हालको *हालको ठेगाना: कोलोन ५०९३१, जर्मनी, कोलोन एक्सिलेन्स क्लस्टर रिसर्च अन सेलुलर स्ट्रेस रेस्पोन्स इन एजिङ-सम्बन्धित रोगहरू (CECAD)।
माइटोकोन्ड्रियल रोगहरूको न्यूरोडिजेनेरेसनलाई अपरिवर्तनीय मानिन्छ किनभने न्यूरोन्सको मेटाबोलिक प्लास्टिसिटी सीमित छ, तर शरीरमा न्यूरोनल मेटाबोलिज्मको कोशिका स्वायत्ततामा माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शनको प्रभावलाई राम्ररी बुझिएको छैन। यहाँ, हामी बाधित माइटोकोन्ड्रियल फ्युजन गतिशीलताको कारणले प्रगतिशील OXPHOS कमी भएको Purkinje न्यूरोन्सको सेल-विशिष्ट प्रोटियोम परिचय गराउँछौं। हामीले पत्ता लगायौं कि माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शनले प्रोटियोमिक्सको क्षेत्रमा गहिरो परिवर्तन ट्रिगर गर्‍यो, जसले अन्ततः कोशिका मृत्यु हुनुभन्दा पहिले सटीक मेटाबोलिक कार्यक्रमहरूको क्रमिक सक्रियता निम्त्यायो। अप्रत्याशित रूपमा, हामीले TCA चक्रको मध्यवर्तीहरूलाई पूरक गर्ने पाइरुभेट कार्बोक्सिलेज (PCx) र अन्य एन्टी-एजिंग इन्जाइमहरूको स्पष्ट प्रेरण निर्धारण गर्‍यौं। PCx को अवरोधले अक्सिडेटिभ तनाव र न्यूरोडिजेनेरेसनलाई बढायो, जसले OXPHOS को अभाव भएका न्यूरोन्सहरूमा एथेरोस्क्लेरोसिसको सुरक्षात्मक प्रभाव रहेको संकेत गर्दछ। टर्मिनली डिजेनेरेटेड न्यूरोन्समा माइटोकोन्ड्रियल फ्युजनको पुनर्स्थापनाले यी मेटाबोलिक विशेषताहरूलाई पूर्ण रूपमा उल्ट्याउँछ, जसले गर्दा कोशिका मृत्युलाई रोक्छ। हाम्रा निष्कर्षहरूले पहिले अज्ञात मार्गहरू पहिचान गर्छन् जसले माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शनलाई लचिलोपन प्रदान गर्दछ र देखाउँछ कि रोगको अन्तिम चरणहरूमा पनि न्यूरोडिजेनेरेसन उल्ट्याउन सकिन्छ।
मानव माइटोकोन्ड्रियल रोगहरूसँग सम्बन्धित व्यापक न्यूरोलोजिकल लक्षणहरूले न्यूरोनल ऊर्जा चयापचय कायम राख्न माइटोकोन्ड्रियाको केन्द्रीय भूमिकालाई जोड दिन्छ। यी धेरैजसो रोगहरू माइटोकोन्ड्रियल जीन अभिव्यक्ति (१, २) लाई नियमन गर्ने जीन उत्परिवर्तन वा माइटोकोन्ड्रियल गतिशीलतासँग सम्बन्धित जीन विनाशको कारणले हुन्छन्, जसले अप्रत्यक्ष रूपमा माइटोकोन्ड्रियल डीएनए (mtDNA) (३, ४) को स्थिरतालाई असर गर्छ। पशु मोडेलहरूमा कामले देखाएको छ कि वरपरका तन्तुहरूमा माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शनको प्रतिक्रियामा, रूढिवादी मेटाबोलिक मार्गहरू (५-७) सक्रिय गर्न सकिन्छ, जसले यी जटिल रोगहरूको रोगजननको गहन बुझाइको लागि महत्त्वपूर्ण जानकारी प्रदान गर्दछ। यसको विपरीत, मस्तिष्क माइटोकोन्ड्रियल एडेनोसिन ट्राइफोस्फेट (ATP) उत्पादनको सामान्य विफलताको कारणले हुने विशिष्ट कोशिका प्रकारहरूको मेटाबोलिक परिवर्तनहरूको हाम्रो बुझाइ आधारभूत छ (८), रोग रोक्न वा रोक्न प्रयोग गर्न सकिने उपचारात्मक लक्ष्यहरू पहिचान गर्ने आवश्यकतालाई जोड दिन्छ। न्यूरोडिजेनेरेशन रोक्नुहोस् (९)। जानकारीको अभाव भनेको वरपरका तन्तुहरूको कोशिका प्रकारहरूको तुलनामा स्नायु कोशिकाहरूलाई व्यापक रूपमा धेरै सीमित मेटाबोलिक लचिलोपन भएको मानिन्छ भन्ने तथ्य हो (१०)। यी कोषहरूले सिन्याप्टिक प्रसारणलाई प्रवर्द्धन गर्न र चोटपटक र रोगको अवस्थाहरूमा प्रतिक्रिया दिन न्यूरोन्समा मेटाबोलाइट्सको आपूर्ति समन्वय गर्न केन्द्रीय भूमिका खेल्ने भएकोले, मस्तिष्कको तन्तुको चुनौतीपूर्ण अवस्थाहरूमा कोशिका मेटाबोलिज्म अनुकूलन गर्ने क्षमता लगभग ग्लियल कोशिकाहरूमा सीमित छ (११-१४)। थप रूपमा, मस्तिष्कको तन्तुको अन्तर्निहित सेलुलर विषमताले विशिष्ट न्यूरोनल उपसमूहहरूमा हुने मेटाबोलिक परिवर्तनहरूको अध्ययनमा ठूलो मात्रामा बाधा पुर्‍याउँछ। फलस्वरूप, न्यूरोन्समा माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शनको सही सेलुलर र मेटाबोलिक परिणामहरूको बारेमा थोरै मात्र थाहा छ।
माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शनको मेटाबोलिक परिणामहरू बुझ्नको लागि, हामीले माइटोकोन्ड्रियल बाहिरी झिल्ली फ्युजन (Mfn2) को विनाशको कारणले हुने न्यूरोडिजेनेरेसनको विभिन्न चरणहरूमा पुर्किन्जे न्यूरोन्स (PNs) लाई अलग गर्यौं। यद्यपि मानवमा Mfn2 उत्परिवर्तनहरू Charcot-Marie-Tooth प्रकार 2A (15) भनेर चिनिने वंशानुगत मोटर सेन्सरी न्यूरोपैथीको रूपसँग सम्बन्धित छन्, मुसामा Mfn2 को सशर्त विनाश अक्सिडेशनको राम्रोसँग मान्यता प्राप्त प्रेरण हो। फास्फोरिलेसन (OXPHOS) डिसफंक्शन विधि। विभिन्न न्यूरोनल उपप्रकारहरू (16-19) र परिणामस्वरूप न्यूरोडिजेनेरेटिभ फेनोटाइप प्रगतिशील न्यूरोलोजिकल लक्षणहरू, जस्तै आन्दोलन विकारहरू (18, 19) वा सेरेबेलर एटेक्सिया (16) सँगसँगै हुन्छन्। लेबल-मुक्त मात्रात्मक (LFQ) प्रोटियोमिक्स, मेटाबोलोमिक्स, इमेजिङ, र भाइरोलोजिकल विधिहरूको संयोजन प्रयोग गरेर, हामी देखाउँछौं कि प्रगतिशील न्यूरोडिजेनेरेसनले पाइरुभेट कार्बोक्सिलेज (PCx) र एन्जाइमहरूको अभिव्यक्तिमा संलग्न PNs को धमनी स्क्लेरोसिसमा संलग्न अन्य कारकहरूलाई दृढतापूर्वक प्रेरित गर्दछ। यस खोजको सान्दर्भिकता प्रमाणित गर्न, हामीले विशेष रूपमा Mfn2-कमी PNs मा PCx को अभिव्यक्तिलाई डाउन-रेगुलेट गर्यौं, र यो अपरेशनले अक्सिडेटिभ तनाव र द्रुत न्यूरोडिजेनेरेसनलाई बढाएको पत्ता लगायौं, यसरी प्रमाणित गर्यौं कि एजुस्पर्मियाले कोशिका मृत्यु मेटाबोलिक अनुकूलन क्षमता प्रदान गर्दछ। MFN2 को गम्भीर अभिव्यक्तिले गम्भीर OXPHOS कमी, माइटोकोन्ड्रियल DNA को ठूलो खपत, र स्पष्ट रूपमा भाँचिएको माइटोकोन्ड्रियल नेटवर्कको साथ टर्मिनल डिजेनेरेसन PN लाई पूर्ण रूपमा बचाउन सक्छ, जसले थप जोड दिन्छ कि न्यूरोडिजेनेरेसनको यो रूप कोशिका मृत्यु हुनुभन्दा पहिले रोगको उन्नत चरणमा पनि निको हुन सक्छ।
Mfn2 नकआउट PNs मा माइटोकोन्ड्रियालाई कल्पना गर्नको लागि, हामीले Cre-निर्भर माइटोकोन्ड्रियालाई पहेंलो फ्लोरोसेन्ट प्रोटीन (YFP) (mtYFP) (20) Cre अभिव्यक्तिलाई लक्षित गर्न अनुमति दिने माउस स्ट्रेन प्रयोग गर्यौं र भिभोमा माइटोकोन्ड्रियल मोर्फोलजी जाँच गर्यौं। हामीले पत्ता लगायौं कि PNs मा Mfn2 जीनको विनाशले माइटोकोन्ड्रियल नेटवर्कको क्रमिक विभाजन (चित्र S1A) निम्त्याउनेछ, र सबैभन्दा पहिले परिवर्तन 3 हप्ताको उमेरमा फेला पर्यो। यसको विपरित, Calbindin इम्युनोस्टेनिङको क्षतिबाट प्रमाणित PN कोशिका तहको पर्याप्त पतन 12 हप्ताको उमेरसम्म सुरु भएन (चित्र 1, A र B)। माइटोकोन्ड्रियल मोर्फोलजीमा प्रारम्भिक परिवर्तनहरू र न्यूरोनल मृत्युको दृश्यात्मक सुरुवात बीचको समय बेमेलले हामीलाई कोशिका मृत्यु हुनुभन्दा पहिले माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शनद्वारा ट्रिगर गरिएका मेटाबोलिक परिवर्तनहरूको अनुसन्धान गर्न प्रेरित गर्‍यो। हामीले YFP (YFP+)-व्यक्त गर्ने PN (चित्र 1C) लाई अलग गर्न र नियन्त्रण मुसाहरूमा (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre) लाई फ्लोरोसेन्स-सक्रिय सेल सॉर्टिङ (FACS)-आधारित रणनीति विकास गर्यौं, जसलाई यसपछि CTRL (चित्र S1B) भनिन्छ। YFP सिग्नलको सापेक्षिक तीव्रतामा आधारित गेटिङ रणनीतिको अनुकूलनले हामीलाई PNs को YFP+ शरीर (YFPhigh) लाई गैर-PNs (YFPneg) (चित्र S1B) वा पुटेटिभ फ्लोरोसेन्ट एक्सन/डेन्ड्रिटिक टुक्राहरू (YFPlow; चित्र S1D, बायाँ) बाट शुद्ध गर्न अनुमति दिन्छ, जुन कन्फोकल माइक्रोस्कोप (चित्र S1D, दायाँ) द्वारा पुष्टि गरिएको छ। वर्गीकृत जनसंख्याको पहिचान प्रमाणित गर्न, हामीले LFQ प्रोटियोमिक्स र त्यसपछि प्रमुख घटक विश्लेषण गर्यौं, र YFPhigh र YFPneg कोषहरू (चित्र S1C) बीच स्पष्ट विभाजन भएको पायौं। YFPhigh कोषहरूले ज्ञात PNs मार्करहरूको नेट संवर्धन देखाए (जस्तै Calb1, Pcp2, Grid2 र Itpr3) (21, 22), तर न्यूरोन्स वा अन्य कोष प्रकारहरूमा सामान्यतया व्यक्त गरिएको प्रोटीनको संवर्धन देखाएन (चित्र 1D)। स्वतन्त्र प्रयोगहरूमा सङ्कलन गरिएका वर्गीकृत YFPhigh कोषहरूमा नमूनाहरू बीचको तुलनाले सहसम्बन्ध गुणांक> 0.9 देखायो, जैविक प्रतिकृतिहरू बीच राम्रो प्रजनन क्षमता प्रदर्शन गर्दै (चित्र S1E)। संक्षेपमा, यी डेटाले सम्भाव्य PN को तीव्र र विशिष्ट अलगावको लागि हाम्रो योजनालाई प्रमाणित गर्‍यो। किनभने L7-cre ड्राइभर प्रणालीले डेलिभरी पछि पहिलो हप्तामा मोज़ेक पुनर्संयोजनलाई प्रेरित गर्दछ (23), हामीले CTRL बाट मुसाहरू हटाउन थाल्यौं र सशर्त (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) न्यूरोन्स सङ्कलन गर्यौं। पुनर्संयोजन पूरा भएपछि, यसलाई 4 हप्ताको उमेरमा Mfn2cKO भनिन्छ। अन्तिम बिन्दुको रूपमा, हामीले ८ हप्ताको उमेर रोज्यौं जब स्पष्ट माइटोकोन्ड्रियल विखंडनको बावजुद PN तह अक्षुण्ण थियो (चित्र १B र चित्र S1A)। कुलमा, हामीले कुल ३०१३ प्रोटिनहरूको परिमाण निर्धारण गर्यौं, जसमध्ये लगभग २२% माइटोकोन्ड्रियल प्रोटियोममा आधारित मिटोकार्टा २.० एनोटेसनमा आधारित थिए जुन माइटोकोन्ड्रियल (चित्र १E) (चित्र १E) (२४) को रूपमा थियो। हप्ता ८ मा गरिएको भिन्न जीन अभिव्यक्ति विश्लेषणले देखाएको छ कि सबै प्रोटिनहरूको केवल १०.५% मा महत्त्वपूर्ण परिवर्तनहरू थिए (चित्र १F र चित्र S1F), जसमध्ये १९५ प्रोटिनहरू डाउन-रेगुलेटेड थिए र १२० प्रोटिनहरू अप-रेगुलेटेड थिए (चित्र १F)। यो ध्यान दिन लायक छ कि यस डेटा सेटको "नवीन मार्ग विश्लेषण" ले देखाउँछ कि भिन्न रूपमा व्यक्त गरिएका जीनहरू मुख्यतया विशिष्ट मेटाबोलिक मार्गहरूको प्रतिबन्धित सेटसँग सम्बन्धित छन् (चित्र १G)। चाखलाग्दो कुरा के छ भने, OXPHOS र क्याल्सियम सिग्नलिङसँग सम्बन्धित मार्गहरूको डाउनरेगुलेसनले फ्युजन-कमी भएका PNs मा माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शनको प्रेरणा पुष्टि गरे तापनि, मुख्यतया एमिनो एसिड मेटाबोलिज्म समावेश गर्ने अन्य कोटीहरू उल्लेखनीय रूपमा माथि उठाइएका छन्, जुन माइटोकोन्ड्रियल PNs मा हुने मेटाबोलिज्मसँग मिल्दोजुल्दो छ। रिवायरिङ स्थिर छ। डिसफंक्शन।
(A) CTRL र Mfn2cKO मुसाहरूको सेरेबेलर खण्डहरूको प्रतिनिधि कन्फोकल तस्बिरहरू जसले PNs (क्याल्बिन्डिन, खैरो) को प्रगतिशील क्षति देखाउँछ; केन्द्रकलाई DAPI सँग काउन्टरस्टेन गरिएको थियो। (B) (A) को परिमाणीकरण (भिन्नताको एकतर्फी विश्लेषण, ***P<0.001; n = तीन मुसाबाट ४ देखि ६ सर्कलहरू)। (C) प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह। (D) Purkinje (माथि) र अन्य कोशिका प्रकारहरू (मध्य) को लागि विशिष्ट मार्करहरूको ताप नक्सा वितरण। (E) वर्गीकृत PN मा पहिचान गरिएको माइटोकोन्ड्रियल प्रोटीनहरूको संख्या देखाउने भेन रेखाचित्र। (F) ८ हप्तामा Mfn2cKO न्यूरोन्समा भिन्न रूपमा व्यक्त गरिएको प्रोटीनको ज्वालामुखी प्लट (१.३ को महत्त्वपूर्ण कट-अफ मान)। (G) रचनात्मकता मार्ग विश्लेषणले ८ हप्ताको रूपमा वर्गीकृत Mfn2cKO PN मा पाँच सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण अप-रेगुलेसन (रातो) र डाउन-रेगुलेसन (नीलो) मार्गहरू देखाउँछ। प्रत्येक पत्ता लगाइएको प्रोटीनको औसत अभिव्यक्ति स्तर देखाइएको छ। ग्रेस्केल ताप नक्सा: समायोजित P मान। ns, महत्त्वपूर्ण छैन।
प्रोटियोमिक्स डेटाले देखाएको छ कि जटिल I, III, र IV को प्रोटीन अभिव्यक्ति बिस्तारै घट्यो। जटिल I, III, र IV सबैमा आवश्यक mtDNA-इन्कोडेड सबयुनिटहरू थिए, जबकि जटिल II, जुन केवल आणविक-कोड गरिएको थियो, मूल रूपमा अप्रभावित थियो (चित्र 2A र चित्र S2A)। । प्रोटियोमिक्स परिणामहरूसँग मिल्दोजुल्दो, सेरेबेलर टिस्यु सेक्सनहरूको इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्रीले देखायो कि PN मा जटिल IV को MTCO1 (माइटोकोन्ड्रियल साइटोक्रोम C अक्सिडेज सबयुनिट 1) सबयुनिट स्तर बिस्तारै घट्यो (चित्र 2B)। mtDNA-इन्कोडेड सबयुनिट Mtatp8 उल्लेखनीय रूपमा घट्यो (चित्र S2A), जबकि आणविक-इन्कोडेड ATP सिन्थेस सबयुनिटको स्थिर-स्थिति स्तर अपरिवर्तित रह्यो, जुन mtDNA अभिव्यक्ति स्थिर हुँदा ज्ञात स्थिर ATP सिन्थेस सबयुनिट F1 जटिलसँग मिल्दोजुल्दो छ। गठन एकरूप छ। अवरोध (7)। क्रमबद्ध Mfn2cKO PNs मा mtDNA स्तरको वास्तविक-समय पोलिमरेज चेन रियाक्सन (qPCR) द्वारा मूल्याङ्कन गरिएको mtDNA प्रतिलिपि संख्यामा क्रमिक कमी पुष्टि भयो। नियन्त्रण समूहको तुलनामा, ८ हप्ताको उमेरमा, mtDNA स्तरको लगभग २०% मात्र कायम राखिएको थियो (चित्र २C)। यी नतिजाहरूसँग मिल्दोजुल्दो, Mfn2cKO PNs को कन्फोकल माइक्रोस्कोपी स्टेनिङ DNA पत्ता लगाउन प्रयोग गरिएको थियो, जसले माइटोकोन्ड्रियल न्यूक्लियोटाइड्सको समय-निर्भर खपत देखाउँछ (चित्र २D)। हामीले पत्ता लगायौं कि माइटोकोन्ड्रियल प्रोटीन डिग्रेडेसन र तनाव प्रतिक्रियामा संलग्न केही उम्मेदवारहरू मात्र अप-रेगुलेट गरिएका थिए, जसमा Lonp1, Afg3l2 र Clpx, र OXPHOS जटिल असेंबली कारकहरू समावेश छन्। एपोप्टोसिसमा संलग्न प्रोटीनहरूको स्तरमा कुनै महत्त्वपूर्ण परिवर्तनहरू पत्ता लागेनन् (चित्र S2B)। त्यस्तै गरी, हामीले पत्ता लगायौं कि क्याल्सियम यातायातमा संलग्न माइटोकोन्ड्रिया र एन्डोप्लाज्मिक रेटिकुलम च्यानलहरूमा मात्र सानो परिवर्तनहरू छन् (चित्र S2C)। यसको अतिरिक्त, अटोफेजी-सम्बन्धित प्रोटीनहरूको मूल्याङ्कनले कुनै महत्त्वपूर्ण परिवर्तनहरू फेला पारेन, जुन इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री र इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोपी (चित्र S3) द्वारा भिभोमा अवलोकन गरिएको अटोफ्यागोसोमहरूको दृश्यात्मक प्रेरणसँग मेल खान्छ। यद्यपि, PNs मा प्रगतिशील OXPHOS डिसफंक्शन स्पष्ट अल्ट्रास्ट्रक्चरल माइटोकोन्ड्रियल परिवर्तनहरूसँग छ। 5 र 8 हप्ता उमेरका Mfn2cKO PNs को कोशिका निकायहरू र डेन्ड्रिटिक रूखहरूमा माइटोकोन्ड्रियल क्लस्टरहरू देख्न सकिन्छ, र भित्री झिल्ली संरचनामा गहिरो परिवर्तनहरू भएका छन् (चित्र S4, A र B)। यी अल्ट्रास्ट्रक्चरल परिवर्तनहरू र mtDNA मा उल्लेखनीय कमीसँग मेल खाने, टेट्रामेथिलरोडामाइन मिथाइल एस्टर (TMRM) सँग तीव्र सेरेब्रल सेरेबेलर स्लाइसहरूको विश्लेषणले Mfn2cKO PNs मा माइटोकोन्ड्रियल झिल्ली क्षमता उल्लेखनीय रूपमा घटेको देखाएको छ (चित्र S4C)।
(A) OXPHOS जटिलको अभिव्यक्ति स्तरको समय पाठ्यक्रम विश्लेषण। ८ हप्तामा P<0.05 भएका प्रोटिनहरूलाई मात्र विचार गर्नुहोस् (दुई-तर्फी ANOVA)। डटेड लाइन: CTRL को तुलनामा कुनै समायोजन छैन। (B) बायाँ: एन्टी-MTCO1 एन्टिबडी (स्केल बार, २० μm) ले लेबल गरिएको सेरेबेलर खण्डको उदाहरण। पुर्किन्जे कोशिका निकायहरूले ओगटेको क्षेत्र पहेंलोले ढाकिएको छ। दायाँ: MTCO1 स्तरहरूको परिमाणीकरण (भिन्नताको एकतर्फी विश्लेषण; n = तीन मुसाहरूबाट विश्लेषण गरिएको ७ देखि २० कोशिकाहरू)। (C) क्रमबद्ध PN मा mtDNA प्रतिलिपि नम्बरको qPCR विश्लेषण (भिन्नताको एकतर्फी विश्लेषण; n = ३ देखि ७ मुसाहरू)। (D) बायाँ: एन्टी-DNA एन्टिबडी (स्केल बार, २० μm) ले लेबल गरिएको सेरेबेलर स्लाइसको उदाहरण। पुर्किन्जे कोशिका निकायहरूले ओगटेको क्षेत्र पहेंलोले ढाकिएको छ। दायाँ: mtDNA घावहरूको परिमाणीकरण (भिन्नताको एकतर्फी विश्लेषण; n = तीन मुसाहरूबाट ५ देखि ९ कोशिकाहरू)। (E) पूर्ण-सेल प्याच क्ल्याम्प रेकर्डिङमा mitoYFP + Purkinje कोषहरू (तीर) देखाउने तीव्र सेरेबेलर खण्डको उदाहरण। (F) IV वक्रको परिमाणीकरण। (G) CTRL र Mfn2cKO Purkinje कोषहरूमा डिपोलराइजिङ करेन्ट इन्जेक्सनको प्रतिनिधि रेकर्डिङहरू। शीर्ष ट्रेस: ​​AP ट्रिगर गर्ने पहिलो पल्स। तल्लो ट्रेस: ​​अधिकतम AP फ्रिक्वेन्सी। (H) पोस्टसिन्याप्टिक सहज इनपुटहरू (sPSPs) को परिमाणीकरण। प्रतिनिधि रेकर्डिङ ट्रेस र यसको जुम अनुपात (I) मा देखाइएको छ। तीन मुसाहरूबाट n = 5 देखि 20 कोषहरूको विश्लेषण गरिएको भिन्नताको एकतर्फी विश्लेषण। डेटा औसत ± SEM को रूपमा व्यक्त गरिन्छ; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001। (J) छिद्रित प्याच क्ल्याम्प मोड प्रयोग गरेर रेकर्ड गरिएको सहज AP को प्रतिनिधि ट्रेसहरू। शीर्ष ट्रेस: ​​अधिकतम AP फ्रिक्वेन्सी। तल्लो ट्रेस: ​​एकल AP को जुम। (K) (J) अनुसार औसत र अधिकतम AP फ्रिक्वेन्सीको परिमाण निर्धारण गर्नुहोस्। मान-ह्विटनी परीक्षण; n = 5 कोषहरू चार मुसाहरूबाट विश्लेषण गरिएको थियो। डेटा औसत±SEM को रूपमा व्यक्त गरिन्छ; महत्त्वपूर्ण छैन।
८ हप्ता पुरानो Mfn2cKO PN मा स्पष्ट OXPHOS क्षति पत्ता लागेको थियो, जसले न्यूरोन्सको शारीरिक कार्य गम्भीर रूपमा असामान्य छ भनेर संकेत गर्दछ। त्यसकारण, हामीले तीव्र सेरेबेलर स्लाइसहरूमा सम्पूर्ण-सेल प्याच क्ल्याम्प रेकर्डिङहरू प्रदर्शन गरेर ४ देखि ५ हप्ता र ७ देखि ८ हप्तामा OXPHOS-कमी भएका न्यूरोन्सहरूको निष्क्रिय विद्युतीय विशेषताहरूको विश्लेषण गर्यौं (चित्र २E)। अप्रत्याशित रूपमा, Mfn2cKO न्यूरोन्सको औसत आराम गर्ने झिल्ली क्षमता र इनपुट प्रतिरोध नियन्त्रण जस्तै थियो, यद्यपि कोषहरू बीच सूक्ष्म भिन्नताहरू थिए (तालिका १)। त्यस्तै गरी, ४ देखि ५ हप्ताको उमेरमा, वर्तमान-भोल्टेज सम्बन्ध (IV वक्र) मा कुनै महत्त्वपूर्ण परिवर्तनहरू फेला परेनन् (चित्र २F)। यद्यपि, ७ देखि ८ हप्ता पुरानो कुनै पनि Mfn2cKO न्यूरोन्स IV आहार (हाइपरपोलराइजेशन चरण) बाट बचेनन्, जसले यो ढिलो चरणमा हाइपरपोलराइजेशन क्षमताको लागि स्पष्ट संवेदनशीलता रहेको संकेत गर्दछ। यसको विपरित, Mfn2cKO न्यूरोनहरूमा, दोहोरिने कार्य क्षमता (AP) डिस्चार्जहरू निम्त्याउने डिपोलराइजिंग करेन्टहरू राम्रोसँग सहन सकिन्छ, जसले संकेत गर्दछ कि तिनीहरूको समग्र डिस्चार्ज ढाँचाहरू 8-हप्ता पुरानो नियन्त्रण न्यूरोनहरू भन्दा उल्लेखनीय रूपमा फरक छैनन् (तालिका 1 र चित्र 2G)। त्यस्तै गरी, सहज पोस्टसिन्याप्टिक करेन्टहरू (sPSCs) को आवृत्ति र आयाम नियन्त्रण समूहको जस्तै थियो, र घटनाहरूको आवृत्ति 4 हप्ताबाट 5 हप्तादेखि 7 हप्तादेखि 8 हप्तासम्म समान वृद्धिको साथ बढ्यो (चित्र 2, H र I)। PNs मा सिन्याप्टिक परिपक्वताको अवधि (25)। छिद्रित PNs प्याचहरू पछि समान परिणामहरू प्राप्त गरियो। यो कन्फिगरेसनले सेलुलर ATP दोषहरूको सम्भावित क्षतिपूर्तिलाई रोक्छ, जस्तै सम्पूर्ण-सेल प्याच क्ल्याम्प रेकर्डिङमा हुन सक्छ। विशेष गरी, Mfn2cKO न्यूरोनहरूको आराम गर्ने झिल्ली क्षमता र सहज फायरिङ आवृत्ति प्रभावित भएन (चित्र 2, J र K)। संक्षेपमा, यी नतिजाहरूले संकेत गर्दछ कि स्पष्ट OXPHOS डिसफंक्शन भएका PN हरूले उच्च-फ्रिक्वेन्सी डिस्चार्ज ढाँचाहरूसँग राम्रोसँग सामना गर्न सक्छन्, जसले संकेत गर्दछ कि त्यहाँ एक क्षतिपूर्ति संयन्त्र छ जसले तिनीहरूलाई लगभग सामान्य इलेक्ट्रोफिजियोलोजिकल प्रतिक्रियाहरू कायम राख्न अनुमति दिन्छ।
डेटालाई औसत ± SEM (भिरियन्सको एकतर्फी विश्लेषण, होल्म-सिडाकको बहु तुलना परीक्षण; *P<0.05) को रूपमा व्यक्त गरिन्छ। एकाइ नम्बर कोष्ठकद्वारा संकेत गरिएको छ।
हामीले प्रोटियोमिक्स डेटासेट (चित्र १G) मा कुनै पनि श्रेणीमा गम्भीर OXPHOS कमीलाई प्रतिरोध गर्न सक्ने मार्गहरू समावेश छन् कि छैनन् भनेर अनुसन्धान गर्न निस्कियौं, जसले गर्दा प्रभावित PN ले किन सामान्य इलेक्ट्रोफिजियोलोजी कायम राख्न सक्छ भनेर व्याख्या गर्दछ (चित्र २, E देखि K)। प्रोटियोमिक्स विश्लेषणले देखाएको छ कि ब्रान्चेड चेन एमिनो एसिड (BCAA) को क्याटाबोलिज्ममा संलग्न इन्जाइमहरू उल्लेखनीय रूपमा अप-रेगुलेट गरिएको थियो (चित्र ३A र चित्र S5A), र अन्तिम उत्पादन एसिटिल-CoA (CoA) वा succinyl CoA ले धमनी स्क्लेरोसिस एसिड (TCA) चक्रमा ट्राइकार्बोक्सिलेटहरूको पूरक हुन सक्छ। हामीले पत्ता लगायौं कि BCAA ट्रान्समिनेज १ (BCAT1) र BCAT2 दुवैको सामग्री बढेको छ। तिनीहरूले α-ketoglutarate (26) बाट ग्लुटामेट उत्पन्न गरेर BCAA क्याटाबोलिज्मको पहिलो चरणलाई उत्प्रेरित गर्छन्। ब्रान्चेड चेन केटो एसिड डिहाइड्रोजनेज (BCKD) कम्प्लेक्स बनाउने सबै सबयुनिटहरू अपरेगुलेटेड हुन्छन् (जटिलले परिणामस्वरूप BCAA कार्बन कंकालको पछिल्लो र अपरिवर्तनीय डिकार्बोक्सीलेसनलाई उत्प्रेरित गर्दछ) (चित्र 3A र चित्र S5A)। यद्यपि, क्रमबद्ध PN मा BCAA मा कुनै स्पष्ट परिवर्तनहरू फेला परेनन्, जुन यी आवश्यक एमिनो एसिडहरूको बढ्दो सेलुलर अपटेक वा TCA चक्र (चित्र S5B) लाई पूरक बनाउन अन्य स्रोतहरू (ग्लुकोज वा ल्याक्टिक एसिड) को प्रयोगको कारणले हुन सक्छ। OXPHOS को अभाव भएका PN हरूले 8 हप्ताको उमेरमा बढेको ग्लुटामाइन विघटन र ट्रान्समिनेशन गतिविधिहरू पनि देखाए, जुन माइटोकोन्ड्रियल इन्जाइमहरू ग्लुटामिनेज (GLS) र ग्लुटामाइन पाइरुभेट ट्रान्समिनेज 2 (GPT2) (चित्र 3, A र C) को अप-रेगुलेसन द्वारा प्रतिबिम्बित हुन सक्छ। यो ध्यान दिन लायक छ कि GLS को अप-रेगुलेसन स्प्लिस्ड आइसोफर्म ग्लुटामिनेज C (GLS-GAC) मा सीमित छ (Mfn2cKO/CTRL को परिवर्तन लगभग ४.५-गुणा, P = ०.०५), र क्यान्सर तन्तुहरूमा यसको विशिष्ट अप-रेगुलेसनले माइटोकोन्ड्रियल बायोएनर्जीलाई समर्थन गर्न सक्छ। (२७)।
(A) ताप नक्साले ८ हप्तामा तोकिएको मार्गको लागि प्रोटिन स्तरमा भएको तह परिवर्तन देखाउँछ। (B) एन्टी-PCx एन्टिबडी (स्केल बार, २० μm) लेबल गरिएको सेरेबेलर स्लाइसको उदाहरण। पहेंलो तीरले पुर्किन्जे कोशिका शरीरलाई औंल्याउँछ। (C) एथेरोस्क्लेरोसिसको लागि महत्त्वपूर्ण उम्मेदवारको रूपमा पहिचान गरिएको समय पाठ्यक्रम प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण (बहु t-परीक्षण, *FDR <5%; n = 3-5 मुसा)। (D) माथि: [1-13C]पाइरुभेट ट्रेसरमा रहेको लेबल गरिएको कार्बनमा प्रवेश गर्ने विभिन्न तरिकाहरू देखाउने योजनाबद्ध रेखाचित्र (अर्थात्, PDH वा ट्रान्स-धमनी मार्ग मार्फत)। तल: भ्वाइलिन चार्टले [1-13C]पाइरुभेट (जोडा गरिएको t-परीक्षण; ** P <0.01) सँग तीव्र सेरेबेलर स्लाइसहरू लेबल गरेपछि एस्पार्टिक एसिड, साइट्रिक एसिड र मालिक एसिडमा रूपान्तरित एकल-लेबल गरिएको कार्बन (M1) को प्रतिशत देखाउँछ। (E) संकेत गरिएको मार्गको व्यापक समय इतिहास विश्लेषण। ८ हप्तामा P<०.०५ भएका प्रोटिनहरूलाई मात्र विचार गर्नुहोस्। ड्यास गरिएको रेखा: कुनै समायोजन मान छैन (भिन्नताको दुई-तर्फी विश्लेषण; * P <०.०५; *** P <०.००१)। डेटा औसत±SEM को रूपमा व्यक्त गरिन्छ।
हाम्रो विश्लेषणमा, BCAA catabolism प्रमुख अप-नियमन मार्गहरू मध्ये एक भएको छ। यो तथ्यले दृढतापूर्वक सुझाव दिन्छ कि TCA चक्रमा प्रवेश गर्ने भेन्टिलेसन भोल्युम OXPHOS को अभाव भएको PN मा परिवर्तन हुन सक्छ। यसले न्यूरोनल मेटाबोलिक रिवायरिङको एक प्रमुख रूपलाई प्रतिनिधित्व गर्न सक्छ, जसले गम्भीर OXPHOS डिसफंक्शनको मर्मतसम्भारको समयमा न्यूरोनल फिजियोलोजी र बाँच्नमा प्रत्यक्ष प्रभाव पार्न सक्छ। यस परिकल्पनासँग मिल्दोजुल्दो, हामीले पत्ता लगायौं कि मुख्य एन्टी-एथेरोस्क्लेरोटिक इन्जाइम PCx अप-नियमित छ (Mfn2cKO/CTRL लगभग 1.5 पटक परिवर्तन हुन्छ; चित्र 3A), जसले पाइरुभेटलाई अक्सालोएसीटेटमा रूपान्तरण गर्न उत्प्रेरित गर्दछ (28), जुन मस्तिष्कको तन्तुमा रहेको मानिन्छ। अभिव्यक्ति एस्ट्रोसाइट्समा सीमित छ (29, 30)। प्रोटियोमिक्स परिणामहरूसँग मिल्दोजुल्दो, कन्फोकल माइक्रोस्कोपीले देखायो कि OXPHOS-कमी भएका PN हरूमा PCx अभिव्यक्ति विशेष रूपमा र उल्लेखनीय रूपमा बढेको थियो, जबकि PCx प्रतिक्रियाशीलता मुख्यतया नियन्त्रणको छेउछाउको बर्गम्यान ग्लियल कोशिकाहरूमा सीमित थियो (चित्र 3B)। PCx को अवलोकन गरिएको अपरेगुलेसनको कार्यात्मक परीक्षण गर्न, हामीले [1-13C]पाइरुभेट ट्रेसरको साथ तीव्र सेरेबेलर स्लाइसहरूको उपचार गर्यौं। जब पाइरुभेटलाई पाइरुभेट डिहाइड्रोजनेज (PDH) द्वारा अक्सिडाइज गरिएको थियो, यसको आइसोटोप लेबल गायब भयो, तर जब पाइरुभेटलाई भास्कुलर प्रतिक्रियाहरूद्वारा मेटाबोलाइज गरिन्छ तब TCA चक्र मध्यवर्तीहरूमा समावेश गरिन्छ (चित्र 3D)। हाम्रो प्रोटियोमिक्स डेटाको समर्थनमा, हामीले Mfn2cKO स्लाइसहरूको एस्पार्टिक एसिडमा यस ट्रेसरबाट मार्करहरूको ठूलो संख्या अवलोकन गर्यौं, जबकि साइट्रिक एसिड र मालिक एसिडमा पनि मध्यम प्रवृत्ति थियो, यद्यपि महत्त्वपूर्ण थिएन (चित्र 3D)।
डोपामाइन न्यूरोनहरूले विशेष गरी माइटोकोन्ड्रियल ट्रान्सक्रिप्शन फ्याक्टर ए जीन (Tfam) (चित्र S6B) लाई नष्ट गर्ने कारणले गर्दा माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शन भएका MitoPark मुसाहरूको डोपामाइन न्यूरोनहरूमा, PCx अभिव्यक्ति पनि उल्लेखनीय रूपमा माथि-नियमित गरिएको थियो (31), जसले संकेत गर्दछ कि एसीटोन एसिड धमनी स्क्लेरोसिस शरीरमा न्यूरोनल OXPHOS को डिसफंक्शनको समयमा रोगको घटना नियमित हुन्छ। यो ध्यान दिन लायक छ कि यो पत्ता लागेको छ कि धमनी स्क्लेरोसिससँग सम्बन्धित हुन सक्ने न्यूरोनहरूमा व्यक्त हुन सक्ने अद्वितीय इन्जाइमहरू (32-34) OXPHOS मा अभाव भएका PNs मा उल्लेखनीय रूपमा माथि-नियमित हुन्छन्, जस्तै प्रोपियोनिल-CoA कार्बोक्सिलेज (PCC-A), मालोनिल-CoA ले प्रोपियोनिल-CoA लाई succinyl-CoA र माइटोकोन्ड्रियल मालिक इन्जाइम 3 (ME3) मा रूपान्तरण गर्दछ, जसको मुख्य भूमिका मालेटबाट पाइरुभेट पुन: प्राप्ति गर्नु हो (चित्र 3, A र C) (33, 35)। यसको अतिरिक्त, हामीले Pdk3 इन्जाइममा उल्लेखनीय वृद्धि फेला पार्यौं, जसले फस्फोरिलेट गर्छ र यसरी PDH लाई निष्क्रिय पार्छ (36), जबकि PDH वा PDH इन्जाइम कम्प्लेक्सलाई सक्रिय गर्ने Pdp1 इन्जाइममा कुनै परिवर्तनहरू पत्ता लागेनन् (चित्र 3A)। निरन्तर रूपमा, Mern2cKO PNs मा, Ser293 (PDH को इन्जाइम गतिविधिलाई रोक्न जानिने) मा PDH कम्प्लेक्सको पाइरुभेट डिहाइड्रोजनेज E1 घटकको α1 सबयुनिट α (PDHE1α) सबयुनिटको फस्फोरिलेसन बढाइएको थियो (चित्र S6C) (चित्र S6C)। पाइरुभेटको कुनै भास्कुलर पहुँच छैन।
अन्तमा, हामीले पत्ता लगायौं कि सक्रियता प्रक्रियाको क्रममा, रिपोर्टहरू अनुसार, सेरिन र ग्लाइसिन बायोसिन्थेसिसको सुपर मार्ग, सम्बन्धित माइटोकोन्ड्रियल फोलेट (1C) चक्र र प्रोलाइन बायोसिन्थेसिस (चित्र 1G र चित्र S5C) सबै उल्लेखनीय रूपमा माथि-नियमित छन्। वरपरका तन्तुहरू माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शन (5-7) सँग सक्रिय हुन्छन्। यी प्रोटियोमिक्स डेटालाई समर्थन गर्ने कन्फोकल विश्लेषणले देखायो कि OXPHOS हराइरहेको PN मा, 8-हप्ता पुरानो मुसाको सेरेबेलर स्लाइसहरू सेरिन हाइड्रोक्साइमिथाइलट्रान्सफेरेज 2 (SHMT2) को अधीनमा थिए, जुन माइटोकोन्ड्रियल फोलेट चक्रको एक प्रमुख इन्जाइम हो। महत्त्वपूर्ण प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (चित्र S5D)। 13 CU-ग्लुकोज-इन्क्युबेटेड तीव्र सेरेबेलर स्लाइसहरूमा, मेटाबोलिक ट्रेसिङ प्रयोगहरूले सेरिन र प्रोलाइन बायोसिन्थेसिसको माथि-नियमनलाई थप पुष्टि गर्‍यो, जसले कार्बन आइसोफर्मको सेरिन र प्रोलाइनमा प्रवाह बढेको संकेत गर्दछ (चित्र S5E)। GLS र GPT2 द्वारा प्रवर्द्धित प्रतिक्रियाहरू ग्लुटामाइनबाट ग्लुटामेटको संश्लेषण र ग्लुटामेट र α-केटोग्लुटेरेट बीचको ट्रान्सामिनेशनको लागि जिम्मेवार भएको हुनाले, तिनीहरूको अपरेगुलेसनले OXPHOS-कमजोरी भएका न्यूरोनहरूमा ग्लुटामेटको माग बढेको संकेत गर्दछ, यो प्रोलाइनको बढ्दो जैव संश्लेषण कायम राख्ने उद्देश्यले हुन सक्छ (चित्र S5C)। यी परिवर्तनहरूको विपरीत, PN-विशिष्ट Mfn2cKO मुसाहरूबाट सेरेबेलर एस्ट्रोसाइट्सको प्रोटियोमिक विश्लेषणले देखाएको छ कि यी मार्गहरू (सबै एन्टिपेरोक्सिडेसहरू सहित) अभिव्यक्तिमा उल्लेखनीय रूपमा परिवर्तन भएनन्, यसरी यो मेटाबोलिक पुनर्निर्देशन डिग्रेडेड PN (चित्र S6, D देखि G) को लागि चयनात्मक छ भनेर प्रदर्शन गर्दछ।
संक्षेपमा, यी विश्लेषणहरूले PNs मा विशिष्ट मेटाबोलिक मार्गहरूको अस्थायी सक्रियताको उल्लेखनीय रूपमा फरक ढाँचाहरू प्रकट गरे। यद्यपि असामान्य न्यूरोनल माइटोकोन्ड्रियल प्रकार्यले प्रारम्भिक एथेरोस्क्लेरोसिस र 1C पुनर्निर्माण (चित्र 3E र चित्र S5C) निम्त्याउन सक्छ, र I र IV कम्प्लेक्सहरूको अभिव्यक्तिमा पनि अनुमानित परिवर्तनहरू हुन सक्छन्, सेरिन डे नोभो संश्लेषणमा परिवर्तनहरू केवल ढिलो चरणहरूमा मात्र स्पष्ट भए। OXPHOS डिसफंक्शन (चित्र 3E र चित्र S5C)। यी निष्कर्षहरूले एक अनुक्रमिक प्रक्रियालाई परिभाषित गर्दछ जसमा तनाव-प्रेरित माइटोकोन्ड्रियल (1C चक्र) र साइटोप्लाज्मिक (सेरिन बायोसिन्थेसिस) ले न्यूरोनल मेटाबोलिज्मलाई पुन: आकार दिन TCA चक्रमा एथेरोस्क्लेरोसिसमा वृद्धिसँग समन्वयात्मक रूपमा प्रतिक्रिया दिन्छ।
८ हप्ता पुरानो OXPHOS-कमी भएका PN हरूले उच्च-फ्रिक्वेन्सी उत्तेजना गतिविधि कायम राख्न सक्छन् र माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शनको क्षतिपूर्ति गर्न महत्त्वपूर्ण मेटाबोलिक पुन: जडानबाट गुज्रन सक्छन्। यो खोजले एउटा रोचक सम्भावना जगाउँछ कि यस क्षणमा पनि, यी कोषहरूले न्यूरोडिजेनेरेसनलाई ढिलाइ गर्न वा रोक्नको लागि चिकित्सीय हस्तक्षेप प्राप्त गर्न सक्छन्। ढिलो। हामीले दुई स्वतन्त्र हस्तक्षेपहरू मार्फत यो सम्भावना समाधान गर्यौं। पहिलो विधिमा, हामीले Cre-निर्भर एडेनो-सम्बद्ध भाइरस (AAV) भेक्टर डिजाइन गर्यौं ताकि MFN2 लाई OXPHOS-कमी भएका PN हरूमा चयनात्मक रूपमा व्यक्त गर्न सकियोस् (चित्र S7A)। AAV एन्कोडिङ MFN2 र फ्लोरोसेन्ट रिपोर्टर जीन mCherry (Mfn2-AAV) लाई प्राथमिक न्यूरोन संस्कृतिहरूमा इन भिट्रोमा प्रमाणित गरिएको थियो, जसले गर्दा MFN2 लाई Cre-निर्भर तरिकाले व्यक्त गरियो र माइटोकोन्ड्रियल आकारविज्ञानलाई बचाइयो, जसले गर्दा Mfn2cKO न्यूरोन्समा न्यूरोम्युटेशन रोकियो (चित्र S7, B, D र E)। त्यसपछि, हामीले ८ हप्ता पुरानो Mfn2-AAV लाई Mfn2cKO र नियन्त्रण मुसाको सेरेबेलर कोर्टेक्समा स्टेरियोट्याक्टिक रूपमा डेलिभर गर्न इन भिभो प्रयोगहरू गर्यौं, र १२ हप्ता पुरानो मुसाहरूको विश्लेषण गर्यौं (चित्र ४A)। उपचार गरिएका Mfn2cKO मुसाहरू मरे (चित्र १, A र B) (१६)। भिभोमा भाइरल ट्रान्सडक्सनले केही सेरेबेलर सर्कलहरूमा PN को चयनात्मक अभिव्यक्तिको परिणामस्वरूप भयो (चित्र S7, G र H)। केवल mCherry (Ctrl-AAV) व्यक्त गर्ने नियन्त्रण AAV को इंजेक्शनले Mfn2cKO जनावरहरूमा न्यूरोडिजेनेरेसनको डिग्रीमा कुनै महत्त्वपूर्ण प्रभाव पारेन। यसको विपरीत, Mfn2-AAV सँग ट्रान्सड्यूस गरिएको Mfn2cKOs को विश्लेषणले PN कोशिका तहको महत्त्वपूर्ण सुरक्षात्मक प्रभाव देखायो (चित्र ४, B र C)। विशेष गरी, न्यूरोन घनत्व नियन्त्रण जनावरहरू (चित्र ४, B र C, र चित्र S7, H र I) बाट लगभग अविभाज्य देखिन्छ। MFN1 को अभिव्यक्ति तर MFN2 को अभिव्यक्ति न्यूरोनल मृत्यु बचाउन उत्तिकै प्रभावकारी छ (चित्र 4C र चित्र S7, C र F), जसले एक्टोपिक MFN1 को अभिव्यक्तिले MFN2 को अभावलाई प्रभावकारी रूपमा पूरक बनाउन सक्छ भन्ने संकेत गर्छ। एकल PN स्तरमा थप विश्लेषणले देखाएको छ कि Mfn2-AAV ले माइटोकोन्ड्रियाको अल्ट्रास्ट्रक्चरलाई ठूलो मात्रामा बचाएको छ, mtDNA स्तरलाई सामान्य बनाएको छ, र एन्टी-एन्जियोजेनेसिस मार्कर PCx को उच्च अभिव्यक्तिलाई उल्टाएको छ (चित्र 4, C देखि E सम्म)। आराम गर्ने अवस्थामा उद्धार गरिएका Mfn2cKO मुसाहरूको दृश्य निरीक्षणले देखायो कि तिनीहरूको मुद्रा र मोटर लक्षणहरू (S1 देखि S3 सम्मको चाल) सुधारिएको थियो। निष्कर्षमा, यी प्रयोगहरूले देखाउँछन् कि OXPHOS मा गम्भीर रूपमा कमी भएको PN मा MFN2 को ढिलाइ भएको पुन: परिचय mtDNA खपतलाई उल्टाउन र एथेरोस्क्लेरोसिसलाई प्रेरित गर्न पर्याप्त छ, जसले गर्दा एक्सन डिजेनेरेशन र भिभोमा न्यूरोनल मृत्युलाई रोक्न सकिन्छ।
(A) संकेत गरिएको मेटाबोलिक मार्ग सक्रिय हुँदा AAV एन्कोडिङ MFN2 इन्जेक्सनको लागि प्रयोगात्मक तालिका देखाउने योजना। (B) Mfn2cKO मुसाहरूमा ८ हप्तामा ट्रान्सड्युस गरिएका १२-हप्ता पुरानो सेरेबेलर स्लाइसहरूको प्रतिनिधि कन्फोकल छविहरू र एन्टी-क्यालबिन्डिन एन्टिबडीले लेबल गरिएको। दायाँ: एक्सन फाइबरहरूको स्केलिंग। एक्सन जुमको स्केल ४५० र ७५ μm हो। (C) बायाँ: AAV ट्रान्सडक्सन लूप (AAV+) मा पुर्किन्जे सेल घनत्वको परिमाणीकरण (भिन्नताको एकतर्फी विश्लेषण; n = ३ मुसा)। दायाँ: हप्ता १२ मा ट्रान्सड्युस गरिएको PN मा mtDNA फोकस विश्लेषण (अनपेयर गरिएको t-परीक्षण; n = तीन मुसाहरूबाट ६ कोषहरू)। * P <0.05; ** P <0.01। (D) संकेत गरिएको भाइरल भेक्टरहरूसँग ट्रान्सड्युस गरिएका Mfn2cKO सेरेबेलर खण्डहरूको PN को प्रतिनिधि प्रसारण इलेक्ट्रोन माइक्रोग्राफहरू। गुलाबी मास्कले डेन्ड्राइट्सले ओगटेको क्षेत्रलाई चित्रण गर्दछ, र पहेंलो डटेड वर्गले दायाँपट्टि प्रदान गरिएको जुमलाई चित्रण गर्दछ; n ले न्यूक्लियसलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ। स्केल बार, १μm। (E) ले १२ हप्तामा ट्रान्सड्यूस गरिएको PN मा PCx स्टेनिङको उदाहरण देखाउँछ। स्केल बार, २०μm। OE, ओभरएक्सप्रेसन; FC, फोल्ड परिवर्तन।
अन्तमा, हामीले OXPHOS डिसफंक्शन अनुभव गरेका PN हरूमा पेरोक्सिडेज-प्रेरित कोशिका बाँच्ने महत्त्वको अनुसन्धान गर्यौं। हामीले विशेष गरी माउस PCx mRNA (AAV-shPCx) लाई लक्षित गर्दै mCherry एन्कोडिङ AAV-shRNA (छोटो हेयरपिन RNA) उत्पन्न गर्यौं, र Mfn2cKO मुसाको सेरिबेलममा भाइरस वा यसको स्क्र्याम्बल्ड नियन्त्रण (AAV-scr) इन्जेक्सन गर्यौं। PCx अभिव्यक्ति बढेको अवधिमा प्रभावकारी PCx नकडाउन प्राप्त गर्न (चित्र 3C) उमेरको चौथो हप्तामा (चित्र 5A) इंजेक्शन गरिएको थियो (चित्र 3C) र PN कोशिका तह अझै अक्षुण्ण थियो (चित्र 1A)। यो ध्यान दिन लायक छ कि PCx (चित्र S8A) लाई ढकढक्याउँदा PN मृत्युको महत्त्वपूर्ण प्रवेग हुन्छ, जुन संक्रमित रिंगमा सीमित छ (चित्र 5, B र C)। PCx अप-रेगुलेसनद्वारा प्रेरित मेटाबोलिक प्रभावहरूको संयन्त्र बुझ्नको लागि, हामीले PCx नकडाउन र AAV-मध्यस्थता अप्टिकल बायोसेन्सर Grx1-roGFP2 एकैसाथ व्यक्त भएपछि PNs को रेडक्स स्थिति अध्ययन गर्यौं (चित्र S8, B देखि D) ग्लुटाथियोनको मूल्याङ्कन गर्न पेप्टाइड रेडक्स सम्भाव्यता (38) को सापेक्षिक परिवर्तन। त्यसपछि, हामीले FLIM अवस्थाहरू (चित्र S8, E देखि G) प्रमाणित गरेपछि साइटोप्लाज्मिक रेडक्स स्थितिमा सम्भावित परिवर्तनहरू पत्ता लगाउन 7-हप्ता पुरानो Mfn2cKO वा नियन्त्रण लिटरमेटहरूको तीव्र मस्तिष्क स्लाइसहरूमा दुई-फोटोन फ्लोरोसेन्स लाइफटाइम इमेजिङ माइक्रोस्कोपी (FLIM) प्रदर्शन गर्यौं। विश्लेषणले PCx अभिव्यक्तिको अभाव भएको एकल Mfn2cKO PNs को अक्सिडेशन अवस्थामा उल्लेखनीय वृद्धि देखाएको छ, जुन नियन्त्रण न्यूरोन्स वा Mfn2cKO PNs बाट फरक छ जसले केवल स्क्र्याम्बल गरिएको shRNA (चित्र 5, D र E) व्यक्त गर्दछ। जब PCx अभिव्यक्ति डाउन-रेगुलेट गरिएको थियो, अत्यधिक अक्सिडाइज्ड अवस्था देखाउने Mfn2cKO PNs को प्रतिशत तीन गुणा भन्दा बढीले बढ्यो (चित्र 5E), जसले PCx अप-रेगुलेसनले डिजेनेरेटेड न्यूरोन्सको रेडक्स क्षमता कायम राखेको संकेत गर्दछ।
(A) संकेत गरिएको मेटाबोलिक मार्ग सक्रिय हुँदा AAV एन्कोडिङ shPCx इन्जेक्सनको लागि प्रयोगात्मक तालिका देखाउने योजना। (B) Mfn2cKO मुसाहरूमा ८-हप्ता पुरानो सेरेबेलर खण्डहरूको प्रतिनिधि कन्फोकल तस्बिरहरू ४ हप्तामा एन्टी-क्याल्सीन्युरिन एन्टिबडीले ट्रान्सड्यूस र लेबल गरिएको। स्केल बार, ४५०μm। (C) AAV-ट्रान्सड्यूस गरिएको लूपहरूमा पुरकिन्जे सेल घनत्वको परिमाणीकरण (भिन्नताको एकतर्फी विश्लेषण; n = ३ देखि ४ मुसा)। डेटा औसत ±SEM को रूपमा व्यक्त गरिन्छ; ***P<०.००१। (D) प्रतिनिधि FLIM तस्वीरले निर्दिष्ट प्रयोगात्मक अवस्थाहरूमा ७-हप्ता पुरानो PN व्यक्त गर्ने ग्लुटाथियोन रेडक्स सेन्सर Grx1-roGFP2 को औसत आयु देखाउँछ। LUT (लुक-अप तालिका) अनुपात: बाँच्ने समय अन्तराल (पिकोसेकेन्डमा)। स्केल बार, २५μm। (E) हिस्टोग्रामले (D) बाट Grx1-roGFP2 जीवनकाल मानहरूको वितरण देखाउँछ (n=१५८ देखि ३६८ कोषहरू प्रत्येक अवस्था अन्तर्गत दुई मुसाहरूमा)। प्रत्येक हिस्टोग्राम माथिको पाई चार्ट: उल्लेखनीय रूपमा लामो (रातो, अक्सिडाइज्ड) वा छोटो (नीलो, घटाइएको) जीवनकाल मानहरू भएका कोषहरूको संख्या देखाउँछ, जुन CTRL-AAV-scr मा औसत जीवनकाल मानको १ SD भन्दा बढी छ। (F) प्रस्तावित मोडेलले न्यूरोनल PCx को अपरेगुलेसनको सुरक्षात्मक प्रभाव देखाउँछ।
समग्रमा, हामीले यहाँ प्रदान गरेको तथ्याङ्कले देखाउँछ कि MFN2 को पुन: अभिव्यक्तिले गम्भीर OXPHOS कमी, गम्भीर mtDNA कमी, र अत्यन्तै असामान्य ista-जस्तो आकारविज्ञान भएको उन्नत PN लाई पूर्ण रूपमा बचाउन सक्छ, जसले गर्दा उन्नत रोगहरूमा पनि निरन्तर प्रगति प्रदान गर्दछ। न्यूरोडिजेनेरेसनले कोशिका मृत्यु हुनुभन्दा पहिलेको चरणको उल्टाउन सकिने प्रमाण प्रदान गर्दछ। मेटाबोलिक लचिलोपनको यो डिग्रीलाई एथेरोस्क्लेरोसिस (TCA चक्रको पुनर्वायरिंग) प्रेरित गर्ने न्यूरोन्सको क्षमताले थप जोड दिन्छ, जसले OXPHOS नभएका PN हरूमा PCx अभिव्यक्तिलाई रोक्छ र कोशिका मृत्युलाई बढाउँछ, जसले गर्दा सुरक्षात्मक भूमिका खेल्छ (चित्र 5F)।
यस अध्ययनमा, हामीले प्रमाण प्रदान गर्यौं कि OXPHOS डिसफंक्शनमा PNs को प्रतिक्रिया मेटाबोलिक कार्यक्रमहरू द्वारा सक्रिय विभेदक सक्रियता मार्ग मार्फत बिस्तारै TCA चक्र एथेरोस्क्लेरोसिसमा रूपान्तरण हुन्छ। हामीले धेरै पूरक विधिहरू सहित प्रोटियोमिक विश्लेषण पुष्टि गर्यौं र खुलासा गर्यौं कि गम्भीर माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शन द्वारा चुनौती दिँदा, न्यूरोन्समा मेटाबोलिक लोचको पहिले अज्ञात रूप हुन्छ। हाम्रो आश्चर्यको लागि, सम्पूर्ण रिवायरिंग प्रक्रियाले न्यूरोडिजेनेरेसनको साथमा हुने टर्मिनल मेटाबोलिक अवस्थालाई क्रमशः र अपरिवर्तनीय रूपमा चिन्ह लगाउँदैन, तर हाम्रो डेटाले सुझाव दिन्छ कि यसले कोशिका मृत्यु हुनुभन्दा अघिको चरणमा पनि मर्मतसम्भार न्यूरोन गठन गर्न सक्छ। कार्यात्मक क्षतिपूर्ति संयन्त्र। यो खोजले संकेत गर्दछ कि न्यूरोन्सको शरीरमा मेटाबोलिक प्लास्टिसिटीको पर्याप्त मात्रा हुन्छ। यो तथ्यले प्रमाणित गर्दछ कि MFN2 को पछिको पुन: परिचयले प्रमुख मेटाबोलिक मार्करहरूको अभिव्यक्तिलाई उल्टाउन सक्छ र PN डिजेनेरेशनलाई रोक्न सक्छ। यसको विपरीत, यसले एथेरोस्क्लेरोसिसलाई रोक्छ र स्नायुहरूलाई गति दिन्छ। ट्रान्ससेक्सुअल।
हाम्रो अनुसन्धानमा सबैभन्दा आकर्षक निष्कर्षहरू मध्ये एक यो हो कि OXPHOS को अभाव भएका PN हरूले विशेष रूपमा धमनी स्क्लेरोसिसलाई उत्तेजित गर्ने इन्जाइमहरूलाई अप-रेगुलेट गरेर TCA चक्र मेटाबोलिज्मलाई परिमार्जन गर्न सक्छन्। मेटाबोलिक पुनर्संरचना क्यान्सर कोषहरूको एक सामान्य विशेषता हो, जसमध्ये केही ग्लुटामाइनमा निर्भर हुन्छन् TCA चक्र मध्यवर्तीहरूलाई पूरक बनाउन कम गर्ने समकक्षहरू उत्पादन गर्न, जसले श्वासप्रश्वास श्रृंखला चलाउँछ र लिपिड र न्यूक्लियोटाइड बायोसिन्थेसिस पूर्ववर्तीहरूको उत्पादन कायम राख्छ (39, 40)। हालैको एक अध्ययनले देखाएको छ कि OXPHOS डिसफंक्शन अनुभव गर्ने परिधीय तन्तुहरूमा, ग्लुटामाइन/ग्लुटामेट मेटाबोलिज्मको पुन: जडान पनि एक प्रमुख विशेषता हो (5, 41), जहाँ TCA चक्रमा ग्लुटामाइन प्रवेशको दिशा OXPHOS चोटको गम्भीरताको कारणले निर्भर गर्दछ (41)। यद्यपि, शरीरमा न्यूरोनल मेटाबोलिक प्लास्टिसिटीको कुनै समानता र रोगको सन्दर्भमा यसको सम्भावित प्रासंगिकताको बारेमा स्पष्ट प्रमाणको अभाव छ। हालैको इन भिट्रो अध्ययनमा, प्राथमिक कोर्टिकल न्यूरोनहरूले न्यूरोट्रान्समिशनको लागि ग्लुटामेट पूलहरू परिचालन गरेको देखाइएको थियो, जसले गर्दा मेटाबोलिक तनाव अवस्थाहरूमा अक्सिडेटिभ मेटाबोलिज्म र एथेरोस्क्लेरोसिसलाई बढावा दिन्छ (42)। यो कुरा ध्यान दिन लायक छ कि TCA चक्र इन्जाइम succinate dehydrogenase को औषधीय अवरोध अन्तर्गत, पाइरुभेट कार्बोक्सिलेसनले कल्चर्ड सेरेबेलर ग्रेन्युल न्यूरोन्समा अक्सालोएसीटेटको संश्लेषण कायम राख्ने विश्वास गरिन्छ (34)। यद्यपि, मस्तिष्कको तन्तु (जहाँ एथेरोस्क्लेरोसिस मुख्यतया एस्ट्रोसाइट्समा सीमित मानिन्छ) मा यी संयन्त्रहरूको शारीरिक सान्दर्भिकताको अझै पनि महत्त्वपूर्ण शारीरिक महत्त्व छ (43)। यस अवस्थामा, हाम्रो डेटाले देखाउँछ कि शरीरमा OXPHOS द्वारा क्षतिग्रस्त PN हरूलाई BCAA डिग्रेडेसन र पाइरुभेट कार्बोक्सिलेसनमा स्विच गर्न सकिन्छ, जुन TCA पूल मध्यवर्तीहरूको पूरकको दुई मुख्य स्रोत हुन्। यद्यपि न्यूरोनल ऊर्जा चयापचयमा BCAA क्याटाबोलिज्मको अनुमानित योगदान प्रस्ताव गरिएको छ, न्यूरोट्रान्समिशनको लागि ग्लुटामेट र GABA को भूमिकाको अतिरिक्त (44), भिभोमा यी संयन्त्रहरूको लागि अझै पनि कुनै प्रमाण छैन। त्यसकारण, यो अनुमान गर्न सजिलो छ कि निष्क्रिय PN हरूले एथेरोस्क्लेरोसिस बढाएर आत्मसात प्रक्रियाद्वारा संचालित TCA मध्यवर्तीहरूको खपतको लागि स्वचालित रूपमा क्षतिपूर्ति गर्न सक्छन्। विशेष गरी, एस्पार्टिक एसिडको बढ्दो माग कायम राख्न PCx को अपरेगुलेसन आवश्यक हुन सक्छ, जुन माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शन (45) भएका प्रजननशील कोशिकाहरूमा सुझाव दिइन्छ। यद्यपि, हाम्रो मेटाबोलोमिक्स विश्लेषणले Mfn2cKO PNs (चित्र S6A) मा एस्पार्टिक एसिडको स्थिर-अवस्था स्तरमा कुनै महत्त्वपूर्ण परिवर्तनहरू प्रकट गरेन, जसले सम्भवतः प्रजननशील कोशिकाहरू र पोस्ट-माइटोटिक न्यूरोनहरू बीच एस्पार्टिक एसिडको फरक मेटाबोलिक उपयोगलाई प्रतिबिम्बित गर्दछ। यद्यपि भिभोमा निष्क्रिय न्यूरोनहरूमा PCx अपरेगुलेसनको सही संयन्त्रको विशेषता हुन बाँकी छ, हामीले प्रदर्शन गर्यौं कि यो समयपूर्व प्रतिक्रियाले न्यूरोनहरूको रेडक्स अवस्था कायम राख्न महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छ, जुन सेरेबेलर स्लाइसहरूमा FLIM प्रयोगहरूमा प्रदर्शन गरिएको थियो। विशेष गरी, PN हरूलाई PCx लाई अप-रेगुलेटिंग गर्नबाट रोक्नाले थप अक्सिडाइज्ड अवस्था निम्त्याउन सक्छ र कोशिका मृत्युलाई गति दिन सक्छ। BCAA डिग्रेडेसनको सक्रियता र पाइरुभेटको कार्बोक्सिलेसन माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शन (7) को परिधीय तन्तुहरूलाई विशेषता दिने तरिकाहरू होइनन्। त्यसकारण, तिनीहरू OXPHOS-कमी भएका न्यूरोन्सको प्राथमिकता विशेषता जस्तो देखिन्छन्, यद्यपि यो एक मात्र विशेषता होइन, जुन न्यूरोडिजेनेरेसनको लागि महत्त्वपूर्ण छ। ।
सेरेबेलर रोग एक विषम प्रकारको न्यूरोडिजेनेरेटिभ रोग हो जुन सामान्यतया एटेक्सियाको रूपमा प्रकट हुन्छ र प्रायः PN लाई क्षति पुर्‍याउँछ (46)। यो न्यूरोन जनसंख्या विशेष गरी माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शनको लागि कमजोर हुन्छ किनभने मुसाहरूमा तिनीहरूको चयनात्मक डिजेनेरेशनले मानव स्पाइनोसेरेबेलर एटेक्सिया (16, 47, 48) लाई चित्रण गर्ने धेरै मोटर लक्षणहरू पुनरुत्पादन गर्न पर्याप्त हुन्छ। रिपोर्टहरू अनुसार, उत्परिवर्ती जीन भएको ट्रान्सजेनिक माउस मोडेल मानव स्पाइनोसेरेबेलर एटेक्सियासँग सम्बन्धित छ र माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शन (49, 50) छ, जसले PNPH मा OXPHOS कमीको परिणामहरूको अध्ययनको महत्त्वलाई जोड दिन्छ। त्यसकारण, यो अद्वितीय न्यूरोन जनसंख्यालाई प्रभावकारी रूपमा अलग गर्न र अध्ययन गर्न विशेष गरी उपयुक्त छ। यद्यपि, PN हरू दबाबप्रति धेरै संवेदनशील हुन्छन् र सम्पूर्ण सेरेबेलर कोशिका जनसंख्याको कम अनुपातको लागि जिम्मेवार हुन्छन्, धेरै ओमिक्स-आधारित अध्ययनहरूको लागि, तिनीहरूलाई सम्पूर्ण कोशिकाको रूपमा चयनात्मक पृथकीकरण अझै पनि एक चुनौतीपूर्ण पक्ष हो। यद्यपि अन्य कोशिका प्रकारहरू (विशेष गरी वयस्क तन्तुहरू) को प्रदूषणको पूर्ण अभाव प्राप्त गर्न लगभग असम्भव छ, हामीले डाउनस्ट्रीम प्रोटियोमिक्स विश्लेषणको लागि पर्याप्त संख्यामा व्यवहार्य न्यूरोनहरू प्राप्त गर्न FACS सँग प्रभावकारी पृथक्करण चरण संयोजन गर्यौं, र सम्पूर्ण सेरिबेलमको अवस्थित डेटा सेटको तुलनामा धेरै उच्च प्रोटीन कभरेज (लगभग 3000 प्रोटीन) छ (51)। सम्पूर्ण कोशिकाहरूको व्यवहार्यता संरक्षण गरेर, हामीले यहाँ प्रदान गर्ने विधिले हामीलाई माइटोकोन्ड्रियलमा मेटाबोलिक मार्गहरूमा परिवर्तनहरू जाँच गर्न मात्र होइन, तर यसको साइटोप्लाज्मिक समकक्षहरूमा परिवर्तनहरू पनि जाँच गर्न अनुमति दिन्छ, जसले कोशिका प्रकारलाई समृद्ध बनाउन माइटोकोन्ड्रियल झिल्ली ट्यागहरूको प्रयोगलाई पूरक बनाउँछ। जटिल तन्तुहरूमा माइटोकोन्ड्रियलको संख्याको लागि नयाँ विधि (52, 53)। हामीले वर्णन गरेको विधि पुर्किन्जे कोशिकाहरूको अध्ययनसँग मात्र सम्बन्धित छैन, तर माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शनका अन्य मोडेलहरू सहित रोगग्रस्त मस्तिष्कमा मेटाबोलिक परिवर्तनहरूलाई सम्बोधन गर्न कुनै पनि प्रकारको कोशिकामा सजिलै लागू गर्न सकिन्छ।
अन्तमा, हामीले यस मेटाबोलिक पुनर्संरचना प्रक्रियाको क्रममा एक चिकित्सीय विन्डो पहिचान गरेका छौं जसले सेलुलर तनावका मुख्य संकेतहरूलाई पूर्ण रूपमा उल्टाउन सक्छ र न्यूरोनल डिजेनेरेशनलाई रोक्न सक्छ। त्यसकारण, यहाँ वर्णन गरिएको रिवायरिङको कार्यात्मक प्रभावहरू बुझ्नाले माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शनको समयमा न्यूरोनल व्यवहार्यता कायम राख्न सम्भावित उपचारहरूमा आधारभूत अन्तर्दृष्टि प्रदान गर्न सक्छ। अन्य मस्तिष्क कोशिका प्रकारहरूमा ऊर्जा चयापचयमा हुने परिवर्तनहरूको विच्छेदन गर्ने उद्देश्यले भविष्यको अनुसन्धान अन्य स्नायु रोगहरूमा यो सिद्धान्तको प्रयोज्यता पूर्ण रूपमा प्रकट गर्न आवश्यक छ।
MitoPark मुसाहरू पहिले वर्णन गरिएको छ (31)। LoxP फ्ल्याङ्किङ Mfn2 जीन भएका C57BL/6N मुसाहरू पहिले वर्णन गरिएको छ (18) र L7-Cre मुसाहरूसँग क्रस गरिएको छ (23)। परिणामस्वरूप दोहोरो हेटेरोजाइगस सन्तानलाई त्यसपछि होमोजाइगस Mfn2loxP/Mfn2loxP मुसाहरूसँग क्रस गरिएको थियो जसले Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) को लागि Purkinje-विशिष्ट जीन नकआउटहरू उत्पन्न गर्दछ। मिलनको एक उपसमूहमा, Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP एलील (stop-mtYFP) अतिरिक्त क्रसिङहरू (20) मार्फत प्रस्तुत गरिएको थियो। सबै पशु प्रक्रियाहरू युरोपेली, राष्ट्रिय र संस्थागत दिशानिर्देशहरू अनुसार प्रदर्शन गरिएको थियो र जर्मनीको उत्तरी राइन-वेस्टफालियाको उमवेल्ट र भेर्ब्राउचरस्चुट्जको ल्यान्डेसामटफरनाटुर द्वारा अनुमोदित गरिएको थियो। पशु कार्यले युरोपेली प्रयोगशाला पशु विज्ञान संघहरूको महासंघको मार्गदर्शन पनि पछ्याउँछ।
गर्भवती महिलाको पाठेघरको मुखको विस्थापनलाई बेहोस बनाएपछि, मुसाको भ्रूणलाई अलग गरिन्छ (E13)। कोर्टेक्सलाई ह्यान्क्सको ब्यालेन्स्ड साल्ट सोल्युसन (HBSS) मा विच्छेदन गरिएको थियो जसमा १० mM हेप्स थपिएको थियो र डल्बेकोको मोडिफाइड ईगलको माध्यममा पपाइन (२० U/ml) र सिस्टिन (१μg/ml) युक्त पारिएको थियो। तन्तुलाई DMEM मा इन्क्युबेट गर्नुहोस् र इन्जाइम्याटिक पाचनद्वारा यसलाई अलग गर्नुहोस्। Ml) ३७°C मा २० मिनेटको लागि, र त्यसपछि १०% भ्रूण गोवाइन सीरमको साथ पूरक DMEM मा मेकानिकली मिलाइएको थियो। कोषहरूलाई प्रति ६ सेमी कल्चर डिशमा २×१०६ को घनत्वमा वा ०.५×१०५ कोषहरू/cm2 को घनत्वमा पोलिलाइसिनले लेपित गिलास कभरस्लिपहरूमा इमेजिङ विश्लेषणको लागि बीउ गरिएको थियो। ४ घण्टा पछि, माध्यमलाई १% B27 पूरक र ०.५ mM ग्लुटाम्याक्स भएको न्यूरोबासल सीरम-मुक्त माध्यमले प्रतिस्थापन गरिएको थियो। त्यसपछि प्रयोगभरि न्यूरोनहरूलाई ३७°C र ५% CO2 मा राखिएको थियो, र हप्तामा एक पटक खुवाइयो। इन भिट्रोमा पुनर्संयोजनलाई प्रेरित गर्न, दोस्रो दिन इन भिट्रोमा न्यूरोनहरूको उपचार गर्न निम्न AAV9 भाइरस भेक्टरको ३μl (२४-वेल कल्चर डिश) वा ०.५μl (२४-वेल प्लेट) प्रयोग गरिएको थियो: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, क्याटलग नम्बर १०५५३०-AAV9) र AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, क्याटलग नम्बर १०५५४५-AAV9)।
माउस Mfn1 र Mfn2 पूरक DNA (क्रमशः Addgene plasmid #23212 र #23213 बाट प्राप्त) लाई C-टर्मिनसमा V5 अनुक्रम (GKPIPNPLLGLDST) ले चिन्ह लगाइएको छ, र T2A अनुक्रम मार्फत फ्रेममा mCherry सँग फ्यूज गरिएको छ। Grx1-roGFP2 Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) बाट उपहार हो। परम्परागत क्लोनिङ विधिहरू प्रयोग गरेर tdTomato क्यासेटलाई प्रतिस्थापन गरेर, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 र pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 भेक्टरहरू उत्पन्न गर्न क्यासेटलाई pAAV-CAG-FLEX-mCherry ब्याकबोन (Addgene सन्दर्भ नम्बर 28306) मा सबक्लोन गरिएको थियो। नियन्त्रण भेक्टर pAAV-CAG-FLEX-mCherry उत्पन्न गर्न समान रणनीति प्रयोग गरिएको थियो। AAV-shPCx निर्माण उत्पन्न गर्न, प्लाज्मिड AAV भेक्टर (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) आवश्यक छ, जसमा shRNA लक्षित माउस PCx (5′CTTTCGCTTAAGGTGCTAAACTCAGGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) लाई एन्कोड गर्ने DNA अनुक्रम समावेश छ। U6 प्रमोटरको नियन्त्रणमा, mCherry CMV प्रमोटरको नियन्त्रणमा प्रयोग गरिन्छ। सहायक AAV भेक्टरहरूको उत्पादन निर्माताको निर्देशन (सेल बायोल्याब्स) अनुसार गरिएको थियो। छोटकरीमा भन्नुपर्दा, क्याल्सियम फस्फेट विधि प्रयोग गरेर २९३AAV कोषहरू-T2A-MFN1-V5), mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) वा Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) कोडिङ जीनको क्षणिक ट्रान्सफेक्शन, साथै AAV1 क्याप्सिड प्रोटीन र सहायक प्रोटीन प्याकेजिङ प्लाज्मिड प्लाज्मिड कोडिङ गर्ने ट्रान्सफर प्लाज्मिड बोक्ने ट्रान्सफर प्लाज्मिड प्रयोग गर्नुहोस्। कच्चा भाइरस सुपरनेटेन्ट सुख्खा बरफ/इथेनॉल बाथमा फ्रिज-थ चक्र र फस्फेट बफर गरिएको सलाइन (PBS) मा लिज गरिएको कोषहरूद्वारा प्राप्त गरिएको थियो। AAV भेक्टरलाई विच्छेदनशील आयोडिक्सानोल ग्रेडियन्ट अल्ट्रासेन्ट्रिफ्युगेशन (३२,००० rpm र ४°C मा २४ घण्टा) द्वारा शुद्ध गरिएको थियो र Amicon अल्ट्रा-१५ केन्द्रापसारक फिल्टर प्रयोग गरेर केन्द्रित गरिएको थियो। AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [२.९×१०१३ जीनोम प्रतिलिपि (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (६.१×१०१२ GC/ml), AAV1-CAG- FLEX को जीनोम टिटर पहिले वर्णन गरिए अनुसार (५४), वास्तविक-समय मात्रात्मक PCR (qPCR) -MFN1-V5 (१.९×१०१३ GC/ml) र AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (८.९×१०१२ GC/ml) द्वारा मापन गरिएको थियो।
प्राथमिक न्यूरोनहरूलाई आइस-कोल्ड १x PBS मा स्क्र्याप गरियो, पेलेट गरियो, र त्यसपछि ०.५% Triton X-१०० / ०.५% सोडियम डिओक्सिकोलेट/PBS लाइसिस बफरमा एकरूप बनाइयो जसमा फस्फेटेज र प्रोटीज इनहिबिटर (रोचे) थियो। प्रोटिन परिमाणीकरण bicinchoninic एसिड परख (थर्मो फिशर साइन्टिफिक) प्रयोग गरेर गरिएको थियो। त्यसपछि प्रोटिनहरूलाई SDS-polyacrylamide जेल इलेक्ट्रोफोरेसिसद्वारा अलग गरियो, र त्यसपछि पोलिभिनिलिडेन फ्लोराइड झिल्ली (GE हेल्थकेयर) मा ब्लट गरियो। गैर-विशिष्ट साइटहरू ब्लक गर्नुहोस् र TBST मा ५% दूधमा प्राथमिक एन्टिबडी (विवरणको लागि तालिका S1 हेर्नुहोस्) इन्क्युबेट गर्नुहोस् (Tween सँग Tris-buffered सलाइन), धुने चरणहरू र TBST इन्क्युबेटमा माध्यमिक एन्टिबडी। +४°C मा रातभर प्राथमिक एन्टिबडीसँग इन्क्युबेट गर्नुहोस्। धोएपछि, कोठाको तापक्रममा २ घण्टाको लागि माध्यमिक एन्टिबडी लगाउनुहोस्। त्यसपछि, एन्टी-β-एक्टिन एन्टिबडीको साथ उही ब्लटलाई इन्क्युबेट गरेर, उही लोडिङ पुष्टि भयो। केमिल्युमिनेसेन्समा रूपान्तरण गरेर र केमिल्युमिनेसेन्स बढाएर पत्ता लगाउने (GE हेल्थकेयर)।
पहिले गिलास कभरस्लिपमा राखिएका न्युरोनहरूलाई कोठाको तापक्रममा तोकिएको समयमा १० मिनेटको लागि ४% प्याराफर्मल्डिहाइड (PFA)/PBS ले फिक्स गरिएको थियो। कभरस्लिपहरूलाई पहिले ०.१% ट्राइटन X-१००/PBS ले कोठाको तापक्रममा ५ मिनेटको लागि पारमिट गरिन्छ, र त्यसपछि ब्लकिङ बफरमा [३% बोवाइन सीरम एल्बुमिन (BSA)/PBS] राखिन्छ। दोस्रो दिन, कभरस्लिपहरूलाई ब्लकिङ बफरले धोइयो र कोठाको तापक्रममा २ घण्टाको लागि उपयुक्त फ्लोरोफोर-कन्जुगेटेड सेकेन्डरी एन्टिबडीले इन्क्युबेट गरिएको थियो; अन्तमा, नमूनाहरूलाई PBS मा ४′,६-डायमिडिनो-२ -फेनिलिन्डोल (DAPI) सँग राम्ररी धोइयो र त्यसपछि एक्वा-पोली/माउन्टको साथ माइक्रोस्कोप स्लाइडमा फिक्स गरियो।
मुसाहरू (पुरुष र महिला) लाई केटामाइन (१३० मिलीग्राम/किग्रा) र जाइलाजिन (१० मिलीग्राम/किग्रा) को इन्ट्रापेरिटोनियल इन्जेक्सनद्वारा बेहोस बनाइयो र कार्प्रोफेन एनाल्जेसिक (५ मिलीग्राम/किग्रा) को साथ छालाको छालामा दिइयो, र न्यानो प्याडले सुसज्जित स्टेरियोट्याक्टिक उपकरण (कोप्फ) मा राखियो। खोपडी खोल्नुहोस् र मिस हड्डीसँग सम्बन्धित सेरेबेलर कोर्टेक्सको भागलाई पातलो बनाउन डेन्टल ड्रिल प्रयोग गर्नुहोस् (ल्याम्ब्डाबाट: पुच्छर १.८, पार्श्व १, लोब्युल IV र V सँग सम्बन्धित)। तलको भास्कुलेचरलाई बाधा पुर्‍याउनबाट बच्न खोपडीमा सावधानीपूर्वक सानो प्वाल सिर्जना गर्न घुमाउरो सिरिन्ज सुई प्रयोग गर्नुहोस्। त्यसपछि पातलो कोरिएको गिलास केशिकालाई बिस्तारै माइक्रो-होलमा घुसाइन्छ (ड्युरा मेटरको भेन्ट्रल साइडमा -१.३ देखि -१ सम्म), र २०० देखि ३०० एनएल AAV लाई १० देखि २० मिनेटको विन्डोको अवधिमा कम चापमा म्यानुअल सिरिन्ज (नारिशिगे) को साथ माइक्रो-इन्जेक्टर (नारिशिगे) मा धेरै पटक इन्जेक्ट गरिन्छ। इन्फ्युजन पछि, भाइरस पूर्ण रूपमा फैलिन अनुमति दिनको लागि केशिकालाई अर्को १० मिनेटको लागि राख्नुहोस्। केशिकाहरू हटाइएपछि, घाउको सूजन कम गर्न र जनावरलाई निको हुन अनुमति दिन छालालाई सावधानीपूर्वक सिलाई गरिन्छ। शल्यक्रिया पछि धेरै दिनसम्म जनावरहरूलाई एनाल्जेसिक्स (क्यास्पोफेन) ले उपचार गरिएको थियो, जुन समयमा तिनीहरूको शारीरिक अवस्था सावधानीपूर्वक निगरानी गरिएको थियो र त्यसपछि तिनीहरूलाई तोकिएको समय बिन्दुमा युथनाइज गरिएको थियो। सबै प्रक्रियाहरू युरोपेली, राष्ट्रिय र संस्थागत दिशानिर्देशहरू अनुसार गरिएको थियो र जर्मनीको उत्तरी राइन-वेस्टफेलियाको उमवेल्ट र भेर्ब्राउचरस्चुट्जको ल्यान्डेसामटफरनाटुर द्वारा अनुमोदित गरिएको थियो।
जनावरहरूलाई केटामाइन (१०० मिलीग्राम/किग्रा) र जाइलाजिन (१० मिलीग्राम/किग्रा) ले बेहोस पारिएको थियो, र मुटुलाई पहिले ०.१ एम पीबीएस र त्यसपछि पीबीएसमा ४% पीएफएले पर्फ्यूज गरिएको थियो। तन्तुलाई ४° सेल्सियसमा रातभर ४% पीएफए/पीबीएसमा विच्छेदन गरी फिक्स गरिएको थियो। पीबीएसमा स्थिर मस्तिष्कबाट साजिटल सेक्सनहरू (५० μm बाक्लो) तयार गर्न कम्पन गर्ने चक्कु (लाइका माइक्रोसिस्टम्स जीएमबीएच, भियना, अस्ट्रिया) प्रयोग गरिएको थियो। अन्यथा निर्दिष्ट नगरिएसम्म, माथि वर्णन गरिए अनुसार (१३) कोठाको तापक्रममा र हलचलमा फ्री-फ्लोटिंग सेक्सनहरूको दाग लगाइएको थियो। छोटकरीमा, पहिले, प्राप्त स्लाइसहरूलाई कोठाको तापक्रममा १५ मिनेटको लागि ०.५% ट्राइटन एक्स-१००/पीबीएसले पारगम्य बनाइएको थियो; केही एपिटोपहरू (पीसीएक्स र श्मट२) को लागि, ८०° सेल्सियस (पीएच ९) मा ट्रिस-ईडीटीए बफरमा यो चरणको सट्टा २५ मिनेटको लागि स्लाइसहरू तताउनुहोस्। त्यसपछि, खण्डहरूलाई प्राथमिक एन्टिबडी (तालिका S1 हेर्नुहोस्) ब्लकिङ बफर (३% BSA/PBS) मा ४°C मा रातभरि हलचल गर्दै इन्क्युबेट गरिएको थियो। भोलिपल्ट, खण्डहरूलाई ब्लकिङ बफरले धोइयो र कोठाको तापक्रममा २ घण्टाको लागि उपयुक्त फ्लोरोफोर-कन्जुगेटेड सेकेन्डरी एन्टिबडीले इन्क्युबेट गरिएको थियो; अन्तमा, खण्डहरूलाई PBS मा राम्ररी धोइयो, DAPI ले काउन्टर-स्टेन गरियो, र त्यसपछि माइक्रोस्कोप स्लाइडमा AquaPolymount सँग फिक्स गरियो।
नमूनाको छवि बनाउन सेतो प्रकाश लेजर र ४०५ डायोड अल्ट्राभायोलेट लेजरले सुसज्जित लेजर स्क्यानिङ कन्फोकल माइक्रोस्कोप (TCS SP8-X वा TCS डिजिटल लाइट शीट, Leica माइक्रोसिस्टम्स) प्रयोग गरिएको थियो। फ्लोरोफोरलाई उत्तेजित गरेर र हाइब्रिड डिटेक्टर (HyDs) मार्फत सिग्नल सङ्कलन गरेर, LAS-X सफ्टवेयरलाई अनुक्रमिक मोडमा Nyquist नमूना अनुरूप स्ट्याक्ड छविहरू सङ्कलन गर्न प्रयोग गरिएको थियो: गैर-मात्रात्मक प्यानलहरूको लागि, यो अत्यधिक गतिशील संकेतहरू हुन् (उदाहरणका लागि, सोमाटिक कोषहरू र डेन्ड्राइटहरूमा) mtYFP) BrightR मोडमा PNs को संख्या पत्ता लगाउन HyD प्रयोग गर्नुहोस्)। पृष्ठभूमि घटाउन ०.३ देखि ६ ns सम्मको गेटिङ लागू गरिन्छ।
क्रमबद्ध कोषहरूको वास्तविक-समय इमेजिङ। १% B27 पूरक र ०.५ mM GlutaMax भएको Neurobasal-A माध्यममा क्रमबद्ध गरेपछि, कोषहरूलाई तुरुन्तै poly-l-lysine-लेपित गिलास स्लाइडहरू (μ-Slide8 Well, Ibidi, क्याटलग नम्बर ८०८२६) मा सिड गरियो, र त्यसपछि कोषहरूलाई स्थिर हुन अनुमति दिन यसलाई ३७°C र ५% CO2 मा १ घण्टाको लागि राख्नुहोस्। सेतो लेजर, HyD, ६३×[१.४ संख्यात्मक एपर्चर (NA)] तेल वस्तुगत लेन्स र तताउने चरणले सुसज्जित Leica SP8 लेजर स्क्यानिङ कन्फोकल माइक्रोस्कोपमा वास्तविक-समय इमेजिङ गरिएको थियो।
मुसालाई चाँडै कार्बन डाइअक्साइडले बेहोस बनाइयो र टाउको काटियो, मस्तिष्कलाई तुरुन्तै खोपडीबाट हटाइयो, र २००μm बाक्लो (१३C लेबलिङ प्रयोगको लागि) वा २७५μm बाक्लो (दुई फोटोन प्रयोगको लागि) मा काटियो। निम्न सामग्रीहरूले भरिएको साजिटल खण्ड आइसक्रिम (HM-650 V, थर्मो फिशर साइन्टिफिक, वाल्डोर्फ, जर्मनी) निम्न पदार्थहरूले भरिएको छ: १२५ mM बरफ-चिसो, कार्बन-संतृप्त (९५% O2 र ५% CO2) कम Ca2 + कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (ACSF) NaCl, २.५ mM KCl, १.२५ mM सोडियम फस्फेट बफर, २५ mM NaHCO3, २५ mM ग्लुकोज, ०.५ mM CaCl2 र ३.५ mM MgCl2 (३१० देखि ३३० mmol को ओस्मोटिक प्रेसर)। प्राप्त मस्तिष्कका टुक्राहरूलाई उच्च Ca2 + ACSF (१२५.० mM NaCl, २.५ mM KCl, १.२५ mM सोडियम फस्फेट बफर, २५.० mM NaHCO3, २५.० mM d-ग्लुकोज, १.० mM CaCl2 र २.० mM MgCl2 (मध्यम) pH ७.४ र ३१० देखि ३२० mmol) भएको पूर्व-इन्क्युबेशन कक्षमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्।
इमेजिङ प्रक्रियाको क्रममा, स्लाइसहरूलाई समर्पित इमेजिङ कोठामा सारियो, र प्रयोग ३२° देखि ३३°C को स्थिर तापक्रममा निरन्तर ACSF पर्फ्युजन अन्तर्गत गरिएको थियो। स्लाइस इमेजिङको लागि Leica २५x वस्तुगत लेन्स (NA ०.९५, पानी), Ti: नीलम लेजर (Cameleon Vision II, Coherent) ले सुसज्जित मल्टीफोटन लेजर स्क्यानिङ माइक्रोस्कोप (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) प्रयोग गरिएको थियो। FLIM मोड्युल (PicoHarp300, PicoQuant)।
Grx1-roGFP2 को FLIM। PNs को साइटोप्लाज्मिक रेडक्स अवस्थामा परिवर्तनहरू दुई-फोटोन FLIM द्वारा sagittal मस्तिष्क स्लाइसहरूमा मापन गरिएको थियो, जहाँ Grx1-roGFP2 बायोसेन्सरले PNs लाई लक्षित गर्‍यो। PN तहमा, अधिग्रहण क्षेत्र स्लाइस सतह भन्दा लगभग 50 देखि 80 μm तल चयन गरिन्छ ताकि त्यहाँ एक व्यवहार्य PN (अर्थात्, डेन्ड्राइट्सको साथ मनका संरचना वा न्यूरोनल मोर्फोलॉजिकल परिवर्तनहरूको अभाव) र डबल सकारात्मक roGFP2 सेन्सर र AAV एन्कोडिङ shRNA PCx वा यसको नियन्त्रण अनुक्रम (प्रत्येक सह-अभिव्यक्त mCherry) छ भनी सुनिश्चित गर्न। 2x डिजिटल जुम [उत्तेजना तरंगदैर्ध्य: 890 nm; 512 nm 512 पिक्सेल] को साथ एकल-स्ट्याक छविहरू सङ्कलन गर्नुहोस्। पत्ता लगाउने: आन्तरिक HyD, फ्लोरोसेसिन आइसोथियोसाइनेट (FITC) फिल्टर समूह] र 2 देखि 3 मिनेट भित्र छवि औसत प्रयोग गरिन्छ कर्भ फिटिंगको लागि पर्याप्त फोटोनहरू सङ्कलन गरिएको छ (कुल 1000 फोटोनहरू) सुनिश्चित गर्न। Grx1-roGFP2 प्रोबको संवेदनशीलता र FLIM अवस्थाहरूको प्रमाणीकरण roGFP2 को आयु मानको निगरानी गरेर गरिएको थियो जब पर्फ्युजन ACSF मा एक्सोजेनस १० mM H2O2 थपियो (अक्सिडेशनलाई अधिकतम बनाउन, जसको परिणामस्वरूप आयु बढ्यो), र त्यसपछि २ mM dithiothreitol थपियो (घटाउने डिग्रीलाई न्यूनतम बनाउँछ, जसको परिणामस्वरूप आयु घट्छ) (चित्र S8, D देखि G)। प्राप्त परिणामहरूको विश्लेषण गर्न FLIMfit 5.1.1 सफ्टवेयर प्रयोग गर्नुहोस्, सम्पूर्ण छविको एकल घातांकीय क्षय वक्रलाई मापन गरिएको IRF (उपकरण प्रतिक्रिया प्रकार्य) मा फिट गर्नुहोस्, र χ2 लगभग १ हो। एकल PN को जीवनकाल गणना गर्न, स्नायु शरीर वरिपरिको मास्क म्यानुअल रूपमा कोरिएको थियो, र प्रत्येक मास्कमा औसत जीवनकाल परिमाण निर्धारणको लागि प्रयोग गरिएको थियो।
माइटोकन्ड्रियल सम्भाव्यता विश्लेषण। तीव्र खण्डलाई १०० एनएम TMRM सिधै ३० मिनेटको लागि परफ्युज गरिएको ACSF मा थपेर इन्क्युबेट गरिसकेपछि, PN को माइटोकन्ड्रियल सम्भाव्यता परिवर्तनहरू दुई-फोटोन माइक्रोस्कोपद्वारा मापन गरियो। TMRM इमेजिङ ९२० एनएममा प्रोबलाई रोमाञ्चक बनाएर र आन्तरिक HyD (tetramethylrhodamine isothiocyanate: ५८५/४० एनएम) प्रयोग गरेर संकेतहरू सङ्कलन गरेर गरिएको थियो; उही उत्तेजना तरंगदैर्ध्य प्रयोग गरेर तर फरक आन्तरिक HyD (FITC :५२५/५०) प्रयोग गरेर mtYFP छवि गर्न। एकल कोष स्तरमा माइटोकन्ड्रियल सम्भाव्यताको मूल्याङ्कन गर्न ImageJ को छवि क्याल्कुलेटर प्लग-इन प्रयोग गर्नुहोस्। छोटकरीमा, प्लग-इन समीकरण: सिग्नल = न्यूनतम (mtYFP, TMRM) सम्बन्धित च्यानलको एकल-स्ट्याक कन्फोकल छविमा पुर्किन्जे सोमालीमा TMRM संकेत देखाउने माइटोकन्ड्रियल क्षेत्र पहिचान गर्न प्रयोग गरिन्छ। त्यसपछि परिणामस्वरूप मास्कमा रहेको पिक्सेल क्षेत्रको परिमाण निर्धारण गरिन्छ, र त्यसपछि माइटोकोन्ड्रियल क्षमता देखाउने माइटोकोन्ड्रियल अंश प्राप्त गर्न mtYFP च्यानलको सम्बन्धित थ्रेसहोल्ड एकल-स्ट्याक छविमा सामान्यीकृत गरिन्छ।
छविलाई Huygens Pro (साइन्टिफिक भोल्युम इमेजिङ) सफ्टवेयरको साथ डिकन्भोलुट गरिएको थियो। टाइलहरूको स्क्यान गरिएका तस्वीरहरूको लागि, LAS-X सफ्टवेयरद्वारा प्रदान गरिएको स्वचालित स्टिचिङ एल्गोरिथ्म प्रयोग गरेर एकल टाइलको मोन्टेज बनाइन्छ। छवि क्यालिब्रेसन पछि, छविलाई थप प्रशोधन गर्न र चमक र कन्ट्रास्टलाई समान रूपमा समायोजन गर्न ImageJ र Adobe Photoshop प्रयोग गर्नुहोस्। ग्राफिक तयारीको लागि Adobe Illustrator प्रयोग गर्नुहोस्।
mtDNA फोकस विश्लेषण। कन्फोकल माइक्रोस्कोपद्वारा DNA विरुद्ध एन्टिबडीहरू लेबल गरिएका सेरेबेलर खण्डहरूमा mtDNA घाउहरूको संख्या परिमाण गरिएको थियो। प्रत्येक लक्ष्य क्षेत्र कोशिकाको शरीर र प्रत्येक कोशिकाको न्यूक्लियसको लागि सिर्जना गरिएको थियो, र सम्बन्धित क्षेत्र बहु ​​मापन प्लग-इन (ImageJ सफ्टवेयर) प्रयोग गरेर गणना गरिएको थियो। साइटोप्लाज्मिक क्षेत्र प्राप्त गर्न सेल बडी क्षेत्रबाट आणविक क्षेत्र घटाउनुहोस्। अन्तमा, थ्रेसहोल्ड छविमा mtDNA संकेत गर्ने साइटोप्लाज्मिक DNA बिन्दुहरूलाई स्वचालित रूपमा परिमाण गर्न विश्लेषण कणहरू प्लग-इन (ImageJ सफ्टवेयर) प्रयोग गरिएको थियो, र प्राप्त परिणामहरूलाई CTRL मुसाको PN औसतमा सामान्यीकृत गरिएको थियो। परिणामहरू प्रति सेल न्यूक्लियोसाइडहरूको औसत संख्याको रूपमा व्यक्त गरिन्छ।
प्रोटिन अभिव्यक्ति विश्लेषण। एकल कोष स्तरमा PN मा प्रोटिन अभिव्यक्ति मूल्याङ्कन गर्न ImageJ को छवि क्याल्कुलेटर प्लग-इन प्रयोग गर्नुहोस्। छोटकरीमा, सम्बन्धित च्यानलको एकल-तह कन्फोकल छविमा, समीकरण मार्फत: सिग्नल = न्यूनतम (mtYFP, एन्टिबडी), Purkina मा एक निश्चित एन्टिबडीमा इम्युनोरिएक्टिविटी देखाउने माइटोकोन्ड्रियल क्षेत्र पहिचान गरिन्छ। त्यसपछि परिणामस्वरूप मास्कमा पिक्सेल क्षेत्र परिमाण गरिन्छ, र त्यसपछि प्रदर्शित प्रोटीनको माइटोकोन्ड्रियल अंश प्राप्त गर्न mtYFP च्यानलको सम्बन्धित थ्रेसहोल्ड एकल-स्ट्याक छविमा सामान्यीकृत गरिन्छ।
पुर्किन्जे कोष घनत्व विश्लेषण। इमेजजेको सेल काउन्टर प्लग-इन गणना गरिएका कोषहरूले ओगटेको सेरेबेलर रिंगको लम्बाइले गणना गरिएका पुर्किन्जे कोषहरूको संख्यालाई भाग गरेर पुर्किन्जे घनत्व मूल्याङ्कन गर्न प्रयोग गरिएको थियो।
नमूना तयारी र सङ्कलन। नियन्त्रण समूह र Mfn2cKO मुसाहरूको दिमागलाई ०.१ M फस्फेट बफर (PB) मा २% PFA/२.५% ग्लुटाराल्डिहाइडमा फिक्स गरिएको थियो, र त्यसपछि कोरोनल खण्डहरू सिलिएट्स (Leica Mikrosysteme GmbH, भियना, अस्ट्रिया) (मोटाई ५० देखि ६० μm) प्रयोग गरेर तयार पारिएको थियो। त्यसपछि PB बफरमा १% os टेट्राअक्साइड र १.५% पोटासियम फेरोसायनाइडमा कोठाको तापक्रममा १ घण्टाको लागि फिक्स गरिएको थियो। खण्डहरूलाई डिस्टिल्ड पानीले तीन पटक धोइयो, र त्यसपछि २० मिनेटको लागि १% युरेनिल एसीटेट भएको ७०% इथेनॉलले दाग लगाइयो। त्यसपछि खण्डहरूलाई ग्रेडेड अल्कोहलमा निर्जलित गरियो र सिलिकन-लेपित गिलास स्लाइडहरू बीच Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxy resin (इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोपी साइन्सेस, क्याटलग नम्बर १४०४०) मा इम्बेड गरिएको थियो, र अन्तमा ६०°C मा ४८ घण्टाको लागि ओभनमा पोलिमराइज गरिएको थियो। सेरेबेलर कोर्टेक्स क्षेत्र चयन गरिएको थियो र Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, भियना, अस्ट्रिया) मा ५० nm अल्ट्राथिन खण्डहरू काटिएका थिए र पोलिस्टीरिन फिल्मले लेपित २×१ मिमी तामाको स्लिट ग्रिडमा छानिएका थिए। खण्डहरूलाई H2O मा ४% युरेनिल एसीटेटको घोलले १० मिनेटको लागि दाग लगाइएको थियो, H2O ले धेरै पटक धोइएको थियो, त्यसपछि Reynolds लेड साइट्रेट H2O मा १० मिनेटको लागि धोइएको थियो, र त्यसपछि H2O ले धेरै पटक धोइएको थियो। TVIPS (Tietz भिडियो र छवि प्रशोधन प्रणाली) TemCam-F416 डिजिटल क्यामेरा (TVIPS GmbH, Gauting, USA) प्रयोग गरेर ट्रान्समिशन इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोप Philips CM100 (थर्मो फिशर साइन्टिफिक, वाल्थम, MA, USA) को साथ माइक्रोग्राफहरू लिइएको थियो। जर्मनी)।
AAV बाट संक्रमित मुसाहरूको लागि, मस्तिष्कलाई छुट्याइएको थियो र १ मिमी बाक्लो साजिटल खण्डमा काटिएको थियो, र AAV-संक्रमित रिंग (अर्थात्, mCherry expressing) पहिचान गर्न फ्लोरोसेन्स माइक्रोस्कोप प्रयोग गरेर सेरिबेलमको जाँच गरिएको थियो। AAV इन्जेक्सनले कम्तिमा दुई लगातार सेरिबेलर रिंगहरूमा Purkinje सेल तह (अर्थात् लगभग सम्पूर्ण तह) को धेरै उच्च ट्रान्सडक्सन दक्षतामा परिणाम दिने प्रयोगहरू मात्र प्रयोग गरिन्छ। AAV-ट्रान्सड्यूस गरिएको लूपलाई रातभर पोस्ट-फिक्सेसनको लागि माइक्रोडिसेक्ट गरिएको थियो (०.१ M कोकोट बफरमा ४% PFA र २.५% ग्लुटाराल्डिहाइड) र थप प्रशोधन गरिएको थियो। EPON इम्बेडिङको लागि, फिक्स्ड टिस्युलाई ०.१ M सोडियम कोकोट बफर (एप्लिकेम) मा २% OsO4 (os, Science Services; Caco) संग ४ घण्टा इन्क्युबेट गरिएको थियो, त्यसपछि २ घण्टाको लागि धुनुहोस्। ०.१ M कोकामाइड बफरको साथ ३ पटक दोहोर्याउनुहोस्। त्यसपछि, टिस्युलाई डिहाइड्रेट गर्नको लागि प्रत्येक इथेनॉल घोललाई ४°C मा १५ मिनेटको लागि इन्क्युबेट गर्न इथेनॉलको आरोही श्रृंखला प्रयोग गरियो। टिस्युलाई प्रोपाइलिन अक्साइडमा स्थानान्तरण गरियो र ४°C मा EPON (सिग्मा-एल्ड्रिच) मा रातभर इन्क्युबेट गरियो। टिस्युलाई कोठाको तापक्रममा ताजा EPON मा २ घण्टाको लागि राख्नुहोस्, र त्यसपछि यसलाई ६२°C मा ७२ घण्टाको लागि इम्बेड गर्नुहोस्। ७० nm अल्ट्राथिन खण्डहरू काट्न अल्ट्रामाइक्रोटोम (Leica Microsystems, UC6) र हीराको चक्कु (Diatome, Biel, स्विट्जरल्याण्ड) प्रयोग गर्नुहोस्, र ३७°C मा १५ मिनेटको लागि १.५% युरेनिल एसीटेटले दाग लगाउनुहोस्, र ४ मिनेटको लागि लिड साइट्रेट घोलले दाग लगाउनुहोस्। क्यामेरा वनभ्यू ४K १६-बिट (Gatan) र डिजिटलमाइक्रोग्राफ सफ्टवेयर (Gatan) ले सुसज्जित JEM-2100 Plus ट्रान्समिशन इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोप (JEOL) प्रयोग गरेर इलेक्ट्रोन माइक्रोग्राफहरू लिइएका थिए। विश्लेषणको लागि, इलेक्ट्रोन माइक्रोग्राफहरू ५०००× वा १०,०००× डिजिटल जुमको साथ प्राप्त गरिएको थियो।
माइटोकोन्ड्रियाको मोर्फोलॉजिकल विश्लेषण। सबै विश्लेषणहरूको लागि, व्यक्तिगत माइटोकोन्ड्रियाको रूपरेखा इमेजजे सफ्टवेयर प्रयोग गरेर डिजिटल छविहरूमा म्यानुअल रूपमा रेखांकित गरिएको थियो। विभिन्न मोर्फोलॉजिकल प्यारामिटरहरूको विश्लेषण गरिन्छ। माइटोकोन्ड्रियाको घनत्व प्रत्येक कोषको कुल माइटोकोन्ड्रियल क्षेत्रलाई साइटोप्लाज्म क्षेत्र (साइटोप्लाज्म क्षेत्र = कोष क्षेत्र-कोष न्यूक्लियस क्षेत्र) × १०० ले विभाजन गरेर प्राप्त प्रतिशतको रूपमा व्यक्त गरिन्छ। माइटोकोन्ड्रियाको गोलाकारता सूत्र [4π∙(क्षेत्र/परिधि २)] द्वारा गणना गरिन्छ। माइटोकोन्ड्रियाको इस्टा मोर्फोलजीको विश्लेषण गरिएको थियो र तिनीहरूको मुख्य आकारहरू अनुसार दुई कोटीहरू ("ट्यूबुलर" र "फोलिक") मा विभाजित गरिएको थियो।
अटोफ्यागोसोम/लाइसोसोम संख्या र घनत्व विश्लेषण। डिजिटल छविमा प्रत्येक अटोफ्यागोसोम/लाइसोसोमको रूपरेखा म्यानुअल रूपमा रूपरेखा गर्न ImageJ सफ्टवेयर प्रयोग गर्नुहोस्। अटोफ्यागोसोम/लाइसोसोम क्षेत्रलाई प्रत्येक कोषको कुल अटोफ्यागोसोम/लाइसोसोम संरचना क्षेत्रलाई साइटोप्लाज्म क्षेत्र (साइटोप्लाज्म क्षेत्र = कोष क्षेत्र-न्यूक्लियस क्षेत्र) × १०० ले भाग गरेर गणना गरिएको प्रतिशतको रूपमा व्यक्त गरिन्छ। अटोफ्यागोसोम/लाइसोसोमको घनत्व प्रति कोष अटोफ्यागोसोम/लाइसोसोम संरचनाहरूको संख्या (साइटोप्लाज्मिक क्षेत्रको हिसाबले) (साइटोप्लाज्मिक क्षेत्र = कोष क्षेत्र-न्यूक्लियर क्षेत्र) ले कुल संख्यालाई भाग गरेर गणना गरिन्छ।
तीव्र खण्डीकरण र नमूना तयारीको लागि लेबलिङ। ग्लुकोज लेबलिङ आवश्यक पर्ने प्रयोगहरूको लागि, तीव्र मस्तिष्कका टुक्राहरूलाई पूर्व-इन्क्युबेशन कक्षमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्, जसमा संतृप्त कार्बन (९५% O2 र ५% CO2), उच्च Ca2 + ACSF (१२५.० mM NaCl, २.५ mM KCl, १.२५ mM सोडियम फस्फेट बफर, २५.० mM NaHCO ३, २५.० mM d-ग्लुकोज, १.० mM CaCl २ र २.० mM MgCl २, pH ७.४ र ३१० देखि ३२० mOsm मा समायोजित गरिएको हुन्छ), जसमा ग्लुकोज १३ C ६- ग्लुकोज प्रतिस्थापन (युरिसोटप, क्याटलग नम्बर CLM-१३९६) हुन्छ। पाइरुभेट लेबलिङ आवश्यक पर्ने प्रयोगहरूको लागि, तीव्र मस्तिष्कका टुक्राहरूलाई उच्च Ca2 + ACSF (१२५.० mM NaCl, २.५ mM KCl, १.२५ mM सोडियम फस्फेट बफर, २५.० mM NaHCO3, २५.० mM d-ग्लुकोज, १.० mM CaCl2) मा स्थानान्तरण गर्नुहोस् र २.० mM MgCl2 थप्नुहोस्, pH ७.४ र ३१० लाई ३२०mOsm मा समायोजन गर्नुहोस्, र १ mM १-[१-१३C]पाइरुभेट (Eurisotop, क्याटलग नम्बर CLM-१०८२) थप्नुहोस्। ३७°C मा ९० मिनेटको लागि खण्डहरू इन्क्युबेट गर्नुहोस्। प्रयोगको अन्त्यमा, खण्डहरूलाई ७५ एमएम अमोनियम कार्बोनेट भएको जलीय घोल (पीएच ७.४) ले द्रुत रूपमा धोइयो, र त्यसपछि ४०:४०:२० (v:v:v) एसिटोनिट्राइल (ACN): मेथानोल: पानीमा एकरूप बनाइयो। खण्डहरूलाई ३० मिनेटको लागि बरफमा इन्क्युबेट गरिसकेपछि, नमूनाहरूलाई ४°C मा १० मिनेटको लागि २१,००० ग्राममा सेन्ट्रीफ्यूज गरियो, र स्पष्ट सुपरनेटेन्टलाई स्पीडभ्याक कन्सेन्ट्रेटरमा सुकाइयो। परिणामस्वरूप सुकेको मेटाबोलाइट गोली विश्लेषण नभएसम्म -८०°C मा भण्डारण गरिएको थियो।
१३ C-लेबल गरिएका एमिनो एसिडहरूको तरल क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण। तरल क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS) विश्लेषणको लागि, मेटाबोलाइट गोलीलाई LC-MS ग्रेड पानी (हनीवेल) को ७५μl मा पुन: निलम्बन गरिएको थियो। ४°C मा ५ मिनेटको लागि २१,००० ग्राममा केन्द्रापसार गरेपछि, स्पष्ट सुपरनाटेन्टको २० μl एमिनो एसिड फ्लक्स विश्लेषणको लागि प्रयोग गरिएको थियो, जबकि बाँकी अर्क तुरुन्तै एनियन विश्लेषणको लागि प्रयोग गरिएको थियो (तल हेर्नुहोस्)। एमिनो एसिड विश्लेषण पहिले वर्णन गरिएको बेन्जोयल क्लोराइड डेरिभेटिजेसन प्रोटोकल (५५, ५६) प्रयोग गरेर गरिएको थियो। पहिलो चरणमा, १०० mM सोडियम कार्बोनेट (सिग्मा-एल्ड्रिच) को १०μl मेटाबोलाइट एक्स्ट्र्याक्टको २०μl मा थपिएको थियो, र त्यसपछि २% बेन्जोयल क्लोराइड (सिग्मा-एल्ड्रिच) को १०μl LC ग्रेड ACN मा थपिएको थियो। नमूनालाई छोटो समयको लागि भोर्टेक्स गरिएको थियो र त्यसपछि २० डिग्री सेल्सियसमा ५ मिनेटको लागि २१,००० ग्राममा सेन्ट्रीफ्यूज गरिएको थियो। क्लियर गरिएको सुपरनाटेन्टलाई कोनिकल गिलास इन्सर्ट (२०० μl भोल्युम) सहित २ मिलीलीटर अटोस्याम्पलर शीशीमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्। नमूनाहरूलाई Q-Exactive (QE)-HF (अल्ट्रा हाई फिल्ड अर्बिट्राप) उच्च-रिजोल्युसन प्रेसिजन मास स्पेक्ट्रोमिटर (थर्मो फिशर साइन्टिफिक) मा जडान गरिएको Acquity iClass अल्ट्रा-हाई पर्फर्मेन्स LC प्रणाली (वाटर) प्रयोग गरेर विश्लेषण गरिएको थियो। विश्लेषणको लागि, व्युत्पन्न नमूनाको २μl १.८μm कणहरू भएको १००×१.० मिमी उच्च-शक्ति सिलिका T3 स्तम्भ (वाटर) मा इन्जेक्ट गरिएको थियो। प्रवाह दर १००μl/मिनेट छ, र बफर प्रणालीमा बफर A (१० mM अमोनियम ढाँचा र पानीमा ०.१५% फॉर्मिक एसिड) र बफर B (ACN) हुन्छ। ग्रेडियन्ट निम्नानुसार छ: ० मिनेटमा ०%B; ०%B। ० देखि ०.१ मिनेटमा ० देखि १५% B; ०.१ देखि ०.५ मिनेटमा १५ देखि १७% B; ०.५ देखि १४ मिनेटमा १७ देखि ५५% B; १४ देखि १४.५ मिनेटमा ५५ देखि ७०% B; १८ मिनेटमा १४.५ देखि ७० देखि १००% B; १८ देखि १९ मिनेटमा १००% B; १९ देखि १९.१ मिनेटमा १०० देखि ०% B; १९.१ देखि २८ मिनेटमा ०% B (५५, ५६)। QE-HF मास स्पेक्ट्रोमिटरले ५० देखि ७५० को m/z (मास/चार्ज अनुपात) को द्रव्यमान दायराको साथ सकारात्मक आयनीकरण मोडमा काम गर्छ। लागू गरिएको रिजोल्युसन ६०,००० छ, र प्राप्त गरिएको लाभ नियन्त्रण (AGC) आयन लक्ष्य ३×१०६ छ, र अधिकतम आयन समय १०० मिलिसेकेन्ड छ। तताइएको इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ESI) स्रोत ३.५ kV को स्प्रे भोल्टेज, २५०°C को केशिका तापक्रम, ६० AU (मनमानी एकाइहरू) को म्यान एयरफ्लो, र २० AU. २५०°C को सहायक एयरफ्लोमा काम गर्छ। S लेन्स ६० AU मा सेट गरिएको छ।
१३C लेबल गरिएको जैविक एसिडको एनियन क्रोमेटोग्राफी-एमएस विश्लेषण। बाँकी मेटाबोलाइट अवक्षेपण (५५μl) QE-HF मास स्पेक्ट्रोमिटर (थर्मो फिशर साइन्टिफिक) सँग जोडिएको डायोनेक्स आयन क्रोमेटोग्राफी प्रणाली (ICS ५०००+, थर्मो फिशर साइन्टिफिक) प्रयोग गरेर विश्लेषण गरिएको थियो। छोटकरीमा, ५μl मेटाबोलाइट एक्स्ट्र्याक्टलाई १ को फिलिंग अनुपातको साथ पुश-इन आंशिक लूप मोडमा HPLC (२ मिमी × २५० मिमी, कण आकार ४μm, थर्मो फिशर साइन्टिफिक) ले सुसज्जित डायोनेक्स आयनप्याक AS११-HC स्तम्भमा इन्जेक्ट गरिएको थियो। ) डायोनेक्स आयनप्याक AG११-HC गार्ड स्तम्भ (२ मिमी x ५० मिमी, ४μm, थर्मो फिशर साइन्टिफिक)। स्तम्भको तापक्रम ३०°C मा कायम राखिएको छ, र अटोस्याम्पलर ६°C मा सेट गरिएको छ। एल्युएन्ट जेनेरेटर मार्फत पोटासियम हाइड्रोक्साइड ग्रेडियन्ट उत्पन्न गर्न डिओनाइज्ड पानीले प्रदान गरिएको पोटासियम हाइड्रोक्साइड कार्ट्रिज प्रयोग गर्नुहोस्। ३८०μl/मिनेटको प्रवाह दरमा मेटाबोलाइटहरूको पृथकीकरण, निम्न ग्रेडियन्ट लागू गर्दै: ० देखि ३ मिनेट, १० मिमी KOH; ३ देखि १२ मिनेट, १० देखि ५० मिमी KOH; १२ देखि १९ मिनेट, ५० देखि १०० मिमी KOH; १९ देखि २१ मिनेट, १०० मिमी KOH; २१ देखि २१.५ मिनेट, १०० देखि १० मिमी KOH। स्तम्भलाई १० मिमी KOH अन्तर्गत ८.५ मिनेटको लागि पुन: सन्तुलित गरिएको थियो।
स्तम्भ पछि १५०μl/मिनेट आइसोप्रोपानोल पूरक स्ट्रिमसँग एल्युटेड मेटाबोलाइटहरू मिलाइन्छ र त्यसपछि नकारात्मक आयनीकरण मोडमा सञ्चालन हुने उच्च-रिजोल्युसन मास स्पेक्ट्रोमिटरमा निर्देशित गरिन्छ। MS ले ६०,००० को रिजोल्युसनको साथ m/z ५० देखि ७५० सम्मको मास दायरा निगरानी गरिरहेको छ। AGC १×१०६ मा सेट गरिएको छ, र अधिकतम आयन समय १०० ms मा राखिएको छ। तताइएको ESI स्रोत ३.५ kV को स्प्रे भोल्टेजमा सञ्चालन गरिएको थियो। आयन स्रोतको अन्य सेटिङहरू निम्नानुसार छन्: केशिका तापक्रम २७५°C; म्यान ग्यास प्रवाह, ६० AU; सहायक ग्यास प्रवाह, ३००°C मा २० AU, र S लेन्स ६० AU मा सेट गरिएको छ।
१३C लेबल गरिएका मेटाबोलाइटहरूको डेटा विश्लेषण। आइसोटोप अनुपातको डेटा विश्लेषणको लागि ट्रेसफाइन्डर सफ्टवेयर (संस्करण ४.२, थर्मो फिशर साइन्टिफिक) प्रयोग गर्नुहोस्। प्रत्येक यौगिकको पहिचान एक भरपर्दो सन्दर्भ यौगिकद्वारा प्रमाणित गरिएको थियो र स्वतन्त्र रूपमा विश्लेषण गरिएको थियो। आइसोटोप संवर्धन विश्लेषण गर्नको लागि, प्रत्येक १३C आइसोटोप (Mn) को निकालिएको आयन क्रोमेटोग्राम (XIC) को क्षेत्र [M + H] + बाट निकालिएको थियो, जहाँ n लक्ष्य यौगिकको कार्बन नम्बर हो, एमिनो एसिड विश्लेषण गर्न प्रयोग गरिन्छ वा [MH] + एनियनहरूको विश्लेषण गर्न प्रयोग गरिन्छ। XIC को द्रव्यमान शुद्धता प्रति मिलियन पाँच भाग भन्दा कम छ, र RT को शुद्धता ०.०५ मिनेट छ। प्रत्येक पत्ता लगाइएको आइसोटोपको अनुपात सम्बन्धित यौगिकको सबै आइसोटोपहरूको योगफलमा गणना गरेर संवर्धन विश्लेषण गरिन्छ। यी अनुपातहरू प्रत्येक आइसोटोपको लागि प्रतिशत मानहरूको रूपमा दिइन्छ, र परिणामहरू मोलर प्रतिशत संवर्धन (MPE) को रूपमा व्यक्त गरिन्छ, जस्तै पहिले वर्णन गरिएको (४२)।
जमेको न्यूरोन गोलीलाई बरफको चिसो ८०% मेथानोल (v/v) मा एकरूप बनाइएको थियो, भोर्टेक्स गरिएको थियो, र -२०°C मा ३० मिनेटको लागि इन्क्युबेट गरिएको थियो। नमूनालाई फेरि घुमाउनुहोस् र +४°C मा ३० मिनेटको लागि हलचल गर्नुहोस्। नमूनालाई २१,००० ग्राममा ४°C मा ५ मिनेटको लागि सेन्ट्रीफ्यूज गरिएको थियो, र त्यसपछि परिणामस्वरूप सुपरनेटेन्टलाई पछिको विश्लेषणको लागि २५°C मा स्पीडभ्याक कन्सेन्ट्रेटर प्रयोग गरेर सङ्कलन गरी सुकाइएको थियो। माथि वर्णन गरिए अनुसार, क्रमबद्ध कोषहरूको एमिनो एसिडहरूमा LC-MS विश्लेषण गरिएको थियो। TraceFinder (संस्करण ४.२, थर्मो फिशर साइन्टिफिक) प्रयोग गरेर, प्रत्येक यौगिकको मोनोआइसोटोपिक द्रव्यमान प्रयोग गरेर डेटा विश्लेषण गरिएको थियो। मेटाबोलाइट डेटाको मात्रात्मक सामान्यीकरण प्रिप्रोसेसकोर सफ्टवेयर प्याकेज (५७) प्रयोग गरेर गरिएको थियो।
स्लाइस तयारी। मुसालाई कार्बन डाइअक्साइडले तुरुन्तै बेहोस बनाइयो र टाउको काटियो, मस्तिष्कलाई तुरुन्तै खोपडीबाट हटाइयो, र बरफले भरिएको कम्पन चक्कु (HM-650 V, थर्मो फिशर साइन्टिफिक, वाल्डोर्फ, जर्मनी) प्रयोग गरी यसलाई ३०० देखि ३७५ μm साजिटल खण्डहरूमा काटियो। चिसो कार्बन ग्यासीकरण (९५% O2 र ५% CO2) कम Ca2 + ACSF (१२५.० mM NaCl, २.५ mM KCl, १.२५ mM सोडियम फस्फेट बफर, २५.० mM NaHCO3, २५.० mM d-ग्लुकोज, १.० mM CaCl2 र ६.० mM MgCl2 pH ७.४ र ३१० देखि ३३० mOsm मा समायोजन गर्नुहोस्)। प्राप्त मस्तिष्कका टुक्राहरूलाई उच्च Ca2 + ACSF (१२५.० mM NaCl, २.५ mM KCl, १.२५ mM सोडियम फस्फेट बफर, २५.० mM NaHCO3, २५.० mM d-ग्लुकोज, ४.० mM CaCl2 र mM ३.५ MgCl2) pH ७.४ र ३१० देखि ३२० mOsm भएको चेम्बरमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्। स्लाइसहरूलाई २० देखि ३० मिनेटसम्म भण्डारण गर्नुहोस् ताकि रेकर्ड गर्नु अघि तिनीहरूलाई पुनर्स्थापित गर्न सकियोस्।
रेकर्डिङ। सबै रेकर्डिङहरूको लागि स्थिर रेकर्डिङ चेम्बर र २०x पानी इमर्सन वस्तु लेन्स (साइन्टिफिका) ले सुसज्जित माइक्रोस्कोप स्टेज प्रयोग गरिएको थियो। पुटेटिभ पुर्किन्जे कोषहरू (i) शरीरको आकार, (ii) सेरिबेलमको शारीरिक स्थान, र (iii) फ्लोरोसेन्ट mtYFP रिपोर्टर जीनको अभिव्यक्तिद्वारा पहिचान गरिएको थियो। ५ देखि ११ मेगोह्म्सको टिप प्रतिरोध भएको प्याच पिपेटलाई बोरोसिलिकेट गिलास केशिका (GB150-10, 0.86 मिमी × १.५ मिमी × १०० मिमी, विज्ञान उत्पादनहरू, होफेम, जर्मनी) र तेर्सो पिपेट उपकरणहरू (P-१०००, सटर), नोभाटो, CA) द्वारा बाहिर निकालिन्छ। सबै रेकर्डिङहरू ELC-03XS npi प्याच क्ल्याम्प एम्पलीफायर (npi इलेक्ट्रोनिक GmbH, Tam, जर्मनी) द्वारा गरिएको थियो, जुन सफ्टवेयर सिग्नल (संस्करण ६.०, क्याम्ब्रिज इलेक्ट्रोनिक, क्याम्ब्रिज, बेलायत) द्वारा नियन्त्रित थियो। प्रयोग १२.५ kHz को नमूना दरमा रेकर्ड गरिएको थियो। सिग्नललाई क्रमशः १.३ र १० kHz को कटअफ फ्रिक्वेन्सी भएका दुई सर्ट-पास बेसेल फिल्टरहरूद्वारा फिल्टर गरिएको छ। झिल्ली र पिपेटको क्यापेसिटन्स एम्पलीफायर प्रयोग गरेर क्षतिपूर्ति सर्किटद्वारा क्षतिपूर्ति गरिन्छ। सबै प्रयोगहरू ओर्का-फ्ल्यास ४.० क्यामेरा (हामामात्सु, गर्डेन, जर्मनी) को नियन्त्रणमा गरिएको थियो, जुन होकावो सफ्टवेयर (संस्करण २.८, हमामात्सु, गर्डेन, जर्मनी) द्वारा नियन्त्रित थियो।
नियमित सम्पूर्ण-कोष कन्फिगरेसन र विश्लेषण। रेकर्ड गर्नुभन्दा तुरुन्तै, निम्न पदार्थहरू भएको आन्तरिक घोलले पिपेट भर्नुहोस्: ४.० एमएम केसीएल, २.० एमएम नाइक्ल, ०.२ एमएम ईजीटीए, १३५.० एमएम पोटासियम ग्लुकोनेट, १०.० एमएम हेप्स, ४.० एमएम एटीपी (एमजी), ०.५ एमएम गुआनोसिन ट्राइफोस्फेट (जीटीपी) (ना) र १०.० एमएम क्रिएटिनिन फस्फेटलाई पीएच ७.२५ मा समायोजन गरिएको थियो, र ओस्मोटिक प्रेसर २९० एमओएसएम (सुक्रोज) थियो। झिल्ली फुटाउन ० पीए को बल लागू गरेपछि तुरुन्तै, आराम गर्ने झिल्ली क्षमता मापन गरिएको थियो। इनपुट प्रतिरोध -४०, -३०, -२०, र -१० पीए को हाइपरपोलराइज्ड करेन्टहरू लागू गरेर मापन गरिन्छ। भोल्टेज प्रतिक्रियाको परिमाण मापन गर्नुहोस् र इनपुट प्रतिरोध गणना गर्न ओमको नियम प्रयोग गर्नुहोस्। ५ मिनेटको लागि भोल्टेज क्ल्याम्पमा स्वतःस्फूर्त गतिविधि रेकर्ड गरिएको थियो, र sPSC पहिचान गरिएको थियो र Igor Pro (संस्करण ३२ ७.०१, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) मा अर्ध-स्वचालित पहिचान स्क्रिप्ट प्रयोग गरेर मापन गरिएको थियो। IV कर्भ र स्थिर-अवस्था प्रवाह ब्याट्रीलाई विभिन्न क्षमताहरूमा क्ल्याम्प गरेर (-११० mV बाट सुरु हुँदै) र ५ mV चरणहरूमा भोल्टेज बढाएर मापन गरिन्छ। AP को उत्पादनलाई डिपोलराइजिङ करेन्ट लागू गरेर परीक्षण गरिएको थियो। डिपोलराइजिङ करेन्ट पल्स लागू गर्दा -७० mV मा सेल क्ल्याम्प गर्नुहोस्। प्रत्येक रेकर्डिङ एकाइको चरण आकार छुट्टाछुट्टै समायोजन गर्नुहोस् (१० देखि ६० pA)। उच्चतम AP फ्रिक्वेन्सी निम्त्याउने पल्स स्पाइकहरू म्यानुअल रूपमा गणना गरेर अधिकतम AP फ्रिक्वेन्सी गणना गर्नुहोस्। AP थ्रेसहोल्डलाई डिपोलराइजेशन पल्सको दोस्रो व्युत्पन्न प्रयोग गरेर विश्लेषण गरिन्छ जसले पहिले एक वा बढी AP हरू ट्रिगर गर्दछ।
छिद्रित प्याच कन्फिगरेसन र विश्लेषण। मानक प्रोटोकलहरू प्रयोग गरेर छिद्रित प्याच रेकर्डिङ गर्नुहोस्। निम्न सामग्रीहरू समावेश नगर्ने ATP- र GTP-मुक्त पिपेट प्रयोग गर्नुहोस्: १२८ mM ग्लुकोनेट K, १० mM KCl, १० mM Hepes, ०.१ mM EGTA र २ mM MgCl2, र pH ७.२ (KOH प्रयोग गरेर) मा समायोजन गर्नुहोस्। कोष झिल्लीको अनियन्त्रित पारगम्यता रोक्नको लागि ATP र GTP लाई इन्ट्रासेलुलर घोलबाट हटाइन्छ। पञ्च गरिएको प्याच रेकर्ड प्राप्त गर्न प्याच पिपेट एम्फोटेरिसिन युक्त आन्तरिक घोल (लगभग २०० देखि २५०μg/ml; G4888, सिग्मा-एल्ड्रिच) ले भरिएको हुन्छ। एम्फोटेरिसिनलाई डाइमिथाइल सल्फोक्साइडमा घुलनशील गरिएको थियो (अन्तिम सांद्रता: ०.१ देखि ०.३%; DMSO; D8418, सिग्मा-एल्ड्रिच)। प्रयोग गरिएको DMSO को सांद्रताले अध्ययन गरिएका न्यूरोनहरूमा कुनै महत्त्वपूर्ण प्रभाव पारेन। पंचिंग प्रक्रियाको क्रममा, च्यानल प्रतिरोध (Ra) निरन्तर निगरानी गरिएको थियो, र Ra र AP को आयाम स्थिर भएपछि (२०-४० मिनेट) प्रयोग सुरु गरिएको थियो। स्वतःस्फूर्त गतिविधि २ देखि ५ मिनेटको लागि भोल्टेज र/वा वर्तमान क्ल्याम्पमा मापन गरिन्छ। इगोर प्रो (संस्करण ७.०५.२, वेभमेट्रिक्स, संयुक्त राज्य अमेरिका), एक्सेल (संस्करण २०१०, माइक्रोसफ्ट कर्पोरेशन, रेडमन्ड, संयुक्त राज्य अमेरिका) र ग्राफप्याड प्रिज्म (संस्करण ८.१.२, ग्राफप्याड सफ्टवेयर इंक, ला जोला, CA) प्रयोग गरेर डेटा विश्लेषण गरिएको थियो। सहज AP हरू पहिचान गर्न, IgorPro को NeuroMatic v3.0c प्लग-इन प्रयोग गरिन्छ। दिइएको थ्रेसहोल्ड प्रयोग गरेर स्वचालित रूपमा AP हरू पहिचान गर्नुहोस्, जुन प्रत्येक रेकर्डको लागि व्यक्तिगत रूपमा समायोजित गरिन्छ। स्पाइक अन्तराल प्रयोग गरेर, अधिकतम तात्कालिक स्पाइक आवृत्ति र औसत स्पाइक आवृत्तिको साथ स्पाइक आवृत्ति निर्धारण गर्नुहोस्।
PN आइसोलेसन। पहिले प्रकाशित प्रोटोकलमा अनुकूलन गरेर, PN हरूलाई निर्दिष्ट चरणमा मुसाको सेरिबेलमबाट शुद्ध गरिएको थियो (58)। छोटकरीमा भन्नुपर्दा, सेरिबेलमलाई बरफ-चिसो विघटन माध्यममा विच्छेदन र कीमा बनाइएको थियो [HBSS Ca2+ र Mg2+ बिना, २० mM ग्लुकोज, पेनिसिलिन (५० U/ml) र स्ट्रेप्टोमाइसिन (०.०५ mg/ml) सँग पूरक], र त्यसपछि माध्यमलाई papain [HBSS, १-सिस्टाइन·HCl (१ mg/ml), papain (१६ U/ml) र deoxyribonuclease I (DNase I; ०.१ mg/ml) सँग पूरक] मा पचाउनुहोस्। ३०°C मा ३० मिनेटको लागि उपचार गर्नुहोस्। पहिले तन्तुहरूलाई कोठाको तापक्रममा अण्डाको म्यूकस (१० मिलीग्राम/मिली), BSA (१० मिलीग्राम/मिली) र DNase (०.१ मिलीग्राम/मिली) भएको HBSS माध्यममा धुनुहोस् ताकि इन्जाइम्याटिक पाचन रोकियोस्, र त्यसपछि २० मिलीग्राम ग्लुकोज भएको HBSS माध्यममा HBSS मा बिस्तारै पिस्दा, पेनिसिलिन (५० U/मिली), स्ट्रेप्टोमाइसिन (०.०५ मिलीग्राम/मिली) र DNase (०.१ मिलीग्राम/मिली) ले एकल कोषहरू छोड्छन्। परिणामस्वरूप कोष निलम्बनलाई ७०μm सेल स्ट्रेनर मार्फत फिल्टर गरिएको थियो, त्यसपछि कोषहरूलाई सेन्ट्रीफ्यूगेशन (१११० आरपीएम, ५ मिनेट, ४°C) द्वारा पेलेट गरिएको थियो र क्रमबद्ध माध्यममा पुन: निलम्बन गरिएको थियो [HBSS, २० मिलीग्राम ग्लुकोज, २०% भ्रूण गोवाइन) सीरम, पेनिसिलिन (५० U/मिली) र स्ट्रेप्टोमाइसिन (०.०५ मिलीग्राम/मिली)]; प्रोपिडियम आयोडाइडको साथ कोष व्यवहार्यता मूल्याङ्कन गर्नुहोस् र कोष घनत्व १×१०६ देखि २×१०६ कोषहरू/मिलीमा समायोजन गर्नुहोस्। फ्लो साइटोमेट्री अघि, निलम्बनलाई ५० μm सेल स्ट्रेनर मार्फत फिल्टर गरिएको थियो।
फ्लो साइटोमिटर। FACSAria III मेसिन (BD बायोसाइन्सेस) र FACSDiva सफ्टवेयर (BD बायोसाइन्सेस, संस्करण 8.0.1) प्रयोग गरेर 4°C मा सेल क्रमबद्ध गरिएको थियो। सेल निलम्बन ~2800 घटनाहरू/सेकेन्डको दरमा 20 psi को दबाबमा 100 μm नोजल प्रयोग गरेर क्रमबद्ध गरिएको थियो। परम्परागत गेटिङ मापदण्ड (कोशिका आकार, द्विमोडल भेदभाव, र स्क्याटरिङ विशेषताहरू) ले अन्य कोशिका प्रकारहरूबाट PN को सही अलगाव सुनिश्चित गर्न नसक्ने भएकोले, गेटिङ रणनीति mitoYFP+ ​​र नियन्त्रण mitoYFP − मुसामा YFP तीव्रता र अटोफ्लोरेसेन्सको प्रत्यक्ष तुलनाको आधारमा सेट गरिएको छ। YFP 488 nm लेजर लाइनको साथ नमूनालाई विकिरण गरेर उत्तेजित हुन्छ, र 530/30 nm ब्यान्ड पास फिल्टर प्रयोग गरेर संकेत पत्ता लगाइन्छ। mitoYFP+ ​​मुसामा, Rosa26-mitoYFP रिपोर्टर जीनको सापेक्ष शक्ति पनि न्यूरोनल बडी र एक्सन टुक्राहरू छुट्याउन प्रयोग गरिन्छ। ७-एएडी ५६१ एनएम पहेंलो लेजरको साथ उत्साहित छ र मृत कोशिकाहरू बहिष्कार गर्न ६७५/२० एनएम ब्यान्डपास फिल्टरको साथ पत्ता लगाइएको छ। एकै समयमा एस्ट्रोसाइटहरू अलग गर्न, सेल सस्पेन्सनलाई ACSA-2-APC ले दाग लगाइएको थियो, त्यसपछि नमूनालाई ६४० एनएम लेजर लाइनको साथ विकिरण गरिएको थियो, र संकेत पत्ता लगाउन ६६०/२० एनएम ब्यान्डपास फिल्टर प्रयोग गरिएको थियो।
सङ्कलन गरिएका कोषहरूलाई सेन्ट्रीफ्यूगेसन (१११० आरपीएम, ५ मिनेट, ४°C) द्वारा पेलेट गरिएको थियो र प्रयोग नभएसम्म -८०°C मा भण्डारण गरिएको थियो। प्रक्रियागत परिवर्तनशीलता कम गर्न Mfn2cKO मुसा र तिनीहरूका फोहोरका कुकुरहरूलाई एकै दिन वर्गीकृत गरिन्छ। FACS डेटा प्रस्तुतीकरण र विश्लेषण फ्लोजो सफ्टवेयर (फ्लोजो एलएलसी, एशल्याण्ड, ओरेगन, संयुक्त राज्य अमेरिका) प्रयोग गरेर गरिएको थियो।
माथि उल्लेख गरिएझैं (५९), पछिल्ला mtDNA परिमाणीकरणको लागि क्रमबद्ध न्यूरोनहरूबाट DNA अलग गर्न वास्तविक-समय PCR प्रयोग गरिन्छ। विभिन्न संख्याका कोषहरूमा qPCR चलाएर सुरुमा रेखीयता र थ्रेसहोल्ड संवेदनशीलता परीक्षण गरिएको थियो। छोटकरीमा, ५० mM tris-HCl (pH ८.५), १ mM EDTA, ०.५% Tween २० र proteinase K (२०० ng/ml) मिलेर बनेको lysis बफरमा ३०० PN सङ्कलन गर्नुहोस् र ५५°C १२० मिनेटमा इन्क्युबेट गर्नुहोस्। प्रोटीनेज K को पूर्ण निष्क्रियता सुनिश्चित गर्न कोषहरूलाई १० मिनेटको लागि ९५°C मा थप इन्क्युबेट गरिएको थियो। mt-Nd1 को लागि विशिष्ट TaqMan प्रोब (थर्मो फिशर) प्रयोग गरेर, mtDNA लाई ७९००HT रियल-टाइम PCR प्रणाली (थर्मो फिशर साइन्टिफिक) मा अर्ध-मात्रात्मक PCR द्वारा मापन गरिएको थियो। विज्ञान, क्याटलग नम्बर Mm04225274_s1), mt-Nd6 (थर्मो फिशर साइन्टिफिक, क्याटलग नम्बर AIVI3E8) र 18S (थर्मो फिशर साइन्टिफिक, क्याटलग नम्बर Hs99999901_s1) जीनहरू।
प्रोटियोम नमूना तयारी। घोललाई ९५°C मा १० मिनेटको लागि तताएर र सोनिकेट गरेर, लिसिस बफरमा [६ M guanidine क्लोराइड, १० mM tris(२-carboxyethyl) phosphine हाइड्रोक्लोराइड, १० mM chloroacetamide र १०० mM tris- HCl मा Lyse जमेको न्यूरोन पेलेटहरू]। १० मिनेटको लागि Bioruptor (Diagenode) मा (३० सेकेन्ड पल्स / ३० सेकेन्ड पज अवधि)। नमूनालाई २० mM tris-HCl (pH ८.०) मा १:१० मा पातलो पारिएको थियो, ३०० ng trypsin सुन (Promega) सँग मिसाइएको थियो, र पूर्ण पाचन प्राप्त गर्न ३७°C मा रातभर इन्क्युबेट गरिएको थियो। दोस्रो दिन, नमूनालाई २० मिनेटको लागि २०,००० ग्राममा सेन्ट्रीफ्यूज गरिएको थियो। सुपरनेटेन्टलाई ०.१% फर्मिक एसिडले पातलो पारिएको थियो, र घोललाई स्व-निर्मित StageTips ले डिसल्ट गरिएको थियो। नमूनालाई स्पीडभ्याक उपकरण (एपेन्डोर्फ कन्सेन्ट्रेटर प्लस ५३०५) मा ४५ डिग्री सेल्सियसमा सुकाइएको थियो, र त्यसपछि पेप्टाइडलाई ०.१% फर्मिक एसिडमा निलम्बन गरिएको थियो। सबै नमूनाहरू एउटै व्यक्तिद्वारा एकैसाथ तयार पारिएको थियो। एस्ट्रोसाइट नमूनाहरूको विश्लेषण गर्न, ४ μg डिसाल्टेड पेप्टाइडहरूलाई ट्यान्डम मास ट्याग (TMT10plex, क्याटलग नम्बर ९०११०, थर्मो फिशर साइन्टिफिक) लेबल गरिएको थियो जसको पेप्टाइडदेखि TMT अभिकर्मक अनुपात १:२० थियो। TMT लेबलिङको लागि, ७० μl निर्जल ACN मा ०.८ मिलीग्राम TMT अभिकर्मक पुन: निलम्बन गरिएको थियो, र सुकेको पेप्टाइडलाई ०.१ M TEAB (triethylammonium bicarbonate) को ९ μl मा पुनर्गठन गरिएको थियो, जसमा ACN मा ७ μl TMT अभिकर्मक थपिएको थियो। सांद्रता ४३.७५% थियो। ६० मिनेटको इन्क्युबेशन पछि, ५% हाइड्रोक्सिलामाइनको २ μl ले प्रतिक्रियालाई शान्त पारिएको थियो। लेबल गरिएका पेप्टाइडहरू सङ्कलन गरियो, सुकाइयो, ०.१% फर्मिक एसिड (FA) को २००μl मा पुन: निलम्बन गरियो, दुई भागमा विभाजन गरियो, र त्यसपछि स्व-निर्मित स्टेजटिप्स प्रयोग गरेर डिसल्ट गरियो। UltiMate 3000 अल्ट्रा हाई पर्फर्मेन्स लिक्विड क्रोमेटोग्राफ (UltiMate 3000 अल्ट्रा हाई पर्फर्मेन्स लिक्विड क्रोमेटोग्राफ) प्रयोग गरेर, दुई भागहरू मध्ये एकलाई १३०Å१.७μm C१८ कणहरूले भरिएको १mm x १५०mm एक्विटी क्रोमेटोग्राफिक स्तम्भमा विभाजन गरियो (वाटर, क्याटलग नम्बर SKU: १८६००६९३५)। थर्मो फिशर साइन्टिफिक)। ३०μl/मिनेटको प्रवाह दरमा पेप्टाइडहरू अलग गर्नुहोस्, १% देखि ५०% बफर B बाट ८५ मिनेटको लागि ९६ मिनेटको चरणबद्ध ग्रेडियन्टको साथ अलग गर्नुहोस्, ५०% देखि ९५% बफर B बाट ३ मिनेटको लागि, त्यसपछि ९५% बफर B को लागि ८ मिनेट; बफर A ५% ACN र १० mM अमोनियम बाइकार्बोनेट (ABC) हो, र बफर B ८०% ACN र १० mM ABC हो। प्रत्येक ३ मिनेटमा अंशहरू सङ्कलन गर्नुहोस् र तिनीहरूलाई दुई समूहहरूमा (१ + १७, २ + १८, आदि) मिलाउनुहोस् र भ्याकुम सेन्ट्रीफ्यूजमा सुकाउनुहोस्।
LC-MS/MS विश्लेषण। मास स्पेक्ट्रोमेट्रीको लागि, पेप्टाइडहरू (नम्बर r119.aq) लाई २५ सेमी, ७५ μm भित्री व्यासको PicoFrit विश्लेषणात्मक स्तम्भ (नयाँ वस्तुगत लेन्स, भाग नम्बर PF7508250) मा छुट्याइएको थियो जसमा १.९ μm ReproSil-Pur १२० C१८-AQ माध्यम (डा. माइस, म्याट), Use EASY-nLC १२०० (थर्मो फिशर साइन्टिफिक, जर्मनी) ले सुसज्जित थियो। स्तम्भलाई ५०°C मा राखिएको थियो। बफर A र B क्रमशः पानीमा ०.१% फर्मिक एसिड र ८०% ACN मा ०.१% फर्मिक एसिड हुन्। पेप्टाइडहरूलाई ६% देखि ३१% बफर B बाट ६५ मिनेटको लागि र ३१% देखि ५०% बफर B बाट ५ मिनेटको लागि २०० nl/मिनेटको ग्रेडियन्टको साथ अलग गरिएको थियो। एल्युटेड पेप्टाइडहरूको विश्लेषण अर्बिट्राप फ्युजन मास स्पेक्ट्रोमिटर (थर्मो फिशर साइन्टिफिक) मा गरिएको थियो। पेप्टाइड प्रिकर्सर m/z मापन ३५० देखि १५०० m/z को दायरामा १२०,००० को रिजोलुसनको साथ गरिन्छ। २७% सामान्यीकृत टक्कर ऊर्जा प्रयोग गरेर, २ देखि ६ को चार्ज अवस्था भएको सबैभन्दा बलियो प्रिकर्सर उच्च ऊर्जा C ट्र्याप डिसोसिएशन (HCD) क्लीभेजको लागि चयन गरिन्छ। चक्र समय १ सेकेन्डमा सेट गरिएको छ। पेप्टाइड खण्डको m/z मान ५×१०४ को सबैभन्दा सानो AGC लक्ष्य र ८६ ms को अधिकतम इंजेक्शन समय प्रयोग गरेर आयन ट्र्यापमा मापन गरिएको थियो। खण्डीकरण पछि, अग्रिकरलाई ४५ सेकेन्डको लागि गतिशील बहिष्करण सूचीमा राखिएको थियो। TMT-लेबल गरिएका पेप्टाइडहरूलाई ५० सेमी, ७५ μm अक्लेम पेपम्याप स्तम्भ (थर्मो फिशर साइन्टिफिक, क्याटलग नम्बर १६४९४२) मा छुट्याइएको थियो, र माइग्रेसन स्पेक्ट्रालाई उच्च-क्षेत्र असममित तरंगरूप आयनहरू (FAIMS) उपकरण (थर्मो फिशर साइन्टिफिक) ले सुसज्जित Orbitrap Lumos Tribrid मास स्पेक्ट्रोमिटर (थर्मो फिशर साइन्टिफिक) मा विश्लेषण गरिएको थियो। −५० र −७० V को दुई क्षतिपूर्ति भोल्टेजहरूमा सञ्चालन हुन्छ। TMT रिपोर्ट आयन सिग्नल मापनको लागि सिंक्रोनाइजेसन पूर्ववर्तीको आधारमा चयन गरिएको MS3 प्रयोग गरिन्छ। पेप्टाइड पृथकीकरण EASY-nLC १२०० मा गरिएको थियो, ९०% रेखीय ग्रेडियन्ट एल्युसन प्रयोग गरेर, ६% देखि ३१% को बफर सांद्रताका साथ; बफर A ०.१% FA थियो, र बफर B ०.१% FA र ८०% ACN थियो। विश्लेषणात्मक स्तम्भ ५०°C मा सञ्चालन गरिन्छ। FAIMS क्षतिपूर्ति भोल्टेज अनुसार मूल फाइल विभाजित गर्न फ्रीस्टाइल (संस्करण १.६, थर्मो फिशर साइन्टिफिक) प्रयोग गर्नुहोस्।
प्रोटिन पहिचान र परिमाणीकरण। एकीकृत एन्ड्रोमेडा खोज इन्जिन प्रयोग गरेर, मूल डेटालाई MaxQuant संस्करण १.५.२.८ (https://maxquant.org/) प्रयोग गरेर विश्लेषण गरिएको थियो। Aequorea victoria बाट प्राप्त Cre recombinase र YFP अनुक्रमहरूको अतिरिक्त, पेप्टाइड फ्र्यागमेन्ट स्पेक्ट्रामा माउस सन्दर्भ प्रोटियोमको क्यानोनिकल अनुक्रम र आइसोफर्म अनुक्रमको लागि खोजी गरिएको थियो (प्रोटियोम ID UP000000589, मे २०१७ मा UniProt बाट डाउनलोड गरिएको)। मेथियोनाइन अक्सिडेशन र प्रोटिन N-टर्मिनल एसिटिलेसनलाई चर परिमार्जनको रूपमा सेट गरिएको थियो; सिस्टिन कार्बामोइल मेथिलेसनलाई निश्चित परिमार्जनको रूपमा सेट गरिएको थियो। पाचन प्यारामिटरहरू "विशिष्टता" र "ट्रिप्सिन/P" मा सेट गरिएका छन्। प्रोटिन पहिचानको लागि प्रयोग हुने पेप्टाइडहरू र रेजर पेप्टाइडहरूको न्यूनतम संख्या १ हो; अद्वितीय पेप्टाइडहरूको न्यूनतम संख्या ० हो। पेप्टाइड नक्सा मिलानको अवस्थाहरूमा, प्रोटिन पहिचान दर ०.०१ थियो। "दोस्रो पेप्टाइड" विकल्प सक्षम पारिएको छ। विभिन्न मूल फाइलहरू बीच सफल पहिचान स्थानान्तरण गर्न "रनहरू बीच मिलान" विकल्प प्रयोग गर्नुहोस्। लेबल-मुक्त परिमाणीकरण (LFQ) (60) को लागि LFQ न्यूनतम अनुपात गणना 1 प्रयोग गर्नुहोस्। LFQ तीव्रता प्रत्येक समय बिन्दुमा कम्तिमा एक जीनोटाइप समूहमा कम्तिमा दुई मान्य मानहरूको लागि फिल्टर गरिएको छ, र चौडाइको साथ सामान्य वितरणबाट एक्स्ट्रापोलेट गरिएको छ। 0.3 र तल सार्नुहोस्। LFQ परिणामहरूको विश्लेषण गर्न Perseus कम्प्युटिङ प्लेटफर्म (https://maxquant.net/perseus/) र R (https://r-project.org/) प्रयोग गर्नुहोस्। लिम्मा सफ्टवेयर प्याकेजबाट दुई-तर्फी मध्यम t परीक्षण विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषणको लागि प्रयोग गरिएको थियो (61)। अन्वेषणात्मक डेटा विश्लेषण ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally र phetmap प्रयोग गरेर गरिन्छ। TMT-आधारित प्रोटियोमिक्स डेटा MaxQuant संस्करण 1.6.10.43 प्रयोग गरेर विश्लेषण गरिएको थियो। सेप्टेम्बर २०१८ मा डाउनलोड गरिएको UniProt को मानव प्रोटियोमिक्स डाटाबेसबाट कच्चा प्रोटियोमिक्स डेटा खोज्नुहोस्। विश्लेषणमा निर्माताद्वारा प्रदान गरिएको आइसोटोप शुद्धता सुधार कारक समावेश छ। भिन्न अभिव्यक्ति विश्लेषणको लागि R मा लिम्मा प्रयोग गर्नुहोस्। मूल डेटा, डेटाबेस खोज परिणामहरू, र डेटा विश्लेषण कार्यप्रवाह र परिणामहरू सबै डेटा सेट पहिचानकर्ता PXD019690 सँग PRIDE साझेदार भण्डार मार्फत ProteomeXchange गठबन्धनमा भण्डारण गरिएका छन्।
कार्यात्मक एनोटेसनहरूले विश्लेषणलाई समृद्ध बनाउँछन्। ८ हप्तामा डेटा सेटको कार्यात्मक एनोटेसन सर्तहरूको समृद्धि निर्धारण गर्न इन्जेन्युटी पाथवे विश्लेषण (QIAGEN) उपकरण प्रयोग गरिएको थियो (चित्र १)। छोटकरीमा, LC-MS/MS (ट्यान्डम मास स्पेक्ट्रोमेट्री) डेटा विश्लेषणबाट प्राप्त मात्रात्मक प्रोटीन सूची निम्न फिल्टर मापदण्डहरूसँग प्रयोग गरिन्छ: Mus musculus प्रजाति र पृष्ठभूमिको रूपमा चयन गरिएको छ, र श्रेणीले ०.०५ वा कम संवर्धनको लागि बेन्जामिनीद्वारा समायोजित P मानलाई महत्त्वपूर्ण मानिन्छ। यस ग्राफको लागि, समायोजित P मानमा आधारित प्रत्येक क्लस्टरमा शीर्ष पाँच अतिरिक्त कोटीहरू देखाइएका छन्। बहु t-परीक्षण प्रयोग गरेर, बेन्जामिनी, क्रिगर, र येकुटिएलीको दुई-चरण रेखीय बूस्ट कार्यक्रम (Q = 5%) प्रयोग गरेर, प्रत्येक श्रेणीमा पहिचान गरिएका महत्त्वपूर्ण उम्मेदवारहरूमा समय-पाठ्यक्रम प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण गरिन्छ, र प्रत्येक पङ्क्तिलाई छुट्टाछुट्टै विश्लेषण गरिन्छ। एकरूप SD अपनाउन आवश्यक छैन।
यस अध्ययनको नतिजालाई प्रकाशित डाटाबेसहरूसँग तुलना गर्न र चित्र १ मा भेन रेखाचित्र उत्पन्न गर्न, हामीले मात्रात्मक प्रोटीन सूचीलाई MitoCarta 2.0 एनोटेसनहरू (24) सँग संयोजन गर्यौं। रेखाचित्र उत्पन्न गर्न अनलाइन उपकरण ड्र भेन रेखाचित्र (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) प्रयोग गर्नुहोस्।
प्रोटियोमिक्स विश्लेषणको लागि प्रयोग गरिने सांख्यिकीय प्रक्रियाहरूको बारेमा विस्तृत जानकारीको लागि, कृपया सामग्री र विधिहरूको सम्बन्धित खण्ड हेर्नुहोस्। अन्य सबै प्रयोगहरूको लागि, विस्तृत जानकारी सम्बन्धित किंवदन्तीमा फेला पार्न सकिन्छ। अन्यथा निर्दिष्ट नगरिएसम्म, सबै डेटा औसत ± SEM को रूपमा व्यक्त गरिन्छ, र सबै सांख्यिकीय विश्लेषणहरू ग्राफप्याड प्रिज्म 8.1.2 सफ्टवेयर प्रयोग गरेर गरिएको थियो।
यस लेखको लागि पूरक सामग्रीहरूको लागि, कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 हेर्नुहोस्।
यो क्रिएटिभ कमन्स एट्रिब्युसन-गैर-वाणिज्यिक इजाजतपत्रको सर्तहरू अन्तर्गत वितरित खुला पहुँच लेख हो, जसले कुनै पनि माध्यममा प्रयोग, वितरण र पुनरुत्पादनलाई अनुमति दिन्छ, जबसम्म अन्तिम प्रयोग व्यावसायिक लाभको लागि होइन र आधार यो हो कि मूल काम सही छ। सन्दर्भ।
नोट: हामी तपाईंलाई आफ्नो इमेल ठेगाना प्रदान गर्न अनुरोध गर्छौं ताकि तपाईंले पृष्ठमा सिफारिस गर्नुभएको व्यक्तिलाई थाहा होस् कि तपाईं उनीहरूले इमेल देखून् र यो स्प्याम होइन। हामी कुनै पनि इमेल ठेगानाहरू कैद गर्ने छैनौं।
यो प्रश्न तपाईं आगन्तुक हुनुहुन्छ कि हुनुहुन्न भनेर परीक्षण गर्न र स्वचालित स्पाम सबमिशन रोक्न प्रयोग गरिन्छ।
E. Motori द्वारा, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G। लार्सन
निष्क्रिय न्यूरोन्सको प्रोटियोमिक्स विश्लेषणले पत्ता लगायो कि मेटाबोलिक कार्यक्रमहरू न्यूरोडिजेनेरेसनको प्रतिरोध गर्न सक्रिय हुन्छन्।
E. Motori द्वारा, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G। लार्सन
निष्क्रिय न्यूरोन्सको प्रोटियोमिक्स विश्लेषणले पत्ता लगायो कि मेटाबोलिक कार्यक्रमहरू न्यूरोडिजेनेरेसनको प्रतिरोध गर्न सक्रिय हुन्छन्।
© २०२० अमेरिकन एसोसिएशन फर द एडभान्समेन्ट अफ साइन्स। सबै अधिकार सुरक्षित। AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef र COUNTER को साझेदार हो। ScienceAdvances ISSN 2375-2548।