ।
SH-SY5Y सेल लाइन (ECACC, 94030304-1VL) सिग्मा-एल्ड्रिचबाट खरिद गरिएको थियो। SH-SY5Y कोषहरू डल्बेकोको परिमार्जित ईगलको मध्यम/F-12 पोषक तत्व मिश्रण (DMEM/F-12) र L-ग्लुटामाइन (SC09411, ScienCell) मा २५ सेमी२ फ्लास्कमा २०% भ्रूण गोवाइन सीरम (FBS) (१०४९३१०६, थर्मोफिशर साइन्टिफिक) र १% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (P४३३३-२०एमएल, सिग्मा-एल्ड्रिच) ३७ डिग्री सेल्सियस, ५% CO2 मा उब्जाइएको थियो। कोषहरूलाई ०.०५% ट्रिप्सिन-EDTA (१५४०००५४, थर्मोफिशर साइन्टिफिक) प्रयोग गरेर ८०% संगममा उप-संस्कृत गरिएको थियो, ३०० ग्राममा केन्द्रित गरिएको थियो र लगभग ७ × १०५ कोष/मिली घनत्वमा प्लेट गरिएको थियो। सबै प्रयोगहरू १९-२२ मार्गहरू बीचको अविभाजित SH-SY5Y कोषहरूमा गरिएको थियो। PPA NaP को रूपमा प्रशासित गरिन्छ। NaP पाउडर (CAS No. १३७-४०-६, रासायनिक सूत्र C3H5NaO2, P5436-100G, सिग्मा-एल्ड्रिच) लाई न्यानो MilliQ पानीमा १ M को सांद्रतामा घोल्नुहोस् र ४ °C मा भण्डार गर्नुहोस्। उपचारको दिन, यो घोललाई १ M PPA देखि ३ mM ​​र ५ mM PPA लाई सीरम-मुक्त माध्यम (DMEM/F-१२ L-ग्लुटामाइनको साथ) मा पातलो गर्नुहोस्। सबै प्रयोगहरूको लागि उपचार सांद्रता कुनै PPA (० mM, नियन्त्रण), ३ mM, र ५ mM PPA थिएन। प्रयोगहरू कम्तिमा तीन जैविक प्रतिकृतिहरूमा गरिएका थिए।
SH-SY5Y कोषहरूलाई ५.५ × १०५ कोष/मिलीको दरले २५ सेमी५ फ्लास्कमा सिड गरिएको थियो र २४ घण्टासम्म हुर्काइएको थियो। इन्क्युबेशनको २४ घण्टा अघि फ्लास्कमा PPA उपचार थपिएको थियो। सामान्य स्तनधारी तन्तु उपसंस्कृति प्रोटोकलहरू (माथि वर्णन गरिएको) पालना गर्दै कोष गोलीहरू सङ्कलन गर्नुहोस्। कोष गोलीलाई १०० µl २.५% ग्लुटाराल्डिहाइड, १× PBS मा पुन: निलम्बन गर्नुहोस् र प्रशोधन नभएसम्म ४ डिग्री सेल्सियसमा भण्डार गर्नुहोस्। SH-SY5Y कोषहरूलाई कोषहरू गोली गर्न र २.५% ग्लुटाराल्डिहाइड, १× PBS घोल हटाउन छोटो समयको लागि सेन्ट्रीफ्यूज गरिएको थियो। डिस्टिल्ड पानीमा तयार पारिएको ४% एगारोज जेलमा तलछटलाई पुन: निलम्बन गर्नुहोस् (अगारोज र तलछटको मात्राको अनुपात १:१ छ)। एगारोजका टुक्राहरूलाई समतल प्लेटहरूमा ग्रिडहरूमा राखिएको थियो र उच्च-दबाव फ्रिज गर्नु अघि १-हेक्साडेसिनले लेपित गरिएको थियो। नमूनाहरूलाई -९० डिग्री सेल्सियसमा २४ घण्टाको लागि १००% सुख्खा एसीटोनमा जमाइएको थियो। त्यसपछि तापक्रम -८० डिग्री सेल्सियसमा बढाइयो र १% ओस्मियम टेट्रोक्साइड र ०.१% ग्लुटाराल्डिहाइडको घोल थपियो। नमूनाहरूलाई -८० डिग्री सेल्सियसमा २४ घण्टाको लागि भण्डारण गरियो। यसपछि, धेरै दिनहरूमा तापक्रम बिस्तारै कोठाको तापक्रममा बढाइयो: २४ घण्टाको लागि –८० डिग्री सेल्सियसबाट –५० डिग्री सेल्सियस, २४ घण्टाको लागि –३० डिग्री सेल्सियस, २४ घण्टाको लागि –१० डिग्री सेल्सियस र अन्तमा कोठाको तापक्रममा।
क्रायोजेनिक तयारी पछि, नमूनाहरूलाई रेजिनले गर्भवती गरियो र लाइका रिचेर्ट अल्ट्राकटएस अल्ट्रामाइक्रोटोम (लाइका माइक्रोसिस्टम्स) प्रयोग गरेर अल्ट्राथिन सेक्सनहरू (~१०० एनएम) बनाइयो। सेक्सनहरूलाई २% युरेनिल एसीटेट र लिड साइट्रेटले रंगाइएको थियो। २०० केभी (ल्याब६ ट्रान्समिटर) मा सञ्चालन हुने FEI टेक्नाई २० ट्रान्समिशन इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोप (थर्मोफिशर (पहिले FEI), आइन्डहोभन, नेदरल्याण्ड्स) र ट्राइडिम ऊर्जा फिल्टरले सुसज्जित ग्याटन सीसीडी क्यामेरा (ग्याटन, युके) प्रयोग गरेर नमूनाहरू अवलोकन गरियो।
प्रत्येक प्राविधिक प्रतिकृतिमा, कम्तिमा २४ एकल सेल छविहरू प्राप्त गरियो, कुल २६६ छविहरूको लागि। सबै छविहरू रुचि क्षेत्र (ROI) म्याक्रो र माइटोकोन्ड्रिया म्याक्रो प्रयोग गरेर विश्लेषण गरियो। माइटोकोन्ड्रियल म्याक्रो प्रकाशित विधिहरू१७,३१,३२ मा आधारित छ र फिजी/इमेजजे६९ मा TEM छविहरूको अर्ध-स्वचालित ब्याच प्रशोधनलाई अनुमति दिन्छ। संक्षेपमा: छविलाई रोलिङ बल पृष्ठभूमि घटाउ (६० पिक्सेल त्रिज्या) र FFT ब्यान्डपास फिल्टर (क्रमशः ६० र ८ पिक्सेल माथिल्लो र तल्लो सीमाहरू प्रयोग गरेर) र ५% को अभिमुखीकरण सहिष्णुताको साथ ठाडो रेखा दमन प्रयोग गरेर उल्टो र उल्टो गरिएको छ। प्रशोधित छवि अधिकतम एन्ट्रोपी एल्गोरिथ्म प्रयोग गरेर स्वचालित रूपमा थ्रेसहोल्ड गरिएको छ र बाइनरी मास्क उत्पन्न गरिएको छ। कच्चा TEM छविहरूमा म्यानुअल रूपमा चयन गरिएका ROI सँग सम्बन्धित छवि क्षेत्रहरू निकालिएका थिए, माइटोकोन्ड्रियालाई चित्रण गर्दै र प्लाज्मा झिल्ली र अन्य उच्च-कन्ट्रास्ट क्षेत्रहरू बाहेक। प्रत्येक निकालिएको ROI को लागि, ६०० पिक्सेल भन्दा ठूला बाइनरी कणहरूको विश्लेषण गरिएको थियो, र कण क्षेत्र, परिधि, प्रमुख र माइनर अक्षहरू, फेरेट व्यास, गोलाकारता, र वृत्ताकारता Fiji/ImageJ को निर्मित मापन कार्यहरू प्रयोग गरेर मापन गरिएको थियो। Merrill, Flippo, र Strack (२०१७) पछि, क्षेत्र २, कण पक्ष अनुपात (माइनर अक्ष अनुपात प्रमुख), र आकार कारक (FF) यी डेटाबाट गणना गरिएको थियो, जहाँ FF = परिधि २/४pi x क्षेत्र। प्यारामेट्रिक सूत्रको परिभाषा Merrill, Flippo, र Strack (२०१७) मा पाउन सकिन्छ। उल्लेख गरिएका म्याक्रोहरू GitHub मा उपलब्ध छन् (डेटा उपलब्धता कथन हेर्नुहोस्)। औसतमा, प्रति PPA उपचार लगभग ५,६०० कणहरूको विश्लेषण गरिएको थियो, कुल लगभग १७,००० कणहरूको लागि (डेटा देखाइएको छैन)।
SH-SH5Y कोषहरूलाई रातभर टाँसिन अनुमति दिन ८-चेम्बर कल्चर डिशहरूमा राखिएको थियो (थर्मोफिशर, #१५५४११) र त्यसपछि TMRE १:१००० (थर्मोफिशर, #T669) र Hoechst ३३३४२ १:२०० (सिग्मा-एल्ड्रिच, H6024) सँग इन्क्युबेट गरिएको थियो। रंगाई। १० मिनेटको वातावरणमा ४०५ nm र ५६१ nm लेजरहरू प्रयोग गरेर छविहरू प्राप्त गरिएको थियो, र १२ पछिको समय बिन्दुहरूमा छवि फ्रेमहरू बीच ०.२ μm को az चरणको साथ १० छवि माइक्रोग्राफहरू भएको z-स्ट्याकको रूपमा कच्चा छविहरू प्राप्त गरिएको थियो। LCI प्लान अपोक्रोमेट १००x/१.४ तेल DIC M27 लेन्स प्रयोग गरेर कार्ल Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 सुपर-रिजोल्युसन प्लेटफर्म (कार्ल Zeiss, Oberkochen, जर्मनी) प्रयोग गरेर छविहरू सङ्कलन गरिएको थियो। फ्युजन र फिसन घटनाहरू, माइटोकोन्ड्रियल संरचनाहरूको औसत संख्या, र प्रति सेल औसत माइटोकोन्ड्रियल भोल्युम मापन गर्न पहिले वर्णन गरिएको पाइपलाइन र इमेजजे प्लगइन प्रयोग गरेर ImageJ मा छविहरूको विश्लेषण गरिएको थियो। MEL म्याक्रोहरू GitHub मा उपलब्ध छन् (डेटा उपलब्धता कथन हेर्नुहोस्)।
उपचार गर्नुभन्दा २४ घण्टा अघि ०.३ × १०६ कोष/मिली घनत्वमा छ-कुवा प्लेटहरूमा SH-SY5Y कोषहरू हुर्काइएका थिए। RNA लाई Quick-RNA™ Miniprep प्रोटोकल (ZR R1055, Zymo Research) प्रयोग गरेर थोरै परिमार्जनहरू सहित निकालिएको थियो: हटाउनु अघि प्रत्येक कुवामा ३०० μl RNA lysis बफर थप्नुहोस् र प्रत्येक नमूनालाई ३० μl DNase/RNase इल्युसनको साथ अन्तिम चरणको रूपमा लाइज गर्नुहोस्। -मुक्त पानी। सबै नमूनाहरूलाई NanoDrop ND-1000 UV-Vis स्पेक्ट्रोफोटोमिटर प्रयोग गरेर मात्रा र गुणस्तरको लागि जाँच गरिएको थियो। सेल लाइसेट्सबाट कुल प्रोटीन २०० μl RIPA lysis बफर प्रयोग गरेर प्राप्त गरिएको थियो, र प्रोटीन सांद्रतालाई Bradford प्रोटीन परख ७० प्रयोग गरेर परिमाण गरिएको थियो।
निर्माताको निर्देशन अनुसार केही परिमार्जनहरू सहित Tetro™ cDNA संश्लेषण किट (BIO-65043, Meridian Bioscience) प्रयोग गरेर cDNA संश्लेषण गरिएको थियो। cDNA लाई कुल RNA को 0.7 देखि 1 μg प्रयोग गरेर 20-μl प्रतिक्रियाहरूमा संश्लेषित गरिएको थियो। पहिले प्रकाशित पेपरहरू 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (तालिका S1) बाट प्राइमरहरू चयन गरिएको थियो र सँगैका प्रोबहरू Integrated DNA Technologies बाट PrimerQuest उपकरण प्रयोग गरेर डिजाइन गरिएको थियो। रुचिका सबै जीनहरूलाई आणविक B2M जीनमा सामान्यीकृत गरिएको थियो। STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC र OPA1 को जीन अभिव्यक्ति RT-qPCR द्वारा मापन गरिएको थियो। मास्टर मिक्समा LUNA Taq पोलिमरेज (M3003L, New England Biolabs), १० μM फर्वार्ड र रिभर्स प्राइमर, cDNA, र PCR-ग्रेड पानी समावेश थियो जसले प्रत्येक प्रतिक्रियाको लागि १० μL को अन्तिम मात्रा प्रदान गर्‍यो। TaqMan मल्टिप्लेक्स एसेज प्रयोग गरेर विभाजन र विखंडन जीनको अभिव्यक्ति (DRP1, MFN1/2) मापन गरिएको थियो। Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) निर्माताको निर्देशन अनुसार सानो परिमार्जन सहित प्रयोग गरिएको थियो। मल्टिप्लेक्स RT-qPCR मास्टर मिक्समा १X LUNA Taq पोलिमरेज, १० μM फर्वार्ड र रिभर्स प्राइमर, १० μM प्रोब, cDNA, र PCR-ग्रेड पानी समावेश छ, जसको परिणामस्वरूप प्रत्येक प्रतिक्रियाको लागि २० μL को अन्तिम मात्रा प्राप्त भयो। RT-qPCR रोटर-जीन Q ६-प्लेक्स (QIAGEN RG—सिरियल नम्बर: R0618110) प्रयोग गरेर गरिएको थियो। साइकल चलाउने अवस्थाहरू तालिका S1 मा देखाइएको छ। सबै cDNA नमूनाहरूलाई त्रिप्रतिकृतिमा प्रवर्द्धन गरिएको थियो र दस गुणा पातलोपनको श्रृंखला प्रयोग गरेर एक मानक वक्र उत्पन्न गरिएको थियो। डेटा पुनरुत्पादनक्षमता सुनिश्चित गर्न चक्र थ्रेसहोल्ड मानक विचलन (Ct) > ०.५ भएका त्रिप्रतिकृत नमूनाहरूमा आउटलियरहरू विश्लेषणबाट हटाइयो ३०,७२। २-ΔΔCt७९ विधि प्रयोग गरेर सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति गणना गरिएको थियो।
प्रोटिन नमूनाहरू (६० μg) लाई २:१ अनुपातमा Laemmli लोडिङ बफरसँग मिसाइयो र १२% रंगहीन प्रोटिन जेल (बायो-रेड #१६१०१८४) मा चलाइयो। ट्रान्स-ब्लट टर्बो प्रणाली (#१७०-४१५५, बायो-रेड) प्रयोग गरेर प्रोटिनहरूलाई PVDF (पोलिभिनिलिडेन फ्लोराइड) झिल्ली (#१७०-८४१५६, बायो-रेड) मा स्थानान्तरण गरियो। झिल्लीलाई ४८ घण्टाको लागि उपयुक्त प्राथमिक एन्टिबडीहरू (OPA1, MFN1, MFN2, र DRP1) (पातलो १:१०००) सँग ब्लक गरियो र इन्क्युबेट गरियो, त्यसपछि १ घण्टाको लागि माध्यमिक एन्टिबडीहरू (१:१०,०००) सँग इन्क्युबेट गरियो। त्यसपछि झिल्लीहरूलाई स्पष्टता पश्चिमी ECL सब्सट्रेट (#१७०-५०६१, बायो-रेड) प्रयोग गरेर छवि बनाइयो र बायो-रेड केमीडोक MP प्रणाली प्रयोग गरेर रेकर्ड गरियो। पश्चिमी ब्लट विश्लेषणको लागि ImageLab संस्करण ६.१ प्रयोग गरिएको थियो। मूल जेल र ब्लट चित्र S1 मा देखाइएको छ। एन्टिबडी जानकारी तालिका S2 मा प्रदान गरिएको छ।
डेटा सेटहरूलाई कम्तिमा तीन स्वतन्त्र नमूनाहरूको औसत (SEM) को औसत र मानक त्रुटिको रूपमा प्रस्तुत गरिन्छ। गाउसियन वितरण र समान मानक विचलनहरू मान्नु र विश्लेषणहरू अगाडि बढाउनु अघि शापिरो-विल्क्स परीक्षण (अन्यथा भनिएको बाहेक) प्रयोग गरेर डेटा सेटहरूको सामान्यताको लागि परीक्षण गरिएको थियो। फिशरको MEL LSD (p < ०.०५), एकतर्फी ANOVA (उपचार बनाम नियन्त्रण औसत), र महत्त्व निर्धारण गर्न डनेटको बहु तुलना परीक्षण (p < ०.०५) प्रयोग गरेर डेटा सेटको विश्लेषण गर्नुको साथै। ग्राफमा महत्त्वपूर्ण p मानहरू *p < ०.०५, **p < ०.०१, ***p < ०.००१, ****p < ०.०००१ को रूपमा देखाइएका छन्। सबै सांख्यिकीय विश्लेषण र ग्राफहरू ग्राफप्याड प्रिज्म ९.४.० प्रयोग गरेर प्रदर्शन र उत्पन्न गरिएको थियो।
TEM छवि विश्लेषणको लागि Fiji/ImageJ म्याक्रोहरू GitHub मा सार्वजनिक रूपमा उपलब्ध छन्: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro। Mitochondrial Event Locator (MEL) म्याक्रो GitHub मा सार्वजनिक रूपमा उपलब्ध छ: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin।
मेइलियाना ए., देवी एनएम र विजया ए. माइटोकोन्ड्रिया: मेटाबोलिज्म, होमियोस्टेसिस, तनाव, बुढ्यौली र एपिजेनेटिक्सका मास्टर रेगुलेटरहरू। इन्डोनेसियाली। बायोमेडिकल साइन्स। जे. १३, २२१–२४१ (२०२१)।
बेन-शाचर, डी. सिजोफ्रेनियामा बहुआयामिक माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शन, सम्भावित रोगजनक लक्ष्यको रूपमा जटिल I। सिजोफ्रेनिया। स्रोत। १८७, ३-१० (२०१७)।
बोस, ए. र बील, एमएफ पार्किन्सन रोगमा माइटोकन्ड्रियल डिसफंक्शन। जे. न्यूरोकेमिस्ट्री। १३९, २१६–२३१ (२०१६)।
शर्मा वीके, सिंह टीजी र मेहता वी। तनावग्रस्त माइटोकोन्ड्रिया: अल्जाइमर रोगमा आक्रमणको लक्ष्य। माइटोकोन्ड्रिया ५९, ४८–५७ (२०२१)।
बेलेन्गुअर पी., डुआर्टे जेएमएन, शुक पीएफ र फेरेरा जीके माइटोकोन्ड्रिया र मस्तिष्क: बायोएनर्जेटिक्स र थप। न्यूरोटोक्सिन। स्रोत। ३६, २१९–२३८ (२०१९)।
रंगराजु, भी. एट अल. प्लियोट्रोपिक माइटोकोन्ड्रिया: न्यूरोनल विकास र रोगमा माइटोकोन्ड्रियाको प्रभाव। जे. न्यूरोसाइन्स। ३९, ८२००–८२०८ (२०१९)।
कार्डानो-रामोस, सी. र मोरैस, VA न्यूरोन्समा माइटोकोन्ड्रियल बायोजेनेसिस: कसरी र कहाँ। अन्तर्राष्ट्रियता। जे. मोहर। विज्ञान। २२, १३०५९ (२०२१)।
यु, आर., लेन्डाहल, यू., निस्टर, एम. र झाओ, जे. स्तनधारी माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलताको नियमन: अवसर र चुनौतीहरू। अगाडि। अन्तःस्रावी। (लौसेन) ११, ३७४ (२०२०)।
खाचो, एम. र स्ल्याक, आरएस न्यूरोजेनेसिसको नियमनमा माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलता: विकासशील देखि वयस्क मस्तिष्क सम्म। विकास। गतिशील। २४७, ४७–५३ (२०१८)।