हाल†हालको ठेगाना: OX11 0DE, UK, डायमण्ड बिल्डिंग, हार्वेल साइन्स एण्ड इनोभेसन पार्क, डाइटकोट, अक्सफोर्डशायर, UK, डायमण्ड लाइट सोर्स कं, लिमिटेड, इलेक्ट्रोनिक बायोलोजिकल इमेजिङ सेन्टर।
प्रतिक्रिया केन्द्र प्रकाश-हार्वेस्टिङ कम्प्लेक्स १ (RC-LH1) बैजनी फोटोट्रोफिक ब्याक्टेरियाको मुख्य प्रकाशसंश्लेषण घटक हो। हामीले रोडोप्सुडोमोनास पालुस्ट्रिसबाट RC-LH1 कम्प्लेक्सको दुई क्रायो-इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोपी संरचनाहरू प्रस्तुत गर्यौं। RC-LH114-W कम्प्लेक्सको २.६५-Å रिजोल्युसन संरचनामा RC वरपर १४ सबयूनिट LH1 लूपहरू हुन्छन्, जुन प्रोटीन W द्वारा अवरोधित हुन्छ, जबकि प्रोटीन-W बिनाको कम्प्लेक्स पूर्ण रूपमा RC ले घेरिएको RC संरचना हो। बन्द १६ सबयूनिट LH1 लूप। यी संरचनाहरूको तुलनाले RC-LH1 कम्प्लेक्समा क्विनोनको गतिशीलतामा अन्तर्दृष्टि प्रदान गर्दछ, जसमा RC QB साइटमा क्विनोन बाइन्ड गर्दा पहिले अनिश्चित कन्फर्मेसनल परिवर्तनहरू, साथै सहायक क्विनोन बाइन्डिङ साइटहरूको स्थान समावेश छ, जसले तिनीहरूलाई RC मा पास गर्न मद्दत गर्दछ। W प्रोटीनको अद्वितीय संरचनाले LH1 लूप बन्द हुनबाट रोक्छ, जसले गर्दा क्विनोन/क्विनोलोन एक्सचेन्जलाई गति दिनको लागि एक च्यानल सिर्जना गर्दछ।
प्रकाश संश्लेषणद्वारा प्रदान गरिएको ऊर्जाले पृथ्वीमा लगभग सबै जीवनलाई धान्न सक्छ, र यसमा सौर्य जैव प्रविधिको लागि ठूलो सम्भावना छ। विश्वव्यापी प्रकाश संश्लेषणलाई प्रवर्द्धन गर्दा, बैजनी फोटोट्रोफिक ब्याक्टेरियाले विभिन्न ऊर्जा मोडहरू र चयापचय क्षमताहरू पनि प्रदर्शन गर्दछ। तिनीहरू प्रकाश संश्लेषणबाट बच्न सक्छन् र अँध्यारोमा हेटेरोट्रोफिक ब्याक्टेरियाको रूपमा बढ्न सक्छन्, नाइट्रोजन र कार्बन डाइअक्साइडलाई ठीक गर्न सक्छन्, हाइड्रोजन उत्पादन गर्न सक्छन्, र सुगन्धित यौगिकहरूलाई घटाउन सक्छन् (१-३)। यी प्रक्रियाहरूको लागि ऊर्जा प्रदान गर्न, प्रकाशलाई छिटो र कुशलतापूर्वक रासायनिक ऊर्जामा रूपान्तरण गर्नुपर्छ। यो प्रक्रिया तब सुरु हुन्छ जब प्रकाश-ट्र्यापिङ एन्टेना कम्प्लेक्सले प्रकाश अवशोषित गर्छ र फँसिएको ऊर्जालाई प्रतिक्रिया केन्द्र (RC) मा स्थानान्तरण गर्छ, जसले गर्दा चार्ज विभाजन सुरु हुन्छ (४-७)। बैजनी फोटोट्रोफिक ब्याक्टेरियामा प्रकाश संश्लेषणको आधारभूत एकाइ टाइप २ RC बाट बनेको हुन्छ, जुन प्रकाश-हार्वेस्टिङ कम्प्लेक्स १ (LH1) ले घेरिएको हुन्छ, जसले RC-LH1 कोर कम्प्लेक्स बनाउँछ। LH1 घुमाउरो αβ हेटेरोडाइमरहरूको एरेद्वारा बनाइएको हुन्छ, जसमध्ये प्रत्येकले दुई ब्याक्टेरिया क्लोरोफिल (BChl) अणुहरू र एक वा दुई क्यारोटिनोइडहरू (८-१२) लाई बाँध्छ। सबैभन्दा सरल LH1 एन्टेनामा १६ वा १७ αβ हेटेरोडाइमरहरू हुन्छन् जसले RC (९-१३) लाई बन्द लूपमा घेर्छन्, तर अन्य कोर कम्प्लेक्सहरूमा, ट्रान्समेम्ब्रेन पेप्टाइडहरूले वरपरको LH1 को निरन्तरतामा बाधा पुर्‍याउँछन्, जसले गर्दा RC र साइटोक्रोम bc1 कम्प्लेक्स (११, १३-१५) बीचको क्विनोल/क्विनोन प्रसारलाई बढावा दिन्छ। बैजनी फोटोट्रोफिक बिरुवा रोडोप्सुडोमोनास (Rps.) एक मोडेल जीव हो जसले प्रकाश संश्लेषणलाई समर्थन गर्ने ऊर्जा र इलेक्ट्रोन स्थानान्तरण बुझ्न सक्छ। Rps को पहिलो क्रिस्टल संरचना। पालुस्ट्रिस RC-LH1 कम्प्लेक्सको मोडेल RC हो, जुन १५ हेटेरोडाइमेरिक LH1 लूपहरूले घेरिएको छ, जुन "प्रोटीन W" (१४) भनिने अज्ञात प्रोटीनद्वारा अवरोधित हुन्छ। प्रोटीन-W पछि RPA4402 को रूपमा पहिचान गरियो, जुन तीन पूर्वानुमानित ट्रान्समेम्ब्रेन हेलिसहरू (TMH) (१६) भएको एक अनचेराइज्ड १०.५kDa प्रोटीन हो। हामी RC-L, M (pufL, pufM) र LH1α, β (pufA, pufB) उपयुनिटहरू एन्कोड गर्ने जीनहरूको लागि प्रयोग गरिएको नामकरणसँग मिल्दोजुल्दो हुन rpa4402 जीन एन्कोडिङ प्रोटीन W लाई pufW मा पुन: नामाकरण गर्ने प्रस्ताव गर्छौं। रोचक कुरा के छ भने, प्रोटीन-W RC-LH1 को लगभग १०% मा मात्र उपस्थित छ, जसले Rps लाई प्रकट गर्दछ। palustris ले दुई फरक RC-LH1 कम्प्लेक्सहरू उत्पादन गर्दछ। यहाँ, हामी दुई कोर कम्प्लेक्सहरूको उच्च-रिजोल्युसन क्रायो-EM (क्रायो-EM) संरचनाहरू रिपोर्ट गर्छौं, एउटा प्रोटीन W र १४ αβ हेटेरोडाइमरहरू सहित, अर्को प्रोटीन W बिना र बन्द १६ हेटेरोडाइमर LH1 लूप। हाम्रो संरचनाले Rps. palustris को RC-LH1 कम्प्लेक्सको बुझाइमा एक चरण परिवर्तनलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ, किनकि हामीले प्रत्येक भेरियन्टको समरूप जनसंख्याको विश्लेषण गरेका छौं र प्रत्येक पेप्टाइड र बाउन्ड पिग्मेन्टहरू र सम्बन्धित लिपिडहरू र क्विनोनहरू स्पष्ट रूपमा तोक्न पर्याप्त रिजोल्युसन छ। यी संरचनाहरूको तुलनाले देखाउँछ कि अहिलेसम्म कुनै पनि अन्य RC-LH1 कम्प्लेक्समा नभेटिएका तीन TMH प्रोटीन-W ले क्विनोन/क्विनोलोन आदानप्रदानलाई गति दिन क्विनोन च्यानल उत्पन्न गर्छन्। धेरै संरक्षित लिपिड र क्विनोन बाइन्डिङ साइटहरू पहिचान गरिएका छन्, र हामीले क्विनोन र RC को संयोजन पछि नयाँ कन्फर्मेसनल परिवर्तन प्रकट गरेका छौं, जुन अक्सिजनयुक्त फोटोट्रोफिक जीवहरूको फोटोसिस्टम II (PSII) RC को लागि उपयुक्त हुन सक्छ। हाम्रो खोजहरूले बैजनी फोटोट्रोफिक ब्याक्टेरियाको RC-LH1 कोर कम्प्लेक्समा क्विनोन/क्विनोलोन बाइन्डिङ र आदानप्रदानको गतिविज्ञानमा नयाँ अन्तर्दृष्टि प्रदान गर्दछ।
Rps. palustris मा पाइने दुई जटिलहरूको विस्तृत अध्ययनलाई सहज बनाउन, हामी प्रत्येक RC-LH1 लाई जैव रासायनिक विधिहरूद्वारा अलग गर्छौं। प्रोटीन W-कमी जटिल (यसपछि ΔpufW भनेर चिनिन्छ) pufW जीन (16) नभएको स्ट्रेनबाट शुद्ध गरिएको थियो, र केवल एउटा RC-LH1 जटिल उत्पादन गर्न सकिन्छ। प्रोटीन W-युक्त जटिल एक स्ट्रेन द्वारा उत्पादन गरिन्छ। यस स्ट्रेनको प्रोटीन W लाई यसको C-टर्मिनसमा 10x His ट्यागको साथ परिमार्जन गरिएको छ, ताकि प्रोटीन W-युक्त जटिललाई धातुलाई स्थिर बनाएर धेरैजसो अभाव भएको प्रोटीन W सँग प्रभावकारी रूपमा जोड्न सकिन्छ। जटिललाई प्रभावकारी रूपमा अलग गरिएको छ (16) एफिनिटी क्रोमेटोग्राफी (IMAC)।
चित्र १ मा देखाइए अनुसार, दुबै कम्प्लेक्सहरूमा LH1 एन्टेनाले घेरिएको तीन उप-इकाई RC (RC-L, RC-M र RC-H) समावेश छ। प्रोटीन-W नभएको कम्प्लेक्सको 2.80-A संरचनाले 16 αβ हेटेरोडाइमरहरू देखाउँछ, जसले RC लाई पूर्ण रूपमा घेरेर बन्द LH1 लूप बनाउँछ, जसलाई यसपछि RC-LH116 कम्प्लेक्स भनिन्छ। प्रोटीन-W-युक्त कम्प्लेक्सको 2.65Å संरचनामा प्रोटीन-W द्वारा अवरोधित 14-हेटेरोडाइमर LH1 छ, जसलाई यसपछि RC-LH114-W भनिन्छ।
(A र B) यौगिकको सतह प्रतिनिधित्व। (C र D) रडहरूमा व्यक्त गरिएको बन्धित पिग्मेन्टहरू। (E र F) साइटोप्लाज्मिक सतहबाट अवलोकन गरिएका कम्प्लेक्सहरूमा कार्टुनहरूमा प्रतिनिधित्व गरिएका पेप्टाइडहरू र LH1 सबयुनिटहरू छन्, र प्रोटीन-W अन्तरालबाट घडीको दिशामा अंकित छन् [Rba संख्यासँग सुसंगत। स्फेरोइड्स जटिल (१३)]। LH1-α को लागि, प्रोटीन सबयुनिटको रंग पहेंलो छ; LH1-β को लागि, प्रोटीन सबयुनिटको रंग नीलो छ; प्रोटीन-W को लागि, प्रोटीन रातो छ; RC-H को लागि, यो सियान छ; RC-L को लागि, यो सुन्तला छ; RC-M को लागि, म्याजेन्टा। सहकारकहरू रडहरू द्वारा प्रतिनिधित्व गरिन्छ, हरियोले BChl र BPh a अणुहरू, बैजनीले क्यारोटिनोइडहरू, र पहेंलोले UQ10 अणुहरू प्रतिनिधित्व गर्दछ। (G र H) RC-LH114-W जटिल (G) र RC-LH116 जटिल (H) को समतुल्य क्षेत्रमा प्रोटीन-W अन्तरालको म्याग्निफाइड दृश्य। सहकारकहरू स्पेस फिलिंगको रूपमा प्रदर्शित हुन्छन्, चिलेटेड क्विनोन नीलो रंगमा प्रदर्शित हुन्छ। प्रोटीन-W अन्तराल (G) मा नीलो ड्यास गरिएको रेखाद्वारा हाइलाइट गरिएको हुन्छ, र LH116 रिंगमा क्विनोन/क्विनोलोल फैलिने साना प्वालहरू (H) मा कालो ड्यास गरिएको रेखाद्वारा हाइलाइट गरिएको हुन्छ।
चित्र १ (A र B) ले LH1αβ हेटेरोडाइमरहरूको खुला वा बन्द एरेहरूले घेरिएको RC देखाउँछ, जसमध्ये प्रत्येकले दुई BChl र एउटा क्यारोटिनोइडलाई बाँध्छ (चित्र १, C र D)। अघिल्ला अध्ययनहरूले देखाएका छन् कि Rps LH1 जटिल हो। स्पाइरुलिना जान्थिनको बायोसिन्थेटिक मार्गमा, यी प्रजातिहरूमा क्यारोटिनोइडहरूको मिश्रित जनसंख्या हुन्छ (१७)। यद्यपि, स्पाइरोपाइरोक्सान्थिन प्रमुख क्यारोटिनोइड हो र यसको घनत्व सन्तोषजनक छ। त्यसकारण, हामीले सबै LH1 बाइन्डिङ साइटहरूमा स्पाइरोक्सान्थिन मोडेल गर्ने छनौट गर्यौं। अल्फा र बीटा पोलिपेप्टाइडहरू छोटो झिल्ली बाहिरी क्षेत्रहरू भएका एकल TMH हुन् (चित्र १, A, B, E, र F)। यद्यपि C-टर्मिनसमा १७ अवशेषहरूको घनत्व अवलोकन गरिएको थिएन, अल्फा पोलिपेप्टाइड दुवै जटिलहरूमा Met1 बाट Ala46 मा विभाजित गरिएको थियो। RC-LH116 मा Gly4 बाट Tyr52 मा β पोलिपेप्टाइड घटाइएको थियो, र RC-LH114-W मा Ser5 बाट Tyr52 मा घटाइएको थियो। 3 वा 4 N-टर्मिनल वा 13 C-टर्मिनल अवशेषहरूको घनत्व अवलोकन गरिएको थिएन (चित्र S1)। जंगली-प्रकारको स्ट्रेनबाट तयार पारिएको मिश्रित RC-LH1 कम्प्लेक्सको मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषणले देखाएको छ कि हराएको क्षेत्र यी पेप्टाइडहरूको हेटेरोलोगस क्लीभेजको परिणाम हो (चित्र S1 र S2)। α-Met1 को N-टर्मिनल ढाँचा पनि अवलोकन गरिएको थियो (f)। विश्लेषणले देखाएको छ कि α-पेप्टाइडमा fMet1 देखि Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 सम्मका अवशेषहरू हुन्छन्, र β-पेप्टाइडमा Ser2 देखि Ala53 सम्मका अवशेषहरू हुन्छन्, जुन कम-तापमान EM घनत्व नक्सासँग राम्रो सम्झौतामा छ।
α-His29 र β-His36 को समन्वयले BChls लाई आमनेसामने बनाउँछ; प्रत्येक αβ हेटेरोडाइमरले आफ्ना छिमेकीहरूसँग मिलेर RC वरिपरि खुला लूप (RC-LH114-W) वा बन्द लूप (RC-LH116) बनाउँछ। एक्साइटन युग्मित पिग्मेन्ट एरे (चित्र १, C र D)। RC-LH114-W को ८७७ nm ब्यान्डको तुलनामा, RC-LH116 को ८८० nm अवशोषण रातो शिफ्ट ३ nm (चित्र २A) हो। यद्यपि, गोलाकार डाइक्रोइज्म स्पेक्ट्रम लगभग उस्तै छ (चित्र २B), जसले खुला र बन्द लूपहरू बीच स्पष्ट भिन्नता भए पनि, BChls को स्थानीय वातावरण धेरै समान छ भन्ने संकेत गर्दछ। अवशोषण रेडशिफ्ट कम थर्मल गति र बन्द लूपमा बढेको स्थिरताको परिणाम हुन सक्छ (१८, १९), बन्द लूप (२०, २१) को कारणले हुने पिग्मेन्ट युग्मनमा परिवर्तन, वा यी दुई प्रभावहरूको संयोजन (११)।
(A) पराबैंगनी/दृश्यमान/नजिक-इन्फ्रारेड अवशोषण स्पेक्ट्रम, जसको शिखरहरू तिनीहरूको सम्बन्धित पिग्मेन्टहरूसँग चिन्ह लगाइएका छन् र 775 nm मा BPh शिखरमा सामान्यीकृत गरिएका छन्। (B) 805 nm मा BChl अवशोषणमा सामान्यीकृत गोलाकार द्विचरण स्पेक्ट्रम। (C र D) RC-LH114-W जटिल (C) र RC-LH116 जटिल (D) को समय-समाधान गरिएको अवशोषण स्पेक्ट्राबाट चयन गरिएको ΔA स्पेक्ट्रा। राम्रो तुलनाको लागि, सबै स्पेक्ट्रालाई 0.2 ps मा ∆A को ∆A मा सामान्यीकृत गरिन्छ। (E) UQ2 को विभिन्न सांद्रताको उपस्थितिमा विकिरण पछि साइटोक्रोम c2 अक्सिडेशनको दर (कच्चा डेटाको लागि चित्र S8 हेर्नुहोस्)। (F) कम, मध्यम वा उच्च तीव्रता प्रकाश (क्रमशः 10, 30 वा 300μMm-2 s-1) अन्तर्गत बढेका कोषहरूमा, प्रोटीन W र RC-L शुद्ध जटिल र अलग गरिएको झिल्ली अनुपातमा उपयुनिटहरू हुन्छन्। SDS-polyacrylamide जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस र इम्युनोएसे द्वारा प्रोटीन स्तर निर्धारण गर्नुहोस् (कच्चा डेटाको लागि चित्र S9 हेर्नुहोस्)। शुद्ध RC-LH114-W कम्प्लेक्सको सापेक्ष अनुपात निर्धारण गर्नुहोस्। कम्प्लेक्सको प्रोटीन-W मा RC-L को स्टोइचियोमेट्रिक अनुपात १:१ छ।
RC-LH114-W (चित्र १, A, C, र E) को विकृत αβ14 लूपमा स्थिति १ मा रहेका BChl हरू RC-LH116 (चित्र १, B, D, र F, र चित्र S3) मा बराबर BChl हरू भन्दा RC प्राथमिक दाता (P) सँग ६.८Å ले नजिक छन्; यद्यपि, दुई कम्प्लेक्सहरूको क्षणिक अवशोषण गतिविज्ञानले देखाउँछ कि RC-LH114-W र RC-LH116 को लागि, LH1 बाट RC मा उत्तेजना ऊर्जा स्थानान्तरण समय स्थिरांकहरू ४० ±४ र ४४±३ ps (चित्र २) छन्। , C र D, चित्र S4 र तालिका S2)। RC भित्र इलेक्ट्रोनिक स्थानान्तरणमा पनि कुनै महत्त्वपूर्ण भिन्नता छैन (चित्र S5 र सम्बन्धित पूरक पाठ)। हामीलाई शंका छ कि LH1 र RC-P बीच ऊर्जा स्थानान्तरण समयको नजिकको पत्राचार दुई LH1 लूपहरूमा धेरैजसो BChl को समान दूरी, कोण र सम्भावित ऊर्जाको कारणले हो। यस्तो देखिन्छ कि न्यूनतम दूरीमा पुग्न LH1 ऊर्जा ढाँचाको अन्वेषण गर्नु सबओप्टिमल साइटहरूबाट RC मा प्रत्यक्ष ऊर्जा स्थानान्तरण भन्दा छिटो छैन। RC-LH114-W मा खुला-लूप LH1 लूपले संरचनात्मक विश्लेषणको लागि कम तापक्रम अवस्थाहरूमा पनि नगण्य थर्मल गतिबाट गुज्रन सक्छ, र RC 1 को स्थितिमा βBChls को पिग्मेन्टेशन दूरीबाट कोठाको तापक्रममा लामो αβ14 रिंग कन्फर्मेसन हुन्छ।
RC-LH116 कम्प्लेक्समा ३२ BChls र १६ क्यारोटिनोइडहरू छन्, र यसको समग्र व्यवस्था थर्मोक्रोमेटियम (Tch.) पिडपिडम [प्रोटीन डाटा बैंक (PDB) ID 5Y5S] (9), थिओरहोडोभिब्रिओ (Trv.) 970 स्ट्रेन (PDB ID 7C9R) (12) र हरियो शैवाल (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) बाट प्राप्त गरिएको जस्तै छ। पङ्क्तिबद्धता पछि, αβ हेटेरोडाइमरहरूको स्थितिमा केवल सानो विचलनहरू अवलोकन गरियो, विशेष गरी १-५, १५, र १६ (चित्र S6)। प्रोटीन-W को उपस्थितिले LH1 को संरचनामा महत्त्वपूर्ण प्रभाव पार्छ। यसको तीन TMH हरू छोटो लूपहरूद्वारा जोडिएका छन्, कम्प्लेक्सको लुमेन छेउमा N-टर्मिनल र साइटोप्लाज्मिक छेउमा C-टर्मिनल (चित्र १A र ३, A देखि D)। प्रोटिन-W धेरै हदसम्म हाइड्रोफोबिक हुन्छ (चित्र ३B), र TMH2 र TMH3 ले LH1αβ-14 सँग अन्तरक्रिया गरेर ट्रान्समेम्ब्रेन सतह बनाउँछन् (चित्र ३, B र E देखि G)। इन्टरफेस मुख्यतया ट्रान्समेम्ब्रेन क्षेत्रमा Phe, Leu र Val अवशेषहरू मिलेर बनेको हुन्छ। यी अवशेषहरू हाइड्रोफोबिक एमिनो एसिड र αβ-14 पिग्मेन्टहरूले भरिएका हुन्छन्। केही ध्रुवीय अवशेषहरूले पनि अन्तरक्रियामा योगदान पुर्‍याउँछन्, जसमा जटिल गुहाको सतहमा W-Thr68 र β-Trp42 बीचको हाइड्रोजन बन्धन समावेश छ (चित्र ३, F र G)। साइटोप्लाज्मको सतहमा, Gln34 αβ-14 क्यारोटिनोइडहरूको केटो समूहसँग जोडिएको छ। थप रूपमा, n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) अणु समाधान गरिएको थियो, र यसको हाइड्रोफोबिक पुच्छर प्रोटीन-W र αβ-14 बीचको इन्टरफेसमा विस्तार गरिएको थियो, र लिपिड पुच्छर शरीरमा अवस्थित हुन सक्छ। हामीले यो पनि याद गर्यौं कि प्रोटीन W र RCH को C-टर्मिनल रिजोलुसन क्षेत्रहरू धेरै नजिक छन्, तर विशिष्ट अन्तरक्रियाहरू गठन गर्ने दायरा भित्र छैनन् (चित्र १, A र E)। यद्यपि, यी दुई प्रोटीनहरूको अनसुलझे C-टर्मिनल एमिनो एसिडहरूमा अन्तरक्रिया हुन सक्छ, जसले RC-LH114-W कम्प्लेक्सको एसेम्बलीको समयमा प्रोटीन-W को भर्तीको लागि एक संयन्त्र प्रदान गर्न सक्छ।
(A) कार्टुन रूपमा LH1αβ14 सँग इन्टरफेसको सामना गर्ने प्रोटिन-W मा रड-आकारको साइड चेन (रातो) छ, जुन इलेक्ट्रोस्टेटिक सम्भाव्य रेखाचित्रको एक भागमा प्रदर्शित हुन्छ (०.१३ को कन्टूर स्तरको साथ पारदर्शी खैरो सतह)। (B) हाइड्रोफोबिक रंगीन सतह द्वारा प्रतिनिधित्व प्रोटिन-W। ध्रुवीय र चार्ज गरिएका क्षेत्रहरू सियानमा प्रदर्शित हुन्छन्, हाइड्रोफोबिक क्षेत्रहरू सेतोमा प्रदर्शित हुन्छन्, र कडा हाइड्रोफोबिक क्षेत्रहरू सुन्तलामा प्रदर्शित हुन्छन्। (C र D) कार्टुनमा प्रतिनिधित्व प्रोटिन-W, यसको अभिमुखीकरण (A) (C) मा जस्तै छ, र १८०° (D) द्वारा घुमाइएको छ। अनुक्रममा स्थिति अनुसार, छुट्याउन सकिने अवशेषहरूले इन्द्रेणी रङ योजना अपनाउँछन्, जहाँ N-टर्मिनल नीलो हुन्छ र C-टर्मिनल रातो हुन्छ। (E) (A) मा जस्तै दृश्यमा प्रोटिन-W, र प्रोटिन-W:LH1 को इन्टरफेसमा अवशेषहरू संलग्न चिन्हहरू भएका रडहरू द्वारा प्रतिनिधित्व गरिन्छ। (F) कार्टुन प्रतिनिधित्वमा प्रोटिन-W लाई (E) र LH1αβ14 को सापेक्षमा ९०° घुमाइएको छ, र बार प्रतिनिधित्वमा इन्टरफेस अवशेषहरूको सापेक्षमा। बीटा पोलिपेप्टाइडबाट ओभरह्याङ्गिङ अवशेषहरूलाई लेबल गरिएको छ। कोफ्याक्टरलाई चित्र १ को रंगसँग मिल्ने बारको रूपमा देखाइएको छ, विघटित β-DDM खैरो रंगमा देखाइएको छ, र अक्सिजन रातो रंगमा देखाइएको छ। (G) (F) मा दृश्यलाई लेबल गरिएको अल्फा पोलिपेप्टाइडको प्रमुख अवशेषहरू सहित १८०° घुमाइएको छ।
प्रोटिन-W ले αβ हेटेरोडाइमर (चित्र १F मा १५ औं) लाई प्रतिस्थापन गर्दछ, जसले गर्दा लूप बन्द हुनबाट रोक्छ र पहिलो तीन αβ हेटेरोडाइमरहरूलाई झुकाउँछ। यो अवलोकन गरिएको थियो कि फिल्म सामान्यको सापेक्षमा पहिलो αβ-1 हेटेरोडाइमरको अधिकतम झुकाव कोण २५° देखि २९° (चित्र १, A र E) थियो, जुन RC A तीव्र कन्ट्रास्ट-LH116 (चित्र १, B र F) मा αβ-1 को २° देखि ८° झुकाव द्वारा बनाइएको थियो। दोस्रो र तेस्रो हेटेरोडाइमरहरू क्रमशः १२° देखि २२° र ५° देखि १०° मा झुकाव भएका छन्। RC को स्टेरिक अवरोधको कारण, αβ-1 को झुकावमा αβ को दोस्रो जोडी (जुन चित्र १F मा १६ औं αβ सँग मेल खान्छ) समावेश हुँदैन, यसरी LH1 रिंगमा स्पष्ट खाडल बनाउँछ (चित्र १, A र E)। दुई αβ हेटेरोडाइमरहरूको अभावका कारण, चार BChl र दुई carotenoids को क्षतिसँगै, कुनै पनि carotenoids ट्विस्टेड αβ-1 सबयुनिटमा बाँधिएन, जसको परिणामस्वरूप LH114-W रिंग हुन्छ जसमा १३ carotenoids Vegetarian र २८ BChls हुन्छन्। αβ1 देखि ७ क्षेत्रहरूमा रहेका दुई कम्प्लेक्सहरूको स्थानीय रिजोल्युसन अनुमानहरू LH1 लूपको बाँकी भागको भन्दा कम छन्, जसले RC QB साइट (चित्र ४) सँग जोडिएको LH1 सबयुनिटको अन्तर्निहित प्लास्टिसिटीलाई प्रतिबिम्बित गर्न सक्छ।
RC-LH114-W (A र B) र RC-LH116 (C र D) का तस्बिरहरू चित्र १. (B र D) को एउटै माथिल्लो दृश्य/साइड दृश्य (A र B) (A र C) र गुहा सतहबाट देखाइएका छन्। रंगीन कुञ्जीहरू दायाँतिर देखाइएका छन्।
१:१४ को स्टोइचियोमेट्रिक अनुपात भएको एक मात्र अन्य विशेषता कोर कम्प्लेक्स रोडोकोकस स्फेरोइड्स (Rba.) RC-LH1-PufX डाइमर (१३) हो। यद्यपि, प्रोटीन W र PufX को कुनै स्पष्ट समरूपता छैन, र तिनीहरूको सम्बन्धित LH1 संरचनाहरूमा महत्त्वपूर्ण प्रभाव पार्छ। PufX एकल TMH हो जसमा N-टर्मिनल साइटोप्लाज्मिक डोमेन हुन्छ जुन Rps. palustris LH116αβ-16 सँग मिल्दोजुल्दो स्थितिमा RC-H सबयूनिट (१३) को साइटोप्लाज्मिक पक्षसँग अन्तर्क्रिया गर्दछ। PufX ले RC-LH1 र साइटोक्रोम bcl कम्प्लेक्स बीच क्विनोन/क्विनोलोन एक्सचेन्जको लागि एक च्यानल सिर्जना गर्दछ र सबै Rba. sphaeroides कोर कम्प्लेक्स (१३) मा उपस्थित हुन्छ। यद्यपि मोनोमर-मोनोमर इन्टरफेस Rba मा छ। स्फेरोइड्स RC-LH1-PufX डाइमर RC-LH114-W मा प्रोटीन W को बाइन्डिङ स्थितिमा अवस्थित छ, र PufX र प्रोटीन-W द्वारा प्रेरित अन्तर बराबर स्थितिमा छ (चित्र S7A)। RC-LH114-W मा अन्तर पनि स्यूडोमोनास रोजा LH1 को काल्पनिक क्विनोन च्यानल (8) सँग पङ्क्तिबद्ध छ, जुन प्रोटीन W वा PufX (चित्र S7B) सँग सम्बन्धित नभएको पेप्टाइडहरू द्वारा बनाइएको हो। यसको अतिरिक्त, Blc मा क्विनोन च्यानल। एक γ सबयुनिट (7) लाई छोडेर बनेको पन्ना हरियो LH1 समान स्थितिमा अवस्थित छ (चित्र S7C)। यद्यपि फरक प्रोटीनहरू द्वारा मध्यस्थता गरिएको छ, RC-LH1 जटिलमा साझा स्थितिमा यी क्विनोन/क्विनोलोल च्यानलहरूको उपस्थिति अभिसरण विकासको उदाहरण जस्तो देखिन्छ, जसले संकेत गर्दछ कि प्रोटीन W द्वारा सिर्जना गरिएको अन्तरले क्विनोन च्यानलको रूपमा काम गर्न सक्छ।
LH114-W लूपमा रहेको अन्तरले RC-LH114-W कम्प्लेक्सको आन्तरिक ठाउँ र बल्क झिल्ली (चित्र 1G) बीच निरन्तर झिल्ली क्षेत्रको गठनलाई अनुमति दिन्छ, प्रोटिनमा जस्तै प्रोटिन पोर मार्फत दुई डोमेनहरू जोड्नुको सट्टा। RC-LH116 कम्प्लेक्स बन्द Tch. सुई जस्तो जटिल (22) (चित्र 1H) जस्तै छ। झिल्ली मार्फत क्विनोनको प्रसार साँघुरो प्रोटिन च्यानल मार्फत प्रसार भन्दा छिटो भएकोले, खुला LH114-W लूपले बन्द LH116 लूप भन्दा छिटो RC टर्नओभरलाई अनुमति दिन सक्छ, र RC मा क्विनोनको प्रसार बढी प्रतिबन्धित हुन सक्छ। प्रोटीन W ले RC मार्फत क्विनोनको रूपान्तरणलाई असर गर्छ कि गर्दैन भनेर परीक्षण गर्न, हामीले ubiquinone 2 (UQ2) (छोटो आइसोप्रिन पुच्छर भएको प्राकृतिक UQ10 को एनालग) (चित्र 2E) को निश्चित सांद्रतामा साइटोक्रोम अक्सिडेशन परख गर्यौं। यद्यपि चिलेटेड क्विनोनको उपस्थितिले स्पष्ट माइकलिस स्थिरांकको सही निर्धारणमा बाधा पुर्‍याउँछ (RC-LH114-W र RC-LH116 क्रमशः 0.2±0.1μM र 0.5±0.2μM को लागि उपयुक्त छन्), RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) को अधिकतम दर RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1) भन्दा २८±५% ठूलो छ।
हामीले सुरुमा अनुमान गरेका थियौं कि कोर कम्प्लेक्सको लगभग १०% मा प्रोटीन-W उपस्थित छ (१६); यहाँ, कम-प्रकाश, मध्यम-प्रकाश, र उच्च-प्रकाश वृद्धि कोषहरूको अधिभोग दर क्रमशः १५±०.६%, ११±१% र ०.९±०.५ छ (चित्र २F)। मास स्पेक्ट्रोमेट्रीको मात्रात्मक तुलनाले देखाएको छ कि हिस्टिडाइन ट्यागको थपले वाइल्ड-टाइप स्ट्रेन (P = ०.५९) को तुलनामा प्रोटीन-W को सापेक्षिक प्रशस्तता घटाएको छैन, त्यसैले यी स्तरहरू परिमार्जित प्रोटीन-W (चित्र S10) को कलाकृति होइनन्। यद्यपि, RC-LH1 कम्प्लेक्समा प्रोटीन-W को यो कम अधिभोगले केही RC हरूलाई द्रुत दरमा फ्लिप गर्न अनुमति दिन सक्छ, जसले गर्दा RC-LH116 कम्प्लेक्समा ढिलो क्विनोन/क्विनोलोन एक्सचेन्ज कम हुन्छ। हामीले देख्यौं कि उच्च प्रकाश अधिभोग दर हालैको ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स डेटासँग असंगत छ, जसले संकेत गर्दछ कि बलियो प्रकाशमा pufW जीन अभिव्यक्ति बढ्छ (चित्र S11) (23)। RC-LH1 कम्प्लेक्समा pufW ट्रान्सक्रिप्शन र प्रोटीन-W समावेश बीचको भिन्नता भ्रामक छ र प्रोटीनको जटिल नियमनलाई प्रतिबिम्बित गर्न सक्छ।
RC-LH114-W मा, ६ कार्डियोलिपिन (CDL), ७ फस्फेटिडाइलकोलिन (POPC), १ फस्फेटिडाइलग्लिसरोल (POPG) र २९ β-DDM अणुहरू आवंटित र मोडेल गरिएका छन् जसमा ६ CDLs, २४ POPCs, २ POPGs र १२ βDDMs छन्। RC-LH116 (चित्र ५, A र B)। यी दुई संरचनाहरूमा, CDL लगभग कम्प्लेक्सको साइटोप्लाज्मिक छेउमा अवस्थित छ, जबकि POPC, POPG र β-DDM प्रायः ल्युमिनल छेउमा अवस्थित छन्। RC-LH114-W कम्प्लेक्स (चित्र ५A) को αβ-1 देखि αβ-6 क्षेत्रमा दुई लिपिड र डिटर्जेन्ट अणुहरू अलग गरिएका थिए, र पाँच RC-LH116 (चित्र ५B) को बराबर क्षेत्रमा अलग गरिएका थिए। जटिलको अर्को छेउमा थप लिपिडहरू फेला परे, मुख्यतया CDL, RC र αβ-7 देखि αβ-13 (चित्र 5, A र B) बीच जम्मा भएका। अन्य संरचनात्मक रूपमा समाधान गरिएका लिपिडहरू र डिटर्जेन्टहरू LH1 रिंग बाहिर अवस्थित छन्, र राम्रोसँग समाधान गरिएका एसिल चेनहरू LH1 सबयुनिटहरू बीच फैलिएका छन्, RC-LH114-W मा अस्थायी रूपमा β-DDM को रूपमा तोकिएको छ, र RC मा β-DDM को रूपमा परिभाषित गरिएको छ। β-DDM र POPC-LH116 को मिश्रण। हाम्रो संरचनामा चेलेटिंग लिपिडहरू र डिटर्जेन्टहरूको समान स्थितिले संकेत गर्दछ कि तिनीहरू शारीरिक रूपमा सान्दर्भिक बाइन्डिङ साइटहरू हुन् (चित्र S12A)। Tch मा समतुल्य अणुहरूको स्थितिमा पनि राम्रो स्थिरता छ। कोमल र Trv। स्ट्रेन ९७० RC-LH1s (चित्र S12, B देखि E) (9, 12) र लिपिड हेड समूहको हाइड्रोजन-बन्धन अवशेषहरूले अनुक्रम पङ्क्तिबद्धता (चित्र S13) मा राम्रो संरक्षण देखाए, जसले RC (24) मा बाँधिएको संरक्षित CDL, यी साइटहरूलाई RC-LH1 जटिलमा संरक्षित गर्न सकिन्छ भन्ने संकेत गर्दछ।
(A र B) RC-LH114-W (A) र RC-LH116 (B) पेप्टाइडहरूलाई कार्टुनहरूद्वारा प्रतिनिधित्व गरिन्छ, र चित्र १ मा रंग योजना प्रयोग गरेर रडहरूद्वारा पिग्मेन्टहरूलाई प्रतिनिधित्व गरिन्छ। लिपिडहरू रातो रंगमा देखाइएका छन्, र डिटर्जेन्टहरू खैरो रंगमा देखाइएका छन्। RC QA र QB साइटहरूमा बाँधिएको UQ पहेंलो छ, जबकि पृथक UQ नीलो छ। (C र D) लिपिडहरू छोडेर (A) र (B) जस्तै दृश्यहरू। (E देखि G) RC-LH116 बाट Q1(E), Q2(F) र Q3(G) को विस्तारित दृश्य, एकअर्कालाई प्रभाव पार्ने साइड चेनहरू सहित। हाइड्रोजन बन्धनहरू कालो ड्यास गरिएका रेखाहरूको रूपमा देखाइएका छन्।
RC-LH116 मा, चार्ज पृथकीकरण प्रक्रियामा इलेक्ट्रोन स्थानान्तरणमा भाग लिने RC QA र QB UQ दुवै तिनीहरूको बाइन्डिङ साइटहरूमा विघटित हुन्छन्। यद्यपि, RC-LH114-W मा, QB क्विनोन समाधान गरिएको छैन र तल विस्तृत रूपमा छलफल गरिनेछ। QA र QB क्विनोनहरूको अतिरिक्त, दुई चेलेटेड UQ अणुहरू (RC र LH1 रिंगहरू बीच अवस्थित) RC-LH114-W संरचनामा तिनीहरूको राम्रोसँग समाधान गरिएको हेड समूहहरू (क्रमशः Q1 र Q2 मा अवस्थित) अनुसार आवंटित गरिएका छन्। ठाउँ)। चित्र 5C)। दुई आइसोप्रीन एकाइहरू Q1 मा तोकिएका छन्, र घनत्व नक्साले Q2 को पूर्ण 10 आइसोप्रीन पुच्छरहरू समाधान गर्दछ। RC-LH116 को संरचनामा, तीन चेलेटेड UQ10 अणुहरू (Q1 देखि Q3, चित्र 5D) समाधान गरिएको थियो, र सबै अणुहरूको पुच्छरभरि स्पष्ट घनत्व छ (चित्र 5, D देखि G)। दुई संरचनाहरूमा, Q1 र Q2 को क्विनोन हेड समूहहरूको स्थितिमा उत्कृष्ट स्थिरता छ (चित्र S12F), र तिनीहरूले केवल RC सँग अन्तर्क्रिया गर्छन्। Q1 RC-LH114-W (चित्र 1G र 5, C, D र E) को W अन्तर्क्रियाको प्रवेशद्वारमा अवस्थित छ, र Q2 QB बाइन्डिङ साइट (चित्र 5, C, D) र F नजिक अवस्थित छ। संरक्षित L-Trp143 र L-Trp269 अवशेषहरू Q1 र Q2 को धेरै नजिक छन् र सम्भावित π-स्ट्याकिंग अन्तर्क्रियाहरू प्रदान गर्दछन् (चित्र 5, E र F, र चित्र S12)। Q1 को डिस्टल अक्सिजनबाट L-Gln88, 3.0 Å ले बलियो हाइड्रोजन बन्धन प्रदान गर्दछ (चित्र 5E); यो अवशेष सबैभन्दा टाढाको सम्बन्ध (चित्र S13) बाहेक सबै RC मा संरक्षित छ। धेरैजसो अन्य RCs (चित्र S13) मा Thr को लागि L-Ser91 रूढिवादी रूपमा प्रतिस्थापन गरिएको छ, Q1 को मिथाइल अक्सिजनबाट 3.8 Angstroms छ, र कमजोर हाइड्रोजन बन्धनहरू प्रदान गर्न सक्छ (चित्र 5E)। Q3 मा कुनै विशेष अन्तरक्रिया भएको देखिँदैन, तर RC-M सबयुनिट र LH1-α सबयुनिट 5 देखि 6 (चित्र 5, D र G) बीचको हाइड्रोफोबिक क्षेत्रमा अवस्थित छ। Q1, Q2 र Q3 वा नजिकैको चेलेटेड क्विनोनहरू पनि Tch. Gentle, Trv. Strain 970 र Blc मा समाधान गरिएको छ। आइरिस संरचना (9, 10, 12) ले RC-LH1 जटिल (चित्र S12G) मा संरक्षित सहायक क्विनोन बाइन्डिङ साइटलाई औंल्याउँछ। RC-LH116 मा पाँचवटा विघटित UQ हरू उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी (HPLC) द्वारा निर्धारण गरिएको प्रत्येक जटिलको 5.8±0.7 सँग राम्रो सहमतिमा छन्, जबकि RC-LH114-W मा तीनवटा विघटित UQ हरू 6.2±0.3 (चित्र S14) को मापन गरिएको मान भन्दा कम छन्। संरचनामा समाधान नभएका UQ अणुहरू छन् भनी संकेत गर्दछ।
स्यूडो-सिमेट्रिक L र M पोलिपेप्टाइडहरूमा प्रत्येकमा पाँच TMH हुन्छन् र एक हेटेरोडाइमर बनाउँछ जसले एक BChl डाइमर, दुई BChl मोनोमर, दुई ब्याक्टेरियोफेज (BPh) मोनोमर, र एक गैर-हेम आइरन र एक वा दुई UQ10 अणुहरूलाई संयोजन गर्दछ। टर्मिनल केटोन समूहमा हाइड्रोजन बन्धनको उपस्थिति र Rps मा यसको ज्ञात संचय मार्फत, क्यारोटीनोइडहरू M-सबयुनिटमा समावेश हुन्छन्, जसलाई cis-3,4-dehydroorhodopin भनिन्छ। प्रजातिहरू (25)। RC-H को बाहिरी झिल्ली डोमेन एकल TMH द्वारा झिल्लीमा लंगरिएको छ। समग्र RC संरचना सम्बन्धित प्रजातिहरू (जस्तै Rba) को तीन सबयुनिट RC जस्तै छ। sphaeroides (PDB ID: 3I4D)। यी संरचनाहरूको रिजोल्युसन दायरा भित्र BChl र BPh, क्यारोटिनोइड ब्याकबोन र गैर-हेम आइरनको म्याक्रोसाइकलहरू ओभरल्याप हुन्छन्, जस्तै QA साइटमा UQ10 हेड समूह र RC-LH116 (चित्र S15) मा QB क्विनोन।
फरक QB साइट अधिभोग दरहरू भएका दुई RC संरचनाहरूको उपलब्धताले QB क्विनोन बाइन्डिङसँगै हुने सुसंगत संरचनात्मक परिवर्तनहरूको जाँच गर्ने नयाँ अवसर प्रदान गर्दछ। RC-LH116 कम्प्लेक्समा, QB क्विनोन पूर्ण रूपमा बाँधिएको "निकट" स्थितिमा अवस्थित छ (26), तर RC-LH114-W को पृथक्करणमा QB क्विनोन छैन। RC-LH114-W मा कुनै QB क्विनोन छैन, जुन आश्चर्यजनक छ किनभने जटिल सक्रिय छ, संरचनात्मक रूपमा समाधान गरिएको QB क्विनोन भएको RC-LH116 कम्प्लेक्स भन्दा बढी। यद्यपि दुई LH1 रिंगहरूले लगभग छ क्विनोनहरू चेलेट गर्छन्, पाँचवटा बन्द RC-LH116 रिंगमा संरचनात्मक रूपमा समाधान गरिएका छन्, जबकि खुला RC-LH114-W रिंगमा केवल तीनवटा संरचनात्मक रूपमा सीमित छन्। यो बढेको संरचनात्मक विकारले RC-LH114-W QB साइटहरूको छिटो प्रतिस्थापन, जटिलमा छिटो क्विनोन गतिविज्ञान, र LH1 लूप पार गर्ने सम्भावना बढेको प्रतिबिम्बित गर्न सक्छ। हामी सुझाव दिन्छौं कि RC-LH114-W को RC QB साइटमा UQ को अभाव अझ जटिल र बढी सक्रिय जटिलको परिणाम हुन सक्छ, र RC-LH114-W को QB साइट तुरुन्तै UQ टर्नओभरमा स्थिर गरिएको छ। विशिष्ट चरण (QB साइटको प्रवेशद्वार बन्द गरिएको छ) ले यस गतिविधिको रूपान्तरणलाई प्रतिबिम्बित गर्दछ।
QB बिना, L-Phe217 को साथमा घुमाउने स्थिति UQ10 बाइन्डिङसँग असंगत छ, किनभने यसले पुच्छरको पहिलो आइसोप्रीन एकाइसँग स्थानिय टक्कर निम्त्याउनेछ (चित्र 6A)। थप रूपमा, स्पष्ट मुख्य संरचनात्मक परिवर्तनहरू स्पष्ट छन्, विशेष गरी हेलिक्स डे (TMH D र E बीचको लूपमा छोटो हेलिक्स) जहाँ L-Phe217 QB बाइन्डिङ पकेटमा सारिएको छ र L-Tyr223 को घुमाउने (चित्र 6A) M-Asp45 फ्रेमवर्कसँग हाइड्रोजन बन्धन तोड्न र QB बाइन्डिङ साइटको प्रवेशद्वार बन्द गर्न (चित्र 6B)। हेलिक्स डे यसको आधारमा पिभोट गर्दछ, L-Ser209 को Cα 0.33Å द्वारा सारिएको छ, जबकि L-Val221Cα 3.52Å द्वारा सारिएको छ। TMH D र E मा कुनै अवलोकनयोग्य परिवर्तनहरू छैनन्, जुन दुवै संरचनाहरूमा सुपरइम्पोजेबल छन् (चित्र 6A)। हामीलाई थाहा भएसम्म, यो प्राकृतिक RC मा पहिलो संरचना हो जसले QB साइटलाई बन्द गर्छ। पूर्ण (QB-बाउन्ड) संरचनासँग तुलना गर्दा देखाउँछ कि क्विनोन घटाउनु अघि, यसलाई क्विनोनमा प्रवेश गर्नको लागि एक संरचनात्मक परिवर्तन आवश्यक पर्दछ। L-Phe217 क्विनोन हेड समूहसँग π-स्ट्याकिंग अन्तरक्रिया बनाउन घुम्छ, र हेलिक्स बाहिर सर्छ, जसले L-Gly222 को कंकाल र L-Tyr223 को साइड चेनलाई स्थिर हाइड्रोजन बन्ड संरचना (चित्र 6, A र C) को साथ हाइड्रोजन बन्ड नेटवर्क बनाउन अनुमति दिन्छ।
(A) होलोग्राम (L चेन, सुन्तला/M चेन, म्याजेन्टा) र apo (खैरो) संरचनाको ओभरल्यापिङ कार्टुन, जसमा प्रमुख अवशेषहरू रड जस्तो प्रतिनिधित्वको रूपमा प्रदर्शित हुन्छन्। UQ10 लाई पहेंलो बारले प्रतिनिधित्व गरिएको छ। डटेड रेखाले सम्पूर्ण संरचनामा बनेको हाइड्रोजन बन्धनलाई संकेत गर्दछ। (B र C) एपोलिपोप्रोटिन र सम्पूर्ण रिंग संरचनाको सतह प्रतिनिधित्व, क्रमशः नीलोमा L-Phe217 र रातोमा L-Tyr223 को साइड चेन अक्सिजन हाइलाइट गर्दै। L सबयुनिट सुन्तला रंगको छ; M र H सबयुनिटहरू रंगीन छैनन्। (D र E) एपोलिपोप्रोटिन (D) र सम्पूर्ण (E) RC QB साइटहरू [क्रमशः (A) द्वारा रंग] र थर्मोफिलस थर्मोफिलस PSII (प्लास्टिक क्विनोनको साथ हरियो, नीलो; PDB ID: 3WU2) पङ्क्तिबद्ध गर्नुहोस् (58)।
अप्रत्याशित रूपमा, LH1 बिना QB-कमी RCs को धेरै संरचनाहरू उपलब्ध भए तापनि, यस अध्ययनमा अवलोकन गरिएका संरचनात्मक परिवर्तनहरू पहिले रिपोर्ट गरिएको छैन। यसमा Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) र Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) बाट QB कमी संरचना समावेश छ, जुन सबै तिनीहरूको समग्र QB संरचना जस्तै लगभग समान छन्। 3PRC को नजिकको निरीक्षणले पत्ता लगायो कि LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) डिटर्जेंट अणुहरू QB स्थितिको प्रवेशद्वारमा बाँधिन्छन्, जसले बन्द कन्फर्मेसनमा पुनर्व्यवस्थित हुनबाट रोक्न सक्छ। यद्यपि LDAO 1EYS वा 1OGV मा एउटै स्थितिमा विघटन गर्दैन, यी RC हरू एउटै डिटर्जेंट प्रयोग गरेर तयार गरिन्छन् र त्यसैले उही प्रभाव उत्पादन गर्न सक्छन्। Rba को क्रिस्टल संरचना। साइटोक्रोम c2 (PDB ID: 1L9B) सँग सह-क्रिस्टलाइज्ड Sphaeroides RC मा पनि बन्द QB साइट देखिन्छ। यद्यपि, यस अवस्थामा, RC-M पोलिपेप्टाइडको N-टर्मिनल क्षेत्र (Q हेलिक्समा Tyr अवशेषको H बन्धन मार्फत QB बाइन्डिङ साइटसँग अन्तर्क्रिया गर्दै) ले एक अप्राकृतिक रूपान्तरण अपनाउँछ, र QB रूपान्तरण परिवर्तनलाई थप अन्वेषण गरिएको छैन (30)। आश्वस्त पार्ने कुरा के हो भने हामीले RC-LH114-W संरचनामा M पोलिपेप्टाइडको यस प्रकारको विकृति देखेका छैनौं, जुन RC-LH116 RC को N-टर्मिनल क्षेत्र जस्तै लगभग छ। यो पनि ध्यान दिनुपर्छ कि डिटर्जेन्ट-आधारित LH1 एन्टेनाको उन्मूलन पछि, PDB मा एपोलिपोप्रोटिन RC हरू समाधान गरियो, जसले RC र वरपरको LH1 रिंगको भित्री सतह (31, 32) बीचको खाडलमा आन्तरिक क्विनोन पूलहरू र लिपिडहरू हटाइयो। RC कार्यात्मक रहन्छ किनभने यसले सबै सहकारकहरूलाई कायम राख्छ, विघटनशील QB क्विनोन बाहेक, जुन कम स्थिर हुन्छ र तयारी प्रक्रियाको क्रममा प्रायः हराउँछ (33)। थप रूपमा, यो ज्ञात छ कि RC बाट LH1 र प्राकृतिक चक्रीय लिपिडहरू हटाउनाले कार्यहरूमा प्रभाव पार्न सक्छ, जस्तै चार्ज-विभाजित P+QB-अवस्थाको छोटो आयु (31, 34, 35)। त्यसकारण, हामी अनुमान गर्छौं कि RC वरपरको स्थानीय LH1 रिंगको अस्तित्वले "बन्द" QB साइट कायम राख्न सक्छ, जसले गर्दा QB नजिकको स्थानीय वातावरण सुरक्षित रहन्छ।
यद्यपि एपोलिपोप्रोटिन (QB क्विनोन बिना) र पूर्ण संरचनाले घटनाहरूको श्रृंखलाको सट्टा QB साइटको टर्नओभरको केवल दुई स्न्यापशटहरू प्रतिनिधित्व गर्दछ, त्यहाँ संकेतहरू छन् कि बाइन्डिङलाई हाइड्रोक्विनोनद्वारा रिबाइन्डिङ रोक्नको लागि गेट गर्न सकिन्छ सब्सट्रेट अवरोधलाई रोक्न। एपोलिपोप्रोटिनको QB साइट नजिकै क्विनोलोल र क्विनोनको अन्तरक्रिया फरक हुन सक्छ, जसले RC द्वारा यसको अस्वीकृति निम्त्याउँछ। यो लामो समयदेखि प्रस्ताव गरिएको छ कि कन्फर्मेसनल परिवर्तनहरूले क्विनोनहरूको बाइन्डिङ र कमीमा भूमिका खेल्छन्। अँध्यारो अनुकूलन पछि क्विनोनहरू घटाउन जमेको RCs को क्षमता बिग्रिएको छ (36); एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफीले देखाउँछ कि यो क्षति QB क्विनोनहरू सक्रिय समीपस्थ स्थिति (26), 37 बाट लगभग 4.5 Å "दूरी" कन्फर्मेसनमा फसेको कारणले भएको हो। हामी सुझाव दिन्छौं कि यो डिस्टल बाइन्डिङ कन्फर्मेसन एपोलिपोप्रोटिन र पूर्ण रिंग संरचना बीचको मध्यवर्ती अवस्थाको स्न्यापसट हो, जुन क्विनोनसँगको प्रारम्भिक अन्तरक्रिया र QB साइटको उद्घाटनलाई पछ्याउँछ।
निश्चित फोटोट्रोफिक ब्याक्टेरिया र साइनोब्याक्टेरिया, शैवाल र बिरुवाहरूको PSII कम्प्लेक्समा पाइने प्रकार II RC मा संरचनात्मक र कार्यात्मक संरक्षण हुन्छ (38)। चित्र 6 (D र E) मा देखाइएको संरचनात्मक पङ्क्तिबद्धताले PSII RCs र ब्याक्टेरिया RC कम्प्लेक्सको QB साइट बीचको समानतालाई जोड दिन्छ। यो तुलना लामो समयदेखि क्विनोन बाइन्डिङ र रिडक्सनको नजिकबाट सम्बन्धित प्रणालीहरूको अध्ययनको लागि एक मोडेल भएको छ। अघिल्ला प्रकाशनहरूले सुझाव दिएका थिए कि कन्फर्मेसनल परिवर्तनहरू क्विनोनहरूको PSII रिडक्सनसँगै हुन्छन् (39, 40)। त्यसकारण, RC को विकासवादी संरक्षणलाई विचार गर्दा, यो पहिले अवलोकन नगरिएको बाइन्डिङ संयन्त्र अक्सिजनयुक्त फोटोट्रोफिक बिरुवाहरूमा PSII RC को QB साइटमा पनि लागू हुन सक्छ।
Rps ΔpufW (लेबल नगरिएको pufW मेटाउने) र PufW-His (C-टर्मिनल १०x His-ट्याग गरिएको प्रोटीन-W प्राकृतिक pufW लोकसबाट व्यक्त गरिएको) स्ट्रेनहरू। palustris CGA009 लाई हाम्रो अघिल्लो काम (१६) मा वर्णन गरिएको थियो। यी स्ट्रेनहरू र आइसोजेनिक वाइल्ड-टाइप पेरेन्टलाई PYE (प्रत्येक ५ ग्राम लिटर -१) (-८० डिग्री सेल्सियसमा LB मा भण्डारण गरिएको, ५०% (w/v) ग्लिसरोल) प्रोटीन, खमीरको अर्क र succinate) अगर [१.५% (w/v)] प्लेटमा थोरै संख्यामा कोशिकाहरू स्ट्रिक गरेर फ्रिजरबाट पुन: प्राप्त गरिएको थियो। प्लेटलाई एनारोबिक अवस्थामा कोठाको तापक्रममा अँध्यारोमा रातभर इन्क्युबेट गरिएको थियो, र त्यसपछि OSRAM ११६-W हलोजन बल्बहरू (RS कम्पोनेन्ट्स, UK) द्वारा प्रदान गरिएको सेतो प्रकाश (~५० μmolm-२ s-१) ले ३ देखि ५ दिनसम्म एकल कोलोनी देखा नपरेसम्म उज्यालो पारिएको थियो। एउटा कोलोनीमा १० मिलीलीटर M22+ मध्यम (४१) लाई ०.१% (w/v) क्यासामिनो एसिड (यसपछि M22 भनेर चिनिन्छ) सँग पूरक गरी खोप लगाउन प्रयोग गरिएको थियो। यो कल्चरलाई कम अक्सिजन अवस्थामा अँध्यारोमा ३४ डिग्री सेल्सियसमा १८० आरपीएममा ४८ घण्टासम्म हल्लाइयो, र त्यसपछि ७० मिलीलीटर कल्चरलाई २४ घण्टासम्म उही अवस्थामा खोप लगाइयो। १ मिलीलीटरको आयतन भएको अर्ध-एरोबिक कल्चरलाई ३० मिलीलीटरको युनिभर्सल स्क्रू-टप पारदर्शी गिलासको बोतलमा ३० मिलीलीटर M22 माध्यमलाई खोप लगाउन प्रयोग गरिन्छ र बाँझ चुम्बकीय बल स्टिरिङ रडद्वारा ४८ घण्टासम्म आन्दोलन (~५०μmolm-२ s-१) द्वारा विकिरण गरिन्छ। त्यसपछि ३० मिलीलीटर कल्चरलाई उही अवस्थामा लगभग १ लिटर कल्चरसँग खोप लगाइयो, जुन त्यसपछि ७२ घण्टाको लागि ~२०० μmolm-२ s-१ मा प्रबुद्ध लगभग ९ लिटर कल्चरलाई खोप लगाउन प्रयोग गरिएको थियो। कोषहरूलाई ७१३२ RCF मा ३० मिनेटको लागि सेन्ट्रीफ्यूगेशनद्वारा काटियो, २० mM tris-HCl (pH ८.०) को ~१० ml मा पुन: निलम्बन गरियो, र आवश्यक नभएसम्म -२०°C मा भण्डारण गरियो।
पग्लिएपछि, पुन: निलम्बित कोषहरूमा डिअक्सिराइबोन्यूक्लिज I (मर्क, युके), लाइसोजाइम (मर्क, युके) र दुई रोचे होलोएन्जाइम प्रोटीज इनहिबिटर ट्याब्लेटहरू (मर्क, युके) का केही क्रिस्टलहरू थप्नुहोस्। २०,००० पीएसआई फ्रेन्च प्रेसर सेल (अमिन्को, युएसए) मा, कोषहरू ८ देखि १२ पटक विघटित भए। १८,५०० आरसीएफमा ४° सेल्सियसमा १५ मिनेटको लागि सेन्ट्रीफ्यूगेशनद्वारा अभंग कोषहरू र अघुलनशील मलबे हटाइसकेपछि, पिग्मेन्टेड लाइसेटबाट ४३,००० डिग्री सेल्सियसमा २ घण्टाको लागि सेन्ट्रीफ्यूगेशनद्वारा झिल्लीलाई अवक्षेपित गरियो। घुलनशील अंश त्याग्नुहोस् र रंगीन झिल्लीलाई १०० देखि २०० मिली २० एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच ८.०) मा पुन: निलम्बित गर्नुहोस् र कुनै देखिने समुच्चयहरू नभएसम्म एकरूप बनाउनुहोस्। निलम्बित झिल्लीलाई २० मिमी ट्रिस-एचसीएल (पीएच ८.०) (एनाट्रेस, संयुक्त राज्य अमेरिका) मा २% (w/v) β-DDM भएको ४°C मा १ घण्टा अँध्यारोमा हल्का हलचलका साथ इन्क्युबेट गरिएको थियो। त्यसपछि ७०°C मा सेन्ट्रीफ्यूज गरी १ घण्टाको लागि ४°C मा १५०,००० RCF लाई घुलनशील बनाइयो ताकि अवशिष्ट अघुलनशील पदार्थहरू हटाइयोस्।
ΔpufW स्ट्रेनबाट घुलनशील झिल्ली ५० मिलीलीटर DEAE सेफेरोज आयन एक्सचेन्ज स्तम्भमा लागू गरिएको थियो जसमा तीन स्तम्भ भोल्युमहरू (CV) बाइन्डिङ बफर [२० mM tris-HCl (pH ८.०) जसमा ०.०३% (w / v) β-DDM] समावेश थियो। स्तम्भलाई दुई CV बाइन्डिङ बफरहरूले धुनुहोस्, र त्यसपछि ५० mM NaCl भएका दुई बाइन्डिङ बफरहरूले स्तम्भलाई धुनुहोस्। RC-LH116 कम्प्लेक्सलाई १.७५ CV मा १५० देखि ३०० mM NaCl (बाइन्डिङ बफरमा) को रेखीय ढाँचाको साथ एल्युटेड गरिएको थियो, र बाँकी बाइन्डिङ कम्प्लेक्सलाई ०.५ CV मा ३०० mM NaCl भएको बाइन्डिङ बफरले एल्युटेड गरिएको थियो। २५० र १००० एनएम बीचको अवशोषण स्पेक्ट्रम सङ्कलन गर्नुहोस्, १ भन्दा बढी अवशोषण अनुपात (A880/A280) भएको अंशलाई ८८० देखि २८० एनएममा राख्नुहोस्, यसलाई बाइन्डिङ बफरमा दुई पटक पातलो गर्नुहोस्, र DEAE स्तम्भ शुद्धीकरणमा फेरि उही प्रक्रिया प्रयोग गर्नुहोस्। १.७ भन्दा बढी A880/A280 अनुपात र ३.० भन्दा बढी A880/A805 अनुपात भएका अंशहरूलाई पातलो गर्नुहोस्, आयन विनिमयको तेस्रो चरण गर्नुहोस्, र २.२ भन्दा बढी A880/A280 अनुपात र ५.० भन्दा बढी A880/A805 अनुपात भएका अंशहरू राख्नुहोस्। आंशिक रूपमा शुद्ध गरिएको कम्प्लेक्सलाई Amicon 100,000 आणविक वजन कट-अफ (MWCO) केन्द्रापसारक फिल्टर (Merck, UK) मा ~2 ml सम्म केन्द्रित गरिएको थियो, र २०० mM NaCl बफर भएको Superdex 200 16/600 साइज बहिष्करण स्तम्भ (GE Healthcare, US) मा लोड गरिएको थियो, र त्यसपछि 1.5 CV मा उही बफरमा एल्युट गरिएको थियो। आकार बहिष्करण अंशको अवशोषण स्पेक्ट्रा सङ्कलन गर्नुहोस्, र अवशोषण स्पेक्ट्रालाई 2.4 भन्दा माथि A880/A280 अनुपात र 5.8 देखि 100 A880 भन्दा माथि A880/A805 अनुपातको साथ केन्द्रित गर्नुहोस्, र तुरुन्तै तिनीहरूलाई क्रायो-TEM ग्रिड तयारी वा भण्डारणको लागि प्रयोग गर्नुहोस्। आवश्यक नभएसम्म -80°C मा राख्नुहोस्।
PufW-His स्ट्रेनबाट घुलनशील झिल्ली IMAC बफर (GE Healthcare) मा २०० mM NaCl र ०.०३% (w/w)) भएको २० ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose स्तम्भ (२० mM tris-HCl (pH ८.०) मा लागू गरिएको थियो। स्तम्भलाई IMAC बफरको पाँच CVs र त्यसपछि १० mM हिस्टिडाइन भएको पाँच CVs IMAC बफरले धोइएको थियो। कोर कम्प्लेक्सलाई १०० mM हिस्टिडाइन भएको पाँच IMAC बफरहरू सहित स्तम्भबाट निकालिएको थियो। RC-LH114-W कम्प्लेक्स भएको अंशलाई Amicon 100,000 MWCO फिल्टर (Merck, UK) ले सुसज्जित हलचल गरिएको ट्याङ्कीमा ~१० ml सम्म केन्द्रित गरिएको छ, बाइन्डिङ बफरको साथ २० पटक पातलो गरिएको छ, र त्यसपछि २५ ml मा थपिएको छ। DEAE Sepharose स्तम्भमा, बफरमा बाँधिएका चार CVs पहिले नै प्रयोग गरिन्छ। चार CV बाइन्डिङ बफरहरूले स्तम्भ धुनुहोस्, त्यसपछि ० देखि १०० mM NaCl (बाइन्डिङ बफरमा) को रेखीय ग्रेडियन्टमा आठ CV मा कम्प्लेक्सलाई एल्युट गर्नुहोस्, र बाँकी चार CV हरूमा १०० mM बाइन्डिङ बफर समावेश गर्नुहोस्। सोडियम क्लोराइडमा एल्युट गरिएका अवशिष्ट कम्प्लेक्सहरू २.४ भन्दा बढी A880/A280 अनुपात र ४.६ अंश भन्दा बढी A880/A805 अनुपातसँग मिलाएर Amicon १००,००० MWCO केन्द्रापसारक फिल्टरमा ~२ मिलीलीटरमा केन्द्रित गरियो, र अग्रिम १.५ CV IMAC भरियो। बफरले सन्तुलित सुपरडेक्स २०० १६/६०० आकार बहिष्करण स्तम्भ, र त्यसपछि १.५ CV भन्दा बढी उही बफरमा एल्युट गरियो। आकार-बहिष्करण अंशहरूको अवशोषण स्पेक्ट्रा सङ्कलन गर्नुहोस् र अवशोषण स्पेक्ट्रालाई २.१ भन्दा माथि A880/A280 अनुपात र ४.६ देखि १०० A880 भन्दा माथि A880/A805 अनुपातको साथ केन्द्रित गर्नुहोस्, जुन तुरुन्तै जमेको TEM ग्रिड तयारीको लागि प्रयोग गरिन्छ वा आवश्यकता नभएसम्म -80°C मा भण्डारण गरिन्छ।
कम तापक्रमको TEM ग्रिडहरू तयार गर्न Leica EM GP इमर्सन फ्रिजर प्रयोग गरिएको थियो। कम्प्लेक्सलाई IMAC बफरमा ५० को A880 मा पातलो पारिएको थियो, र त्यसपछि ५μl लाई नयाँ ग्लो-डिस्चार्ज गरिएको QUANTIFOIL १.२/१.३ कार्बन-लेपित तामाको जालमा लोड गरिएको थियो (Agar Scientific, UK)। ग्रिडलाई २०°C र ६०% सापेक्षिक आर्द्रतामा ३० सेकेन्डको लागि इन्क्युबेट गर्नुहोस्, त्यसपछि यसलाई ३ सेकेन्डको लागि सुकाउनुहोस्, र त्यसपछि -१७६°C मा तरल इथेनमा निभाउनुहोस्।
RC-LH114-W कम्प्लेक्सको डेटा eBIC (इलेक्ट्रोनिक बायोइमेजिङ सेन्टर) (ब्रिटिश डायमण्ड लाइट सोर्स) मा टाइटन क्रियोस माइक्रोस्कोपको साथ रेकर्ड गरिएको थियो, जुन 300kV को एक्सेलेरेटिङ भोल्टेजमा काम गर्दछ, 130,000× को नाममात्र म्याग्निफिकेसन र 20 eV को अन्तराल छनौट गर्ने ऊर्जाको साथ। डेटा सङ्कलन गर्न गणना मोडमा छविहरू रेकर्ड गर्न K2 शिखर डिटेक्टरको साथ Gatan 968 GIF क्वान्टम प्रयोग गरिएको थियो। क्यालिब्रेट गरिएको पिक्सेल आकार 1.048Å छ, र खुराक दर 3.83 e-Å-2s-1 छ। ११ सेकेन्डमा चलचित्र सङ्कलन गरियो र यसलाई 40 भागहरूमा विभाजित गरियो। माइक्रोस्कोपलाई पुन: फोकस गर्न कार्बन-लेपित क्षेत्र प्रयोग गर्नुहोस्, र त्यसपछि प्रति प्वाल तीन चलचित्रहरू सङ्कलन गर्नुहोस्। कुल, 3130 चलचित्रहरू सङ्कलन गरियो, -1 र -3μm बीचको डिफोकस मानहरू सहित।
RC-LH116 कम्प्लेक्सको लागि डेटा एस्टरबरी बायोस्ट्रक्चर प्रयोगशाला (लिड्स विश्वविद्यालय, बेलायत) मा उही माइक्रोस्कोप प्रयोग गरेर सङ्कलन गरिएको थियो। डेटा गणना मोडमा १३० k को म्याग्निफिकेसनको साथ सङ्कलन गरिएको थियो, र पिक्सेल आकारलाई ४.६ e-Å-2s-1 को खुराकको साथ १.०६५ Å मा क्यालिब्रेट गरिएको थियो। चलचित्र १२ सेकेन्डमा रेकर्ड गरिएको थियो र ४८ भागहरूमा विभाजित गरिएको थियो। कुल, ३३५९ फिल्महरू सङ्कलन गरिएको थियो, जसमा -१ र -३μm बीचको डिफोकस मानहरू थिए।
सबै डेटा प्रशोधन Relion 3.0 पाइपलाइन (42) मा गरिन्छ। खुराक भार निर्धारण गरेर बीम गति सच्याउन Motioncorr 2 (43) प्रयोग गर्नुहोस्, र त्यसपछि CTF (कन्ट्रास्ट ट्रान्सफर प्रकार्य) प्यारामिटर निर्धारण गर्न CTFFIND 4.1 (44) प्रयोग गर्नुहोस्। यी प्रारम्भिक प्रशोधन चरणहरू पछि विशिष्ट फोटोमाइक्रोग्राफहरू चित्र 2 मा देखाइएका छन्। S16। स्वचालित चयन टेम्प्लेट 250-पिक्सेल फ्रेममा लगभग 1000 कणहरूको 250 पिक्सेल म्यानुअल रूपमा चयन गरेर उत्पन्न हुन्छ र कुनै सन्दर्भ दुई-आयामी (2D) वर्गीकरण छैन, जसले गर्दा नमूना प्रदूषण पूरा गर्ने वा कुनै स्पष्ट विशेषताहरू नभएका ती वर्गीकरणहरूलाई अस्वीकार गरिन्छ। त्यसपछि, सबै माइक्रोफोटोग्राफहरूमा स्वचालित चयन गरिएको थियो, र RC-LH114-W 849,359 कणहरू थिए, र RC-LH116 जटिल 476,547 कणहरू थिए। सबै चयन गरिएका कणहरूले गैर-सन्दर्भ 2D वर्गीकरणको दुई चरणहरू पार गरेका छन्, र प्रत्येक रन पछि, कार्बन क्षेत्र, नमूना प्रदूषण, कुनै स्पष्ट विशेषताहरू वा कडा रूपमा ओभरल्यापिङ कणहरू पूरा गर्ने कणहरू अस्वीकार गरिन्छन्, जसको परिणामस्वरूप क्रमशः 772,033 (90.9%) र 359,678 (75.5%) कणहरू RC-LH114-W र RC-LH116 को 3D वर्गीकरणको लागि प्रयोग गरिन्छ। प्रारम्भिक 3D सन्दर्भ मोडेल स्टोकास्टिक ग्रेडियन्ट डिसेन्ट विधि प्रयोग गरेर उत्पन्न गरिएको थियो। प्रारम्भिक मोडेललाई सन्दर्भको रूपमा प्रयोग गरेर, चयन गरिएका कणहरूलाई 3D मा चार कोटीहरूमा वर्गीकृत गरिएको छ। यस श्रेणीको मोडेललाई सन्दर्भको रूपमा प्रयोग गरेर, सबैभन्दा ठूलो श्रेणीमा कणहरूमा 3D परिष्करण गर्नुहोस्, त्यसपछि विलायक क्षेत्र कभर गर्न प्रारम्भिक 15Å कम-पास फिल्टर प्रयोग गर्नुहोस्, नरम किनारहरूको 6 पिक्सेल थप्नुहोस्, र शीर्ष डिटेक्टरको Gatan K2 शिखर मोड्युलेसन स्थानान्तरण प्रकार्यलाई सच्याउन पिक्सेलहरू पोस्ट-प्रोसेस गर्नुहोस्। RC-LH114-W डेटासेटको लागि, यो प्रारम्भिक मोडेललाई मास्कको किनारमा रहेको बलियो घनत्व हटाएर परिमार्जन गरिएको थियो (UCSF Chimera मा कोर जटिल घनत्वबाट विच्छेद गरिएको)। परिणामस्वरूप मोडेलहरू (RC-LH114-W र RC-LH116 को रिजोल्युसन क्रमशः 3.91 र 4.16 Å छन्) 3D वर्गीकरणको दोस्रो चरणको लागि सन्दर्भको रूपमा प्रयोग गरिन्छ। प्रयोग गरिएका कणहरूलाई प्रारम्भिक 3D वर्गमा समूहबद्ध गरिएको छ र छिमेकसँग बलियो सहसम्बन्ध छैन। ओभरल्याप वा स्पष्ट संरचनात्मक सुविधाहरूको अभाव। 3D वर्गीकरणको दोस्रो चरण पछि, उच्चतम रिजोल्युसन भएको श्रेणी चयन गरिएको थियो [RC-LH114-W को लागि, एउटा श्रेणी 377,703 कणहरू (44.5%) हो, RC-LH116 को लागि, दुई वर्गहरू छन्, जम्मा 260,752 कणहरू (54.7%) , जहाँ तिनीहरू सानो भिन्नताका साथ प्रारम्भिक परिक्रमा पछि पङ्क्तिबद्ध हुँदा मात्र समान हुन्छन्]। चयन गरिएका कणहरूलाई ४००-पिक्सेल बक्समा पुन: निकालिन्छ र ३D रिफाइनिङद्वारा परिष्कृत गरिन्छ। विलायक मास्क प्रारम्भिक १५Å कम-पास फिल्टर, ३ पिक्सेल नक्सा विस्तार र ३ पिक्सेल सफ्ट मास्क प्रयोग गरेर उत्पन्न गरिन्छ। प्रति-कण CTF रिफाइनमेन्ट, प्रति-कण गति सुधार र प्रति-कण CTF रिफाइनमेन्टको दोस्रो चरण प्रयोग गरेर, परिणामस्वरूप बनावटलाई थप परिष्कृत गर्न प्रत्येक चरण पछि ३D रिफाइनमेन्ट, विलायक मास्किङ र पोस्ट-प्रोसेसिङ गरिन्छ। ०.१४३ को FSC (फूरियर शेल सहसम्बन्ध गुणांक) कट-अफ मान प्रयोग गरेर, RC-LH114-W र RC-LH116 को अन्तिम मोडेलहरूको रिजोल्युसन क्रमशः २.६५ र २.८०Å छन्। अन्तिम मोडेलको FSC वक्र चित्र २. S१७ मा देखाइएको छ।
सबै प्रोटिन अनुक्रमहरू UniProtKB बाट डाउनलोड गरिएका छन्: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); प्रोटिन-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3)। SWISS-MODEL (45) RC को होमलोजी मोडेल निर्माण गर्न प्रयोग गरिएको थियो, जसमा RC-L, RC-M र RC-H को प्रोटिन अनुक्रमहरू र Rba को क्रिस्टल संरचना समावेश छ। sphaeroides RC लाई टेम्प्लेट (PDB ID: 5LSE) (46) को रूपमा प्रयोग गरिएको थियो। उत्पन्न गरिएको मोडेललाई नक्सामा फिट गर्न UCSF Chimera मा "फिट म्याप" उपकरण प्रयोग गर्नुहोस् (47), प्रोटीन संरचना सुधार गर्नुहोस्, र सह-कारक [4×BChl a (मोनोमर पुस्तकालय अवशेष नाम = BCL), 2×BPh a (BPH), एक वा दुई प्रकारका UQ10 (U10), एक गैर-हेम फलाम (Fe) र एक 3,4-डाइहाइड्रोहेक्साकार्बोनिलकोलिन (QAK)] थप्न Coot (48) प्रयोग गर्नुहोस्। QAK मोनोमर पुस्तकालयमा उपलब्ध नभएकोले, यसलाई PHENIX (49) मा eLBOW उपकरण प्रयोग गरेर प्यारामिटराइज गरिएको थियो।
त्यसपछि, LH1 सबयुनिट निर्माण गरियो। सुरुमा, PHENIX (49) मा रहेको स्वचालित निर्माण उपकरण नक्सा प्रयोग गरेर LH1 अनुक्रमको भाग स्वचालित रूपमा निर्माण गर्न र LH1-α र LH1-β प्रोटीन अनुक्रमहरू इनपुटको रूपमा प्रयोग गर्न प्रयोग गरिएको थियो। सबैभन्दा पूर्ण LH1 सबयुनिट चयन गर्नुहोस्, यसलाई निकाल्नुहोस् र Coot मा लोड गर्नुहोस्, यसमा छुटेको अनुक्रम म्यानुअल रूपमा थप्नुहोस्, र दुई BCls a (BCL) र एक spirilloxanthin (CRT) थप्नु अघि सम्पूर्ण संरचनालाई म्यानुअल रूपमा परिष्कृत गर्नुहोस् [सान्दर्भिक Rps अनुसार LH1 जटिलको घनत्व र ज्ञात क्यारोटीनोइड सामग्री। प्रजातिहरू (17)]। पूर्ण LH1 सबयुनिट प्रतिलिपि गर्नुहोस्, र LH1 घनत्वको छेउछाउको गैर-मोडेल क्षेत्रमा डक गर्न UCSF Chimera "डकिंग नक्सा उपकरण" प्रयोग गर्नुहोस्, र त्यसपछि यसलाई Coot मा परिष्कृत गर्नुहोस्; सबै LH1 सबयुनिटहरू मोडेल नभएसम्म प्रक्रिया दोहोर्याउनुहोस्। RC-LH114-W संरचनाको लागि, Coot मा नआएको घनत्व निकालेर, प्रोटिनलाई USCF Chimera नक्सामा बाँकी गैर-प्रोटिन घटकहरूबाट विभाजन गरिन्छ र प्रारम्भिक मोडेल र बाँकी उपयुनिटहरू (प्रोटिन-W) मोडेलिङ स्थापना गर्न Autobuild उपकरण प्रयोग गरिन्छ। PHENIX (49) मा। Coot (48) मा परिणामस्वरूप मोडेलमा कुनै पनि छुटेका अनुक्रमहरू थप्नुहोस्, र त्यसपछि सम्पूर्ण उपयुनिटलाई म्यानुअल रूपमा परिष्कृत गर्नुहोस्। बाँकी नआएको घनत्व लिपिडहरूको संयोजनमा फिट हुन्छ (CDL = CDL, POPC = 6PL र POPG = PGT को PDB मोनोमर लाइब्रेरी ID), β-DDM डिटर्जेन्ट (LMT) र UQ10 अणुहरू (U10)। मोडेल तथ्याङ्क र फिटको दृश्य गुणस्तर थप सुधार गर्न नसकेसम्म पूर्ण प्रारम्भिक मोडेललाई पूर्ण बनाउन Coot (49) र म्यानुअल अप्टिमाइजेसन प्रयोग गर्नुहोस्। अन्तमा, स्थानीय नक्सालाई तिखार्न LocScale (50) प्रयोग गर्नुहोस्, र त्यसपछि नआएको घनत्व र स्वचालित र म्यानुअल अप्टिमाइजेसन मोडेलिङका धेरै अन्य चक्रहरू प्रदर्शन गर्नुहोस्।
सम्बन्धित पेप्टाइड्स, सह-कारकहरू र अन्य लिपिडहरू र क्विनोनहरू तिनीहरूको सम्बन्धित घनत्व भित्र डक गरिएका छन् चित्र १ र २ मा देखाइएको छ। S18 देखि S23 सम्म। अन्तिम मोडेलको तथ्याङ्कीय जानकारी तालिका S1 मा देखाइएको छ।
अन्यथा निर्दिष्ट नगरिएसम्म, UV/Vis/NIR अवशोषण स्पेक्ट्रा Cary60 स्पेक्ट्रोफोटोमिटर (Agilent, USA) मा 250 nm देखि 1000 nm सम्म 1 nm अन्तरालमा र 0.1s को एकीकरण समयमा सङ्कलन गरिएको थियो।
१ को A880 सम्म २ मिमी बाटो भएको क्वार्ट्ज क्युभेटमा नमूनालाई पातलो पार्नुहोस्, र ४०० र १००० एनएम बीचको अवशोषण स्पेक्ट्रम सङ्कलन गर्नुहोस्। गोलाकार डाइक्रोइक स्पेक्ट्रालाई ज्यास्को ८१० स्पेक्ट्रोपोलारिमिटर (जास्को, जापान) मा ४०० एनएम र ९५० एनएम बीचको १ एनएम अन्तरालमा २० एनएम न्यूनतम-१ को स्क्यान दरमा सङ्कलन गरिएको थियो।
मोलर विलुप्तता गुणांक कोर कम्प्लेक्सलाई लगभग ५० को A880 मा पातलो गरेर निर्धारण गरिन्छ। १०μl भोल्युमलाई ९९०μl बाइन्डिङ बफर वा मेथानोलमा पातलो गर्नुहोस्, र BChl गिरावट कम गर्न तुरुन्तै अवशोषण स्पेक्ट्रम सङ्कलन गर्नुहोस्। प्रत्येक मिथानोल नमूनाको BChl सामग्री ५४.८ mM-१ cm-१ को ७७१ nm मा विलुप्तता गुणांक द्वारा गणना गरिएको थियो, र विलुप्तता गुणांक निर्धारण गरिएको थियो (५१)। कोर जटिल सांद्रता निर्धारण गर्न मापन गरिएको BChl सांद्रतालाई ३२ (RC-LH114-W) वा ३६ (RC-LH116) ले विभाजन गर्नुहोस्, जुन त्यसपछि बफर विलुप्तता गुणांकमा सङ्कलन गरिएको एउटै नमूनाको अवशोषण स्पेक्ट्रम निर्धारण गर्न प्रयोग गरिन्छ। समानान्तर। प्रत्येक नमूनाको लागि तीन पटक दोहोरिएको मापन लिइयो, र गणनाको लागि BChl Qy अधिकतमको औसत अवशोषण प्रयोग गरिएको थियो। ८७८ nm मा मापन गरिएको RC-LH114-W को विलुप्त गुणांक ३२८०±१४० mM-१ cm-१ छ, जबकि ८८० nm मा मापन गरिएको RC-LH116 को विलुप्त गुणांक ३८००±३० mM-१ cm-१ छ।
UQ10 लाई (52) मा दिइएको विधि अनुसार परिमाण गरिएको थियो। छोटकरीमा, रिभर्स फेज HPLC (RP-HPLC) Agilent 1200 HPLC प्रणाली प्रयोग गरेर गरिएको थियो। RC-LH116 वा RC-LH114-W को लगभग 0.02 nmol 50:50 मिथेनोलको 50μl मा घोल्नुहोस्: 0.02% (w/v) फेरिक क्लोराइड भएको क्लोरोफर्म, र पूर्व-सन्तुलित बेकम्यान कल्टर अल्ट्रास्फेयर ODS 4.6 मिमी इन्जेक्ट गर्नुहोस्। ×25 सेमी स्तम्भमा HPLC विलायक (80:20 मिथेनोल:2-प्रोपानोल) मा 40°C मा 1 ml-1 min-1 मा घोल्नुहोस्। 275 nm (UQ10), 450 nm (क्यारोटीनोइड्स) र 780 nm (BChl) मा 1 घण्टाको लागि अवशोषण निगरानी गर्न HPLC विलायकमा आइसोक्रेटिक इल्युसन गर्नुहोस्। २५.५ मिनेटमा २७५ एनएम क्रोमेटोग्रामको शिखर एकीकृत गरिएको थियो, जसमा अन्य कुनै पनि पत्ता लगाउन सकिने यौगिकहरू थिएनन्। एकीकृत क्षेत्र ० देखि ५.८ एनएमओएल (चित्र S१४) सम्मको शुद्ध मापदण्डको इंजेक्शनबाट गणना गरिएको क्यालिब्रेसन वक्रको सन्दर्भमा निकालिएको UQ10 को मोलर मात्रा गणना गर्न प्रयोग गरिन्छ। प्रत्येक नमूना तीन प्रतिकृतिहरूमा विश्लेषण गरिएको थियो, र रिपोर्ट गरिएको त्रुटि औसतको SD सँग मेल खान्छ।
३० μM घटाइएको घोडाको मुटु साइटोक्रोम c2 (Merck, UK) र ० देखि ५० μMUQ2 (Merck, UK) सहित ०.१ को अधिकतम Qy अवशोषण भएको RC-LH1 कम्प्लेक्स भएको घोल तयार पारिएको थियो। प्रत्येक UQ2 सांद्रतामा तीनवटा १-मिली नमूनाहरू तयार पारिएको थियो र मापन गर्नु अघि अँध्यारोमा पूर्ण अनुकूलन सुनिश्चित गर्न ४°C मा रातभर अँध्यारोमा इन्क्युबेट गरिएको थियो। घोललाई ३०० nm ज्वाला/५०० लाइन ग्रेटिंग, १.२४ mm इनलेट, ०.१२ mm मध्य र ०.६ mm आउटलेट स्लिटहरूले सुसज्जित OLIS RSM1000 मोड्युलर स्पेक्ट्रोफोटोमिटरमा लोड गरिएको थियो। उत्तेजना प्रकाश बहिष्कार गर्न नमूना फोटोट्यूब र सन्दर्भ फोटोमल्टीप्लायर ट्यूबको प्रवेशद्वारमा ६०० nm लामो पास फिल्टर राखिएको छ। ०.१५ सेकेन्डको एकीकरण समयको साथ ५५० nm मा अवशोषण निगरानी गरिएको थियो। उत्तेजना प्रकाश ८८० एनएम M880F2 LED (लाइट इमिटिंग डायोड) (थोरल्याब्स लिमिटेड, युके) बाट DC2200 नियन्त्रक (थोरल्याब्स लिमिटेड, युके) मार्फत ९०% तीव्रतामा फाइबर अप्टिक केबल मार्फत उत्सर्जित हुन्छ र ९०° को कोणमा प्रकाश स्रोतमा उत्सर्जित हुन्छ। नमूनाद्वारा सुरुमा अवशोषित नभएको कुनै पनि प्रकाश फिर्ता गर्न मापन बीम ऐनाको विपरीत हुन्छ। ५० सेकेन्डको रोशनी अघि १० सेकेन्डको अवशोषण निगरानी गर्नुहोस्। त्यसपछि क्विनोलोलले साइटोक्रोम c23 + लाई कति हदसम्म स्वतः घटाउँछ भनेर मूल्याङ्कन गर्न अँध्यारोमा ६० सेकेन्डको लागि अवशोषणलाई थप निगरानी गरिएको थियो (कच्चा डेटाको लागि चित्र S8 हेर्नुहोस्)।
डेटालाई ०.५ देखि १० सेकेन्ड भित्र रेखीय प्रारम्भिक दर फिट गरेर (UQ2 सांद्रतामा निर्भर गर्दै) र प्रत्येक UQ2 सांद्रतामा तीनवटै नमूनाहरूको दरहरूको औसत निर्धारण गरेर प्रशोधन गरिएको थियो। सम्बन्धित विलुप्तता गुणांकद्वारा गणना गरिएको RC-LH1 सांद्रता दरलाई उत्प्रेरक दक्षतामा रूपान्तरण गर्न प्रयोग गरिएको थियो, जुन Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) मा प्लट गरिएको थियो, र स्पष्ट Km र Kcat मानहरू निर्धारण गर्न Michaelis-Menten मोडेलमा फिट गरिएको थियो।
क्षणिक अवशोषण मापनको लागि, RC-LH1 नमूनालाई IMAC बफरमा ~2μM मा पातलो पारिएको थियो जसमा ५० mM सोडियम एस्कर्बेट (मर्क, संयुक्त राज्य अमेरिका) र ०.४ mM टर्बुटिन (मर्क, संयुक्त राज्य अमेरिका) थियो। एस्कर्बिक एसिडलाई बलिदान इलेक्ट्रोन दाताको रूपमा प्रयोग गरिन्छ, र मापन प्रक्रियाभरि मुख्य RC दाता कम रहन्छ (अर्थात्, फोटोअक्सिडाइज्ड छैन) सुनिश्चित गर्न tert-butaclofen QB अवरोधकको रूपमा प्रयोग गरिन्छ। लेजर मार्गमा रहेको नमूनामा उत्तेजना पल्सहरू बीच गाढा अनुकूलनको लागि पर्याप्त समय छ भनी सुनिश्चित गर्न २ मिमी अप्टिकल पथ लम्बाइको साथ लगभग ३ मिलीलीटर नमूनालाई अनुकूलित घुमाउने सेल (लगभग ०.१ मिटर व्यास, ३५० RPM) मा थपिएको छ। १ kHz (NIR को लागि २० nJ वा Vis को लागि १०० nJ) को पुनरावृत्ति दरमा ८८० nm मा नमूनालाई उत्तेजित गर्न Ti: नीलम लेजर प्रणाली (स्पेक्ट्रा फिजिक्स, संयुक्त राज्य अमेरिका) लाई प्रवर्द्धन गर्न ~१००-fs लेजर पल्सहरू प्रयोग गर्नुहोस्। डेटा सङ्कलन गर्नुअघि, नमूनालाई लगभग ३० मिनेटको लागि उत्तेजना प्रकाशमा राख्नुहोस्। एक्सपोजरले QA निष्क्रियता निम्त्याउनेछ (सम्भवतः एक वा दुई पटक QA घटाउनेछ)। तर कृपया ध्यान दिनुहोस् कि यो प्रक्रिया उल्टाउन सकिन्छ किनभने अँध्यारो अनुकूलनको लामो अवधि पछि, RC बिस्तारै QA गतिविधिमा फर्कनेछ। -१० देखि ७००० ps को ढिलाइ समयको साथ क्षणिक स्पेक्ट्रा मापन गर्न हेलियोस स्पेक्ट्रोमिटर (अल्ट्राफास्ट सिस्टम्स, संयुक्त राज्य अमेरिका) प्रयोग गरिएको थियो। डेटा सेटहरूलाई समूहबद्ध गर्न, त्यसपछि मर्ज गर्न र मानकीकरण गर्न सतह एक्सप्लोरर सफ्टवेयर (अल्ट्राफास्ट सिस्टम्स, संयुक्त राज्य अमेरिका) प्रयोग गर्नुहोस्। क्षयसँग सम्बन्धित भिन्न स्पेक्ट्रा प्राप्त गर्न संयुक्त डेटा सेट प्रयोग गर्न कार्पेटभ्यू सफ्टवेयर प्याकेज (लाइट कन्भर्जन लिमिटेड, लिथुआनिया) प्रयोग गर्नुहोस्, वा उत्पत्ति (ओरिजिनल्याब, संयुक्त राज्य अमेरिका) मा एकल-तरंगदैर्ध्य स्पेक्ट्रल इभोलुसनमा फिट हुन उपकरण प्रतिक्रियासँग धेरै घातांकहरूलाई कन्भल गर्ने प्रकार्य प्रयोग गर्नुहोस्।
माथि उल्लेख गरिएझैं (५३), RC र परिधीय LH2 एन्टेना दुवै नभएको LH1 जटिल भएको प्रकाशसंश्लेषक फिल्म तयार पारिएको थियो। झिल्लीलाई २० mM tris (pH ८.०) मा पातलो पारिएको थियो र त्यसपछि २ mm अप्टिकल पथ भएको क्वार्ट्ज क्युभेटमा लोड गरिएको थियो। -१० देखि ७००० ps को ढिलाइ समयको साथ ५४० nm मा नमूनालाई उत्तेजित गर्न ३०nJ लेजर पल्स प्रयोग गरिएको थियो। Rps. pal नमूनाको लागि वर्णन गरिए अनुसार डेटा सेट प्रशोधन गर्नुहोस्।
४°C मा २ घण्टाको लागि १५०,००० RCF मा सेन्ट्रीफ्यूगेशनद्वारा झिल्लीलाई पेलेट गरिएको थियो, र त्यसपछि ८८० nm मा यसको अवशोषण २० mM tris-HCl (pH ८.०) र २०० mM NaCl मा पुन: निलम्बित गरिएको थियो। ४°C मा अँध्यारोमा १ घण्टाको लागि २% (w/v) β-DDM मा बिस्तारै हलचल गरेर झिल्लीलाई घुलनशील बनाउनुहोस्। नमूनालाई १०० mM ट्राइथाइलमोनियम कार्बोनेट (pH ८.०) (TEAB; मर्क, युके) मा २.५ मिलीग्राम ml-१ (बायो-रेड विश्लेषण) को प्रोटीन सांद्रतामा पातलो पारिएको थियो। थप प्रशोधन पहिले प्रकाशित विधि (५४) बाट गरिएको थियो, १% (w/v) सोडियम लौरेट (मर्क, युके) भएको ५० μl TEAB मा ५० μg प्रोटीनलाई पातलो पारेर सुरु गरिएको थियो। ६० सेकेन्डसम्म सोनिकेसन गरेपछि, यसलाई ३७ डिग्री सेल्सियसमा ५ एमएम ट्रिस (२-कार्बोक्साइथाइल) फस्फिन (मर्क, युके) ले ३० मिनेटको लागि घटाइएको थियो। एस-अल्किलेसनको लागि, नमूनालाई १० एमएम मिथाइल एस-मिथाइलथियोमेथेनेसल्फोनेट (मर्क, युके) ले इन्क्युबेट गर्नुहोस् र २०० एमएम आइसोप्रोपानोल स्टक घोलबाट कोठाको तापक्रममा १० मिनेटको लागि थप्नुहोस्। २ μg ट्रिप्सिन/एन्डोप्रोटिनेज लाइस-सी मिश्रण (प्रोमेगा युके) थपेर प्रोटियोलाइटिक पाचन गरिएको थियो र ३७ डिग्री सेल्सियसमा ३ घण्टाको लागि इन्क्युबेट गरिएको थियो। ५० μl इथाइल एसीटेट र १० μl १०% (v/v) एलसी ग्रेड ट्राइफ्लुरोएसेटिक एसिड (TFA; थर्मो फिशर साइन्टिफिक, युके) थपेर र ६० सेकेन्डसम्म भोर्टेक्सिङ गरेर लौरेट सर्फ्याक्टेन्ट निकालिएको थियो। चरण विभाजनलाई १५,७०० आरसीएफमा ५ मिनेटको लागि सेन्ट्रीफ्यूगेशनद्वारा प्रवर्द्धन गरिएको थियो। निर्माताको प्रोटोकल अनुसार, पेप्टाइड भएको तल्लो चरणलाई सावधानीपूर्वक एस्पिरेट र डिसाल्ट गर्न C18 स्पिन स्तम्भ (थर्मो फिशर साइन्टिफिक, युके) प्रयोग गरिएको थियो। भ्याकुम सेन्ट्रीफ्यूगेशनद्वारा सुकाएपछि, नमूनालाई ०.५% TFA र ३% एसिटोनिट्राइलमा घुलनशील बनाइएको थियो, र पहिले विस्तृत रूपमा वर्णन गरिएका प्रणाली प्यारामिटरहरू प्रयोग गरेर मास स्पेक्ट्रोमेट्रीसँग जोडिएको न्यानोफ्लो RP क्रोमेटोग्राफीद्वारा ५०० एनजीको विश्लेषण गरिएको थियो।
Rps. palustris प्रोटियोम डाटाबेस (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426) खोज्न प्रोटिन पहिचान र परिमाणीकरणको लागि MaxQuant v.1.5.3.30 (56) प्रयोग गर्नुहोस्। मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटियोमिक्स डेटा डेटासेट पहिचानकर्ता PXD020402 अन्तर्गत PRIDE पार्टनर रिपोजिटरी (http://proteomecentral.proteomexchange.org) मार्फत ProteomeXchange Alliance मा जम्मा गरिएको छ।
इलेक्ट्रोस्प्रे आयनाइजेशन मास स्पेक्ट्रोमेट्रीसँग मिलेर RPLC द्वारा विश्लेषणको लागि, RC-LH1 कम्प्लेक्स जंगली-प्रकारको Rps बाट तयार पारिएको थियो। पहिले प्रकाशित विधि (16) प्रयोग गरेर, पालुस्ट्रिस कोषहरूमा उत्पादन हुने प्रोटिन सांद्रता २० mM Hepes (pH ७.८), १०० mM NaCl र ०.०३% (w/v) β- (बायो-रेड विश्लेषण) ) DDM मा २ mg ml-१ थियो। निर्माताको प्रोटोकल अनुसार, वर्षा विधिद्वारा १० μg प्रोटिन निकाल्न २D शुद्धिकरण किट (GE Healthcare, USA) प्रयोग गर्नुहोस्, र २० μl ६०% (v / v) फर्मिक एसिड (FA), २०% (v / v) एसिटोनिट्राइल र २०% (v/v) पानीमा अवक्षेपण विघटन गर्नुहोस्। RPLC (Dionex RSLC) द्वारा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (Maxis UHR-TOF, Bruker) सँग मिलेर पाँच माइक्रोलिटर विश्लेषण गरिएको थियो। ९०%(v/v) एसिटोनिट्राइल TFA मा ८५%(v/v) विलायक A [०.१%(v/v) FA र ०.०२%(V/v) जलीय घोल] देखि ८५%(v/v) विलायक B [०.१%(v/v) FA र ०.०२%(v/v) को ग्रेडियन्टको साथ ६०°C र १००μlmin -१ मा छुट्याउन MabPac १.२×१०० मिमी स्तम्भ (थर्मो फिशर साइन्टिफिक, युके) प्रयोग गर्नुहोस्। मानक इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण स्रोत र पूर्वनिर्धारित प्यारामिटरहरू ६० मिनेट भन्दा बढीको लागि प्रयोग गरेर, मास स्पेक्ट्रोमिटरले १०० देखि २७५० m/z (मास-टु-चार्ज अनुपात) प्राप्त गर्दछ। ExPASy बायोइन्फर्मेटिक्स रिसोर्स पोर्टल FindPept उपकरण (https://web.expasy.org/findpept/) को मद्दतले, कम्प्लेक्सको उपयुनिटहरूमा मास स्पेक्ट्रम नक्सा गर्नुहोस्।
कोषहरूलाई १०० मिलीलीटर NF-कम (१०μMm-२ s-१), मध्यम (३०μMm-२ s-१) वा उच्च (३००μMm-२ s-१) प्रकाशमा ७२ घण्टासम्म हुर्काइएको थियो। १०० मिलीलीटर स्क्रू-टप बोतलमा M22 मध्यम (M22 मध्यम जसमा अमोनियम सल्फेट हटाइएको छ र सोडियम सक्सिनेटलाई सोडियम एसीटेटले प्रतिस्थापन गरिएको छ) (२३)। पाँच ३०-सेकेन्ड चक्रहरूमा, कोषहरूलाई लाइस गर्न १:१ को आयतन अनुपातमा ०.१ माइक्रोन गिलास मोतीहरू मोती गरिएको थियो र ५ मिनेटको लागि बरफमा चिसो पारिएको थियो। अघुलनशील पदार्थ, अटुट कोषहरू र गिलास मोतीहरू बेन्चटप माइक्रोसेन्ट्रीफ्यूजमा १० मिनेटको लागि १६,००० RCF मा सेन्ट्रीफ्यूगेशनद्वारा हटाइएको थियो। झिल्लीलाई Ti 70.1 रोटरमा १००,००० RCF सहित २० mM tris-HCl (pH 8.0) मा ४०/१५% (w/w) सुक्रोज ग्रेडियन्टको साथ १० घण्टाको लागि अलग गरिएको थियो।
हाम्रो अघिल्लो काममा वर्णन गरिएझैं, PufW (16) मा His ट्यागको इम्युनोडेक्टेक्शन। छोटकरीमा, 2x SDS लोडिङ बफर (Merck, UK) मा RC को समान सांद्रता भएको शुद्ध कोर कम्प्लेक्स (11.8 nM) वा झिल्ली (कम गरिएको भिन्नता स्पेक्ट्रम घटाएर र दाग लागेको जेलमा भार मिलाएर अक्सिडेशनद्वारा निर्धारण गरिन्छ) दुई पटक पातलो पारिएको थियो। प्रोटीनहरूलाई प्रतिकृति 12% bis-tris NuPage जेल (थर्मो फिशर साइन्टिफिक, UK) मा अलग गरिएको थियो। RC-L सबयुनिट लोड गर्न र कल्पना गर्नको लागि Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) ले जेल दाग गरिएको थियो। दोस्रो जेलमा रहेको प्रोटीनलाई इम्युनोएसेको लागि मेथानोल-सक्रिय पोलिभिनिलिडेन फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली (थर्मो फिशर साइन्टिफिक, UK) मा स्थानान्तरण गरिएको थियो। PVDF झिल्लीलाई ५० mM tris-HCl (pH ७.६), १५० mM NaCl, ०.२% (v / v) Tween-२० र ५% (w / v) स्किम्ड मिल्क पाउडरमा ब्लक गरिएको थियो, र त्यसपछि एन्टी-हिस प्राथमिक एन्टिबडी (डिलुट द एन्टिबडी बफर [५० mM tris-HCl (pH ७.६), १५० mM NaCl र ०.०५% (v / v) Tween-२०] मा १:१००० A१९०-११४A, बेथाइल प्रयोगशालाहरू, संयुक्त राज्य अमेरिकामा) ४ घण्टाको लागि इन्क्युबेट गरिएको थियो। एन्टिबडी बफरमा ५ मिनेटसम्म ३ पटक धोएपछि, झिल्लीलाई हर्सराडिश पेरोक्सिडेज (सिग्मा-एल्ड्रिच, युके) एन्टी-माउस सेकेन्डरी एन्टिबडी (एन्टिबडी बफरमा १:१०,००० पातलो) सँग जोडिएको थियो। WESTAR ETA C 2.0 केमिल्युमिनेसेन्स सब्सट्रेट (सायनाजेन, इटाली) र अमरशाम इमेजर ६०० (GE हेल्थकेयर, युके) प्रयोग गरेर पत्ता लगाउन अनुमति दिन इन्क्युबेट गरिएको थियो (एन्टिबडी बफरमा ३ पटक धुने पछि ५ मिनेट)।
ImageJ (57) मा प्रत्येक दाग लागेको जेल वा इम्युनोएसे लेनको तीव्रता वितरण कोरेर, शिखर मुनिको क्षेत्रलाई एकीकृत गरेर र RC-L (दाग लागेको जेल) र प्रोटिन-W (इम्युनोएसे) को तीव्रता अनुपात गणना गरेर। छवि प्रशोधन गर्नुहोस्। शुद्ध RC-LH114-W नमूनामा RC-L र प्रोटिन-W को अनुपात १:१ थियो भनी मानेर र तदनुसार सम्पूर्ण डेटा सेटलाई सामान्यीकरण गरेर यी अनुपातहरूलाई मोलर अनुपातमा रूपान्तरण गरिएको थियो।
यस लेखको लागि पूरक सामग्रीहरूको लागि, कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 हेर्नुहोस्।
यो क्रिएटिभ कमन्स एट्रिब्युसन लाइसेन्सको सर्तहरू अन्तर्गत वितरित खुला पहुँच लेख हो। यो लेखले मूल कार्यलाई उचित रूपमा उद्धृत गरिएको सर्तमा कुनै पनि माध्यममा अप्रतिबन्धित प्रयोग, वितरण र पुनरुत्पादनलाई अनुमति दिन्छ।
नोट: हामी तपाईंलाई आफ्नो इमेल ठेगाना प्रदान गर्न अनुरोध गर्छौं ताकि तपाईंले पृष्ठमा सिफारिस गर्नुभएको व्यक्तिलाई थाहा होस् कि तपाईं उनीहरूले इमेल देखून् र यो स्प्याम होइन। हामी कुनै पनि इमेल ठेगानाहरू कैद गर्ने छैनौं।
यो प्रश्न तपाईं आगन्तुक हुनुहुन्छ कि हुनुहुन्न भनेर परीक्षण गर्न र स्वचालित स्पाम सबमिशन रोक्न प्रयोग गरिन्छ।
डेभिड जेके स्वेन्सबरी, पार्क कियान, फिलिप जे. ज्याक्सन, केटलिन एम. फेरिस, डारियस एम. निड्जविड्ज्की, एलिजाबेथ सी. मार्टिन, डेभिड ए. फार्मर, लोर्ना ए. मालोन, रेबेका एफ. थम्पसन, नील ए. र्‍यान्सन, डेनियल पी. क्यानिफ, मार्क जे. डिकम्यान, डेवी होल्टेन, क्रिस्टिन किर्माइर, एन्ड्रयू हिचकक, सी. नील हन्टर
प्रतिक्रिया केन्द्रमा रहेको प्रकाश जाल १ कम्प्लेक्सको उच्च-रिजोल्युसन संरचनाले क्विनोन गतिशीलतामा नयाँ अन्तर्दृष्टि प्रदान गर्दछ।
डेभिड जेके स्वेन्सबरी, पार्क कियान, फिलिप जे. ज्याक्सन, केटलिन एम. फेरिस, डारियस एम. निड्जविड्ज्की, एलिजाबेथ सी. मार्टिन, डेभिड ए. फार्मर, लोर्ना ए. मालोन, रेबेका एफ. थम्पसन, नील ए. र्‍यान्सन, डेनियल पी. क्यानिफ, मार्क जे. डिकम्यान, डेवी होल्टेन, क्रिस्टिन किर्माइर, एन्ड्रयू हिचकक, सी. नील हन्टर
प्रतिक्रिया केन्द्रमा रहेको प्रकाश जाल १ कम्प्लेक्सको उच्च-रिजोल्युसन संरचनाले क्विनोन गतिशीलतामा नयाँ अन्तर्दृष्टि प्रदान गर्दछ।
©२०२१ अमेरिकन एसोसिएशन फर द एडभान्समेन्ट अफ साइन्स। सबै अधिकार सुरक्षित। AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef र COUNTER को साझेदार हो। ScienceAdvances ISSN 2375-2548।